Kupffer细胞分离培养

小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨【摘要】目的探讨分离BALB/c小鼠肝Kupffer细胞(KC)的方法。

方法采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度离心、选择性贴壁三步法分离KC，并比较链霉蛋白酶、Ⅳ型胶原酶及联用链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶等3种不同酶消化分离方法所得KC得率及纯度。

结果 3种不同酶消化分离方法细胞得率分别为(6.32±0.5)×106 g-1，(3.66±0.4)×106g-1，(10.3±0.7)×106 g-1；细胞纯度分别为(93.2±1.7)％，(90.7±1.5)％，(94.5±1.9)％。

结论联合链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶在体灌注和离体消化是分离小鼠KC的较好方法。

【关键词】肝；枯否细胞；离心法，梯密度；小鼠，近交BABLc ；细胞分离肝Kupffer细胞（Kupffer cell，KC）为定居在肝窦内的巨噬细胞，约占全身单核巨噬细胞总数的80％～90％。

肝KC能吞噬、杀灭病原微生物，清除体内的内毒素，并具有抗原递呈、分泌细胞因子等免疫调节作用，同时影响肝细胞、贮脂细胞及内皮细胞的生物学功能[1]。

近期发现KC能诱导同种异体T淋巴细胞凋亡，在调节肝移植免疫耐受中发挥重要作用[2]。

如何获得较多数量和较高纯度的KC是研究其在机体中作用机制的首要条件。

而传统的分离方法往往因数量和纯度不足而影响实验结果。

本试验采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度、选择性贴壁三步法分离KC，探讨分离小鼠肝KC的较好方法。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1实验动物 BABL/c小鼠，雄性，10～12周龄，清洁级，由四川大学华西医学中心试验动物中心提供（许可证号：046）。

试验前禁食12 h，自由饮水，随机分为3组。

1.1.2 主要试剂和仪器Ⅳ型胶原蛋白酶、DNAaseⅠ、Percoll及HEPES （美国Sigma公司）；兔抗人溶菌酶（lysozyme，美国DAKO公司）；链霉蛋白酶E（瑞士Roche公司）；RPMI��1640培养基（美国Gibco公司）。

Kupffer 细胞Kupffer 细胞（Kupffer cells，KC）是位于肝血窦内的巨噬细胞,寄居于肝血窦内皮细胞之间或之上,是体内固定型巨噬细胞中最大的群体。

约占巨噬细胞总数的80%。

KC体积较大，呈阿米巴状，有多个膜性突起，并可通过突入内皮细胞下Disse间隙的突起与肝细胞直接接触；细胞核大而圆；胞浆丰富，内含大量核糖体和吞噬体，有发达的内质网、高尔基体和分泌型囊泡。

激活的KC变圆，去极化，细胞表面皱缩，脱颗粒，失去伪足，胞内出现许多吞噬溶酶体和透明的空泡。

一些激活的KC内还含有致密物质。

随KC激活后吞噬功能的增强，胞内还会出现一些碎片和破损的红细胞。

一、KC的表面受体和标志人类和小鼠的KC的表面受体和标志同一般单核巨噬细胞的表面标志基本一致，每一种表面受体均与其功能密切相关：1．甘露糖受体（mannose receptor）：能与微生物表面的糖蛋白或类似酵母颗粒样物结合，促进胞吞作用；2．脂多糖（LPS）/LPS结合蛋白（LPS binding protein）复合物受体（CD14）：能够与革兰氏阴性细菌表面物质LPS或与LPS结合蛋白组成的复合物相结合，在LPS的信息传递中起启动作用，与KC的激活及对细菌的清除能力有关；3．三种不同IgG的Fc受体，FcγⅠR（CD64），FcγⅡR（CD32），FcγⅢR（CD16）：在启动细胞外杀伤、调理素化和胞吞中发挥作用；4．补体受体-1（CR1，CD35），补体受体-3（CR3，C3biR，CD11b）：CR1与细胞吞噬微生物有关；CR3与LFA-1（CD11a）和CD11c 一起在细胞的粘附中发挥作用；5．其他表面分子：如CD13、CD15、CD68和VLA-4（CD29/CD49d）等；6．KC表面还带有Ia抗原，因而具有抗原呈递作用。

