β-胡萝卜素高产菌株的选育

湖北农业科学2014年

收稿日期院圆园员源原园员原员园基金项目院教育部圆园员圆大学生创新创业训练计划项目渊圆园员圆员园缘园园园圆怨冤曰湖北工业大学博士启动基金项目渊月杂阅匝员圆园源缘冤作者简介院左乐渊员怨怨园原冤袁男袁山西大同人袁本科生袁研究方向为生物工程袁渊电话冤员猿圆远园远园园怨猿愿渊电子信箱冤圆缘圆猿缘苑圆缘苑员岳择择援糟燥皂曰通讯作者袁王常高渊员怨苑员原冤袁男袁湖北监利人袁副教授袁博士袁主要从事微生物代谢产物发酵及分离纯化研究袁渊电话冤员缘猿猿苑员猿苑员园远渊电子信箱冤憎糟早苑员源员缘岳员远猿援糟燥皂遥茁原胡萝卜素是联合国粮农组织和世界卫生组织一致认定的粤类营养色素袁是人体内维生素粤的重要来源袁且具有良好的抗氧化尧抗肿瘤尧抗衰老尧增强免疫等功能袁在医药尧食品着色及营养强化尧日用化妆品及饲料添加剂等领域具有广阔的应用前景咱员暂