二、KC主要的生物学功能1．胞吞作用：由于KC所处的解剖位置，使其能够与许多经过门静脉而来的潜在有害物直接接触，如微生物、内毒素、衰老或破裂的细胞等。

大鼠肝细胞与Kupffer细胞共同培养对两者功能和形态影响（医药类）目的观察大鼠肝实质细胞和枯否细胞共培养对其体外生长、形态和功能的影响方法采用原位两步ⅳ型胶原灌注法和高密度离心法分离大鼠肝实质细胞和枯否细胞。

在体外，肝实质细胞和枯否细胞以6∶1的比例共培养。

观察不同条件下肝细胞的存活时间和形态。

培养36 h 后，每隔24 h检测上清液中白蛋白、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平，用放射免疫法检测上清液中白细胞介素1 (IL 1)、白细胞介素6 (IL 6)和肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子α)的含量。

结果分离培养组肝细胞生长增殖迅速，并向正常肝细胞进化。

肝细胞可以培养并存活15天。

共培养组肝细胞生长和增殖缓慢，可存活10天。

24、36、48和60 h时，共培养组上清液白蛋白水平低于单培养组(t = 2.551 ~ 3.139，P0.05)；24小时、36小时、48小时和60小时血清丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶水平高于单独培养组(T = 2.446 ~ 3.108，P0.05)；共培养组的枯否细胞维持il1、il6和tnfα的分泌功能，而单培养组则未检测到il1、il6和tnfα。

结论大鼠枯否细胞和肝实质细胞可以在合适的培养条件下共培养。

这两种细胞能保持良好的分泌功能，可用于实验研究。

[关键词]肝细胞；枯否细胞；共培养技术；白蛋白；细胞因子。

大鼠[摘要]目的观察生长情况。

和肝细胞功能的影响。

方法采用原位ⅳ型胶原酶两步灌注法和超临界流体低速离心法分别分离大鼠肝实质细胞(PHC)和枯否细胞。

PHC细胞和库普弗细胞按6∶1的比例进行体外共培养。

观察细胞在不同条件下的存活时间和形态。

培养上清中丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶在24小时检测一次，36小时用放射免疫法测定白细胞介素1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的浓度。

结果单独培养组肝细胞生长迅速，发育成正常肝细胞，可存活15天；对于共培养组，细胞生长和生成缓慢，存活10天。

大鼠Kupffer细胞分离、培养及永生化实现毛德文;裴燕燕;王明刚【摘要】枯否细胞(Kupffer Cells,KC)是肝脏免疫防御的第一道防线,其与多种肝脏疾病密切关联.Kupffer细胞分离纯化技术要求较高,且该细胞分化增殖能力极弱,成为开展大规模细胞实验的主要障碍.课题组简化了Kupffer细胞分离纯化步骤,构PDS152_pLenti-GFP-IRES-SV40LT表达载体,包装形成慢病毒颗粒侵染Kupffer 细胞,侵染后细胞生长速度变快,能多次传代,细胞状态稳定,巨噬细胞特异性标志F4/80呈阳性表达.将SV40LT片段导入Kupffer细胞可实现细胞永生化,且转染后的kupffer细胞仍维持巨噬细胞的功能特性.【期刊名称】《大众科技》【年(卷),期】2017(019)012【总页数】3页(P35-37)【关键词】Kupffer细胞;SV40-LT片段;永生化;特性【作者】毛德文;裴燕燕;王明刚【作者单位】广西中医药大学第一附属医院,广西南宁 530023;广西中医药大学第一附属医院,广西南宁 530023;广西中医药大学第一附属医院,广西南宁 530023【正文语种】中文【中图分类】Q2;R57枯否细胞（Kupffer cells，KC）是定植在肝脏的巨噬细胞，是肝脏非实质细胞的重要组成部分。

Kupffer细胞在肝脏固有免疫系统中发挥关键作者，是肝脏免疫防御的第一道防线。

Kupffer细胞与慢性肝炎、肝硬化及肝癌等多种肝脏疾病密切关联。

有效、快速分离Kupffer细胞，针对性开展功能与机制研究是探明不同致病因素对 Kupffer细胞影响及其与疾病相关性的基石。

但Kupffer细胞分离纯化技术要求较高，且关键在于Kupffer细胞分化增殖能力极弱，成为开展大规模细胞实验的主要障碍，课题组在实验中分离纯化了Kupffer细胞，且构建了一种永生化的细胞模型。

相关报道如下。

Wistar大鼠，SPF级，雄性，200～250g购于广西医科大学动物实验中心提供（SCXX桂2003-0001）。

肝癌中肝Kupffer细胞的作用肝癌是一种对人类健康构成严重威胁的肿瘤疾病，因其发展快速且难以治愈，常常被称为“癌症之王”。

肝Kupffer细胞是肝脏中最常见的巨噬细胞，它们在肝癌发展中扮演着重要的作用。

本文将介绍肝Kupffer细胞的作用和相关的治疗手段，分析它们在肝癌治愈中的潜力。

一、Kupffer细胞的基本概述Kupffer细胞主要位于肝脏内窦壁和肝淋巴组织中，它们是一种主动的、有吞噬作用的巨噬细胞，具有清除体内病原体和异物等功能。

Kupffer细胞能够通过吞噬和分解血液中过多的细胞碎片和垃圾，在清除体内有害物质方面发挥了重要作用。

二、Kupffer细胞在肝癌中扮演的角色在肝癌发展过程中，Kupffer细胞可以发挥重要的抗癌作用。

Kupffer细胞能够分泌多种细胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6等，这些细胞因子能够刺激免疫细胞的活性，从而发挥抗肿瘤的作用。

Kupffer细胞还能够通过与其他免疫细胞的相互作用，控制肝癌的发展。

在肝癌诱导期间，它们可以产生多种因子分子如MIP-2、CCL5和MCP-1，吸引其他免疫细胞的积极参与阻止肝癌细胞的扩散和增殖。

Kupffer细胞还可以识别并攻击病毒性感染细胞。

研究发现，在病毒感染的肝脏中，Kupffer细胞的数量会增加，从而带动免疫系统，抵抗病毒侵袭，从而降低肝癌几率。

三、Kupffer细胞和肝癌治疗针对Kupffer细胞在肝癌中重要的作用，人们发展了一系列利用Kupffer细胞治疗肝癌的策略。

比如，研究人员在实验室中体外培养Kupffer细胞，并注射到肝癌患者体内，发现能够明显地抑制肝癌的增殖和扩散。

此外，人们还尝试了利用Kupffer细胞作为细胞靶向治疗肝癌的手段。

例如，在人工实验中，研究人员成功制造了一种能够特异性地将Kupffer细胞标记的诊断靶向药物，可以提高治疗的精确性和效果，从而取得经济与社会效益的双重提升。

虽然Kupffer细胞在肝癌治疗中有重要作用，但考虑到Kupffer细胞的数量少、质量不足，尚不成熟的科技难度等问题，Kupffer细胞在治愈肝癌中的现实应用还需要进一步探究，异步协同才能达到最佳肝癌治疗效果。

一种改良大鼠肝脏Kupffer细胞分离方法张哲;赵曙光;倪阵;刘震雄;唐华;李慧艳;闻勤生【摘要】目的观察改良大鼠肝脏Kupffer细胞 (KCs) 分离方法获取KCs的效果.方法参照Akira提供的方法进行以下改进:① 前灌注液在体灌注,Ⅳ型胶原酶离体灌注消化;② Percoll分离液不连续密度梯度离心;③台盼蓝染色检测分离细胞的活度;④选择性贴壁法纯化获取的细胞;⑤ 吞墨实验、DAB染色及CD163细胞免疫荧光法鉴定所分选细胞.结果肝脏KCs的获得量为(3±1.5)×105/g鼠肝,细胞活度＞92%;光镜下细胞呈圆形,培养24 h后呈梭形或多角形;具有较强的吞噬能力,DAB染色呈"煎蛋"样,荧光显微镜下＞99%为KCs.结论改良的大鼠肝脏KCs分离方法较Akira法能够获取更高纯度的KCs,简捷经济,值得推广.%Objective To observe the isolation effect of kupffer cells (KCs) by an improved isolation method of KCs from a single rat liver. Methods The isolation method was based on Akira' s method with some improvements as followed : ① After primarily perfused in vivo, the liver was perfused with collagens type Ⅳ and digested in vitro; ② Discontinuous density gradient centrifugation in Percoll was used; ③ The viability of isolated cells were determined by trypan blue staining; ④ The purification of isolated cells by selective cell adherence; ⑤ Phagocytosis test , DAB dyeing and CD163 immunofluorescence staining were used to identified isolated KCs. Results The number of acquired cells was (3 ±1.5) x 105 per gram rat liver, and the viability of cells was more than 92%. The morphology of cells was roundness, and became spindle or polygonal after 24 h cultured. The cell had strong phagotrophic ability, and appeared "fried eggs" by DAB dyeing.More than 99% cells were identified as KCs by immunofluorescence staining. ConclusionrnThe improved isolation method of KCs is more productive of high purity of KCs, it is simple and economic.【期刊名称】《胃肠病学和肝病学杂志》【年(卷),期】2012(021)011【总页数】5页(P1060-1064)【关键词】Kupffer细胞;细胞分离;原代培养;细胞鉴定【作者】张哲;赵曙光;倪阵;刘震雄;唐华;李慧艳;闻勤生【作者单位】第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038;第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038;第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038;第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038;第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038;第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038;第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038【正文语种】中文【中图分类】R575.5肝脏细胞包括实质细胞和非实质细胞，非实质细胞约占肝脏细胞总数的10%，其中肝脏巨噬细胞(kupffer cells，KCs)的比例约为33%。

kupffer细胞培养注意事项1. 注重无菌操作：在进行kupffer细胞的培养过程中，保持实验环境的无菌状态是非常重要的。

使用无菌操作技术，如穿戴无菌手套、操作在无菌工作台下进行，以避免细菌和真菌的污染。

2. 选择合适的培养基和补充物：选择适合kupffer细胞生长的培养基，并根据实验需求添加适当的补充物，如生长因子、血清等。

培养基和补充物的选择将直接影响到细胞的生长和功能。

3. 细胞的处理和传代：处理kupffer细胞时，要避免对细胞造成过度机械和化学刺激，以免影响细胞的功能。

同时，在进行传代时，注意细胞的浓度和细胞悬液的稀释比例，以确保细胞的正常生长和传代效果。

4. 适当的温度和湿度：细胞培养的温度和湿度对细胞的生长和代谢具有重要影响。

维持适当的培养温度（一般为37°C）和湿度（通过培养皿内添加适量的水）有助于提高细胞的生存率和生长速度。

5. 注意培养皿的处理：培养皿的表面应保持洁净，避免污染细胞培养。

在进行细胞移植或处理时，避免过度摇动或振动培养皿，以减少细胞的机械损伤和静电影响。

6. 定期检测细胞污染：在培养过程中定期检测细胞的纯度和污染情况，避免细菌、真菌或其他污染物的存在。

使用合适的方法如细胞培养物中添加抗生素等，以确保细胞培养的质量和纯度。

7. 注意培养液的更换和配制：定期更换培养液，并遵循合适的配制方法和储存条件。

避免使用过期的培养液和补充物，以免影响细胞培养。

8. 增加培养时间的控制：根据实验需要，控制kupffer细胞的培养时间。

过长的培养时间可能会引起细胞的老化或功能的改变，因此及时收取和处理细胞培养物是重要的。

9. 严格遵守实验守则：在进行任何实验操作之前，首先熟悉并遵守实验守则和操作规程。

不得盲目进行实验操作，保证自己和他人的安全。

注意：本回答仅供参考，具体操作应根据实验室和研究要求进行，并按照相应实验守则和机构的规定进行操作。

第４ｌ卷第２期２０１０年４月解剖学报ＡＣＴＡＡＮＡＴＯＭＩＣＡＳＩＮＩＣＡＶ０１．４１，Ｎｏ．２Ａｐｒ．２０１０‘３３１。

库普弗细胞的研究进展张强伟１’２徐存拴１’２。

（１．河南师范大学生命科学学院；２．河南省－科技部共建细胞分化调控国家重点实验室培育基地，河南新乡４５３００７）［摘要］库普弗细胞（ＫＣｓ）是肝脏的非实质细胞。

具有分泌细胞因子及吞噬、免疫等功能，亦与多种肝脏疾病，如肝损伤、肝纤维化、肝硬化等密切相关。

本文简要总结了近几年有关库普弗细胞的生理功能及与肝病关系等方面的研究进展。

［关键词】库普弗细胞；细胞因子［中图分类号】Ｑ２８［文献标志码］Ａ［ＤＯＩ］１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５２９—１３５６．２０１０．０２．０３５ＲｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎＫｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌｓＺＨＡＮＧＱｉａｎｇ．ｗｅｉ。

・２．ＸＵＣｕｒｔ．ｓｈｕａｎｌｆ２。

（Ｊ．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｅ如ｔｗｅ，胁’ｉｌａｒｔＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；２．研ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＣｅｌｌＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ，肌’ｌｌａｌｌＸｉｎｘｉａｎｇ４５３００７，Ｃｈｉｎａ）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｋｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌｉｓａｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅｌｉｖｅｒｎｏｎｐａｒｅｎｅｈｙｍａｌｃｅｌｌｓ，ｉｔｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓｉｎａｖａｒｉｅｔｙｏｆｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｔｈｒｏｕｇｈｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，ｓｅｃｒｅｔｉｎｇｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ａｎｔｉｇｅｎ—ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓ，ａｎｄｉｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏａｖａｒｉｅｔｙｏｆｄｉｓｅａｓｅｓｓｕｃｈａｓｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒ，ｌｉｖｅｒｆｉｂｒｏｓｉｓ，ｌｉｖｅｒｉｎｊｕｒｙ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｐｒｅｓｅｎｔｓｔｈｅｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｋｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｉｏｎｓｗｉｔｈｌｉｖｅｒ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ＬｉｖｅｒＫｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌ；Ｃｙｔｏｋｉｎｅ自１８７６年发现库普弗细胞（ｋｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌｓ，ＫＣｓ）以来，至今已有１３０多年。

1、小鼠肝脏Kupffer 细胞分离、纯化参照Tetsuya Abe等的方法并加以改进。

腹腔注射2%戊巴比妥钠（40mg/kg），沿腹部正中做一约2cm 的切口，完全暴露门静脉，经门静脉置入18G 套管针，置入位置约距离肝门1cm，插入约0.8cm，4-0 丝线固定后，立即剪开下腔静脉，用无钙灌注液进行灌注，灌注速度约为10ml/min,同时剪开上腔静脉，灌注过程见图 1.1、图1.2。

灌注5min，共灌注无钙灌注液50ml/只，灌注后肝脏体积膨大、颜色变浅，解剖剪分离取下肝脏，去除结缔组织及胆囊，在75%的酒精里漂洗5s，然后用PBS 漂洗三次，以防污染。

放到盛有PBS 的50ml 无菌瓶中，每批细胞需要灌注3-5 只小鼠。

待所有小鼠肝脏灌注好之后，一起放到细胞培养皿中，用眼科剪剪碎，加入0.1% 四型胶原酶，每只约需5ml，放至37℃CO2培养箱，消化一小时，摇匀一次/15 min，并用移液枪轻轻吹打1min。

待组织块消化完全，细胞基本散落形成细胞悬液后，过350 目滤网2 次，以去除未消化的组织块和结缔组织。

用15ml 离心管收集细胞悬液，300 rpm×3 min，离心两次，收集上清，可以去除大部分的小鼠肝脏细胞。

然后，1500 rpm×5 min，弃上清，收集沉淀，用含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640 培养基悬浮细胞沉淀。

Percoll不连续密度梯度离心，2000g×20min，4℃；各层为上：细胞悬液2ml，中：25%Percoll 3ml，下：50%Percoll 3ml（用15ml 离心管，2-3 管/只）。

先将50%的Percoll液3ml 置于离心管底部，再沿着离心管管壁缓慢加入25%Percoll3ml在50%Percoll 液上面，最后沿着管壁缓慢加入细胞悬液2ml 于最上层，见图1.3 。

离心后可见四层区带：最上一层为细胞碎片；第二层为富含肝窦内皮细胞的区带；第三层为富含Kupffer 细胞的区带；第四层为积于管底的沉淀，主要是红细胞，见图1.4 。

2018Vol.19No.4肝脏是人体重要的代谢器官，其中肝脏非实质细胞包括Kupffer 细胞（Kupffer cells ，KCs ）、肝血窦内皮细胞及肝星状细胞等，且KCs 在机体免疫调节及炎症反应等方面发挥着重要作用[1]。

因此，有效地原代分离出活性较强的KCs ，维持细胞的基本功能和活性，较好地模拟细胞在体时的环境，可对不同动物模型进行细胞学研究以及外源性物质在体代谢和毒性评价。

本实验参考国内外相关文献，利用不同细胞的密度差异，优化、改良出一种简便可行、经济有效，可以分离并培养SD 大鼠KCs 的方法。

1材料与方法1.1实验材料1.1.1实验动物雄性SPF 级8w 龄SpragueDawley （SD ）大鼠，体质量约（250±10）g ，购于北京维通利华实验动物技术有限公司［许可证号：SCXK （京）2016-0006］。

基础饲料喂养，自由进食及饮水。

实验前12h 禁食，不禁水。

1.1.2主要试剂水合氯醛（成都市科龙化工试剂厂，批号2013101801）；肝素钠注射液（常生千红生化制药股份有限公司，批号：160405）；D-hanks （北京索莱宝有限公司，批号：20170206）；Hanks （北京索莱宝有限公司，批号：20170623）；胶原酶Ⅳ（北京索莱宝有限公司，批号：601H132）；RPMI Medium 1640（北京索莱宝有限公司，批号：20171030）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批号：20170124）；PBS 缓冲液（武汉博士德生物工程有限公司，批号：11D16B30）；Percoll （北京索莱宝有限公司，批号：1208D0432）；封闭用正常山羊血清原液（北京索莱宝有限公司，批号：20171023）；4%多聚甲醛（北京博奥拓达科技有限公司，批号：170512）；兔抗CD163（北京博奥森生物技术有限公司，批号：AG07056442S ）；兔抗CD68（北京博奥［基金项目］国家自然科学基金项目（81470190）；山西省卫生厅科研课题项目（201301100）；山西省教育厅研究生教育创新项目（2018SY096）；山西中医药大学肝脏炎性疾病中西医结合基础研究创新团队资助项目（2018MSTD06）［作者简介］张冉冉，在读硕士，E-mail ：zhangranran516@ ［通讯作者］苗宇船，教授，博士，E-mail ：mych65@大鼠Kupffer 细胞分离方法的优化张冉冉，刘杨，关伟，陈浩，徐慧超，李若瑜，苗宇船（山西中医药大学，山西晋中030619）摘要目的：对大鼠Kupffer 细胞分离方法进行优化。

大鼠肝细胞与kupffer 细胞的分离与鉴定李婉雁1，2，相雪莲1，2，曹楠1，2，陈文斌1，2，潘建秋1，2，江丹莉1，2，田允波1，2，黄运茂1，2，许丹宁1，2*（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广东广州510225；2.广东省水禽健康养殖重点实验室，广东广州510225）摘要：本研究旨在建立一种简单有效的分离大鼠肝细胞和kupffer 细胞的方法。

大鼠体外肝脏灌流，采用percoll 密度梯度分离法分离肝细胞与kupffer 细胞，糖原染色鉴定肝细胞，墨汁吞噬实验鉴定kupffer 细胞。

结果表明，此方法分离的肝细胞和kupffer 细胞活性都在95%以上，新分离的肝细胞鹅卵石样，贴壁能力不是特别强，24h 可分化出不同形态。

Kupffer 细胞具有较强的吞噬能力和贴壁能力，可看到墨汁被细胞吞噬。

结论：本实验建立的分离培养方法较稳定，为开展肝细胞和kuffer 细胞的相关研究提供方法依据，也为建立各种体外细胞分离培养方法提供借鉴。

关键词：大鼠；肝细胞；kupffer 细胞；分离；鉴定中图分类号：Q343.6文献标识码：B文章编码：1005⁃8567（2021）02⁃0046⁃04收稿日期：2021⁃03⁃16基金项目：广东省基础与应用基础研究基金项目区域联合基金⁃青年基金项目（2019A1515110106）作者简介：李婉雁（1988⁃），女，广东广州人，讲师，博士。

*通讯作者：许丹宁，E⁃mail ：*****************肝脏是机体最大的代谢器官，在机体的生命活动中扮演着相当重要角色，很多疾病的防治和肝脏的代谢息息相关［1］。

作为体外培养的一种原代细胞，肝细胞具有很强的活性和高代谢能力，在研究肝脏的代谢机制以及药物对肝脏的作用机制方面具有十分重要的作用，为研究药物代谢、开发新药物的研究提供了一个有效平台。

因此，建立有效稳定的分离和培养原代肝细胞方法，将为开展肝脏功能相关研究提供有力的方法支持［2，3］。

肝脏组织样品分离细胞的方法1.肝细胞的分离和培养分离方法：1. 肝组织展液的制备将肝组织放在前灌流液(含EDTA0.019％，pH 7．4，一定浓度的抗菌素)中带回实验室，剪去外露明显的血管和胆管组织。

前灌流液(预先在37℃水浴箱中浴热)用BRAUNULE穿刺针从管腔残端灌入，约3—5次，每次20 m1，尽量冲净肝组织中残存的血细胞，见肝组织呈谈红色或淡黄色，后用0．05％的胶原酶IV型水溶液15m1—20 m1，缓慢灌入3—4次，每次约5min—8min，胶原酶IV型可以重复使用，每次使用前均应在37℃水浴箱中浴热以保持酶活力。

待肝组织韧性消失，压迫不易恢复，肝包膜下有时呈粒状时，放入平皿中、用眼科镊剪去除被膜及肝组织内肉眼可见的管道系统，然后连同灌注流出的胶原配溶液放入锥形瓶中，在37℃水浴箱中振荡消化10min。

用培养液终止反应制成混合肝细胞悬液。

2. 分离培养肝细胞取混合肝细胞悬液用200目尼龙布过滤，50×g离心3min。

留下上清液作分离肝窦状间隙的内皮细胞用。

用1640培养液反复离心3次，每次50×g离心3min，以清洗残存的胶原酶和纯化肝细胞，在显微镜下观察肝细胞形态及纯化状态；用0.4％锥兰染色判断细胞活率，血细胞计数板计数细胞浓度。

以1640合成培养基(含10％AB型人血清)细胞混悬液稀释至2×l0E5／m1后分别接种在培养瓶和六孔培养板上。

在37℃、5％CO2条件下先培养l 8h—20 h，换液去除残存血细胞，再用同样培养基培养7d一10d。

2.间质细胞的分离和培养a.肝寨间隙内皮细胞分离、培养：取分离肝细胞后的上清液，用50×g离心3min和500×g离心5min交替离心3—5次，去除残存的肝细胞，同时用1640培养液清洗残存的胶原酶。

分出的细胞主要为肝内皮细胞和枯否氏细施的混合悬液。

用0.4％锥兰染色判断细胞活率后，接种在培养瓶中。

大鼠移植肝内Kupffer细胞分离及对T细胞增殖的抑制效应刘骅;曹晖;吴志勇【期刊名称】《外科理论与实践》【年(卷),期】2007(12)5【摘要】目的:建立分离、纯化和培养大鼠肝脏Kupffer细胞(KC)的方法,并观察KC对同种反应性T细胞增殖的影响。

方法:采用在体原位肝脏灌注结合密度梯度离心技术,进行肝移植受体大鼠肝脏KC分离、纯化和培养。

在体外实验中进一步观察KC在MLR(混合淋巴细胞反应)体系中对同种反应性T细胞增殖程度的影响。

结果:KC得率为(1.1±0.2)×107/肝,平均存活率为(93.5±1.8)%,纯度≥90%,ED-2(+)。

培养24h可见大量细胞伸展生长,呈现典型的星形或多边形。

在MLR体系中加入未经辐照的KC后,反映T细胞增殖程度的每分钟脉冲数值明显降低,且接受联合免疫治疗并长期存活的D、E两组所获得的KC对T细胞增殖有着更为明显的抑制作用。

结论:本实验成功建立了分离、纯化和培养大鼠KC的方法。

KC对同种反应性T细胞增殖具有抑制作用,尤其从接受联合免疫治疗后长期存活受体大鼠所获得的KC抑制作用更为明显。

【总页数】4页(P439-442)【关键词】肝移植;枯否细胞;T淋巴细胞,抑制效应;大鼠【作者】刘骅;曹晖;吴志勇【作者单位】上海交通大学医学院附属仁济医院普外科【正文语种】中文【中图分类】R333.4【相关文献】1.分离、鉴定与培养大鼠肝细胞、肝星状细胞和Kupffer细胞 [J], 蔡伟祥;方建凤;庄伟;李玉梅;2.大鼠肝贮脂细胞Kupffer细胞的分离,培养和鉴定 [J], 高春芳;孔宪涛3.分离、鉴定与培养大鼠肝细胞、肝星状细胞和Kupffer细胞 [J], 蔡伟祥;方建凤;庄伟;李玉梅4.大鼠肝贮脂细胞及Kupffer细胞的分离培养和鉴定 [J], 高春芳;孔宪涛5.Kupffer细胞Fas配体的表达及其对移植肝内淋巴细胞的杀伤作用 [J], 涂兵;梁绍勇;陈勇;龙飞伍;彭勇;刘作金;徐明清;严律南;龚建平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

第30卷第1期2010年1月国际病理科学与临床杂志 htt p://www .gjbl .netI nternati onal Journal of Pathol ogy and ClinicalMedicineVol .30　No .1Jan .　2010收稿日期:2009-10-09 修回日期:2010-01-23作者简介:赵秀华,硕士研究生,主要从事成体干细胞的研究。

通讯作者:程腊梅,E 2mail:chenglamei2000@yahoo .com基金项目:国家重点基础研究发展计划项目(2007CB947900);湖南省自然科学基金重点项目(08JJ3075)。

The work was supported byNati onal Key Basic Research and Devel opment Pr ojects (2007CB947900)and Key Pr ojects of Natural Science Foundati on of Hunan Pr ovince,P .R.China (08JJ3075).・Arti cles ・・论　著・小鼠肝脏窦状内皮细胞分离和培养的一种新方法赵秀华,罗彬,罗盘,程腊梅(中南大学生殖与干细胞工程研究所,长沙410078)[摘要]　目的:建立小鼠肝窦状内皮细胞(liver sinus oidal endothelial cells,LSEC )的分离培养方法,研究其生物学特性。

方法:中性蛋白酶消化小鼠肝脏组织,Percoll 密度梯度离心分离消化后的细胞悬液,用内皮细胞筛选培养基及酶差异消化法纯化LSEC;免疫细胞化学染色检测LSEC 的表面标志,分析LSEC 的超微结构,观察D iI 荧光标记的乙酰低密度脂蛋白(acetylated 2l ow density li pop r otein,D iI 2Ac 2LDL )摄取能力,以体外成血管能力分析LSEC 的功能。

小鼠肝Kupffer细胞小鼠肝Kupffer细胞产品说明：为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。

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小鼠肝Kupffer细胞产品简介：产品名称：小鼠肝 Kupffer 细胞（Mouse Hepatic Kupffer Cells）组织来源：小鼠肝组织产品规格：5×105cells/25cm2 培养瓶小鼠肝Kupffer细胞细胞简介：小鼠肝 Kupffer 细胞分离自小鼠肝脏组织，细胞呈圆形或多角形。

Kupffer 细胞是位于肝窦内表面的吞噬细胞，能够清除血液中的外来抗原、抗原－抗体复合物和细胞碎片等物质。

Kupffer 细胞是全身单核-吞噬细胞系统的重要组成部分，也是肝脏防御系统主要成员，在全身和肝脏疾病发生发展中起到重要作用。

一种小鼠滑膜细胞的分离及培养方法小鼠滑膜细胞的分离及培养方法是研究小鼠滑膜细胞功能和生物学特性的重要步骤。

在本方法中，我们将展示一种经典的小鼠滑膜细胞分离和培养方法，旨在为研究者提供操作指南。

首先，我们需要准备所需材料和试剂，包括小鼠、PBS（磷酸盐缓冲液）、酶消化液（例如，胰酶和胰蛋白酶）、培养基（例如，DMEM/F12）和培养皿。

1. 小鼠的选择和准备:选择适龄、健康的小鼠，注意其性别和品系。

提前准备好所需的操作平台和相关仪器。

2. 小鼠滑膜细胞的分离:将小鼠以适当的方式进行麻醉和消毒。

在细菌培养箱中，通过剖腹取出小鼠的关节滑膜组织，尽量保持其完整性，并将其置于含有PBS的培养皿中。

3. 组织消化:将滑膜组织切碎并置于含有胰酶和胰蛋白酶的酶消化液中，在37°C的恒温振荡器中进行消化。

消化时间和酶的浓度应根据滑膜样本的大小和类型进行调整，通常需要2-4小时的消化时间。

4. 细胞分离:经过消化的滑膜组织将被过滤，以除去组织残渣和大颗粒物。

将过滤液收集到离心管中，进行离心，去除上清液。

沉淀的细胞可以通过重新悬浮和离心的方法进行重复洗涤，以进一步净化细胞。

5. 细胞培养:将净化后的小鼠滑膜细胞重新悬浮于预先准备好的培养基（例如DMEM/F12），添加适量的血清和生长因子。

将细胞转移至培养皿中，并放置在37°C的恒温培养箱中进行培养。

通过定期观察和更换培养基，维持适当的温度和湿度，小鼠滑膜细胞将逐渐形成单层，并开始增殖和扩增。

总结起来，这种小鼠滑膜细胞的分离及培养方法提供了一种简单有效的操作指南，可用于研究小鼠滑膜细胞的功能和特性。

它为进一步探究滑膜相关疾病的发生机制以及治疗方法的开发提供了基础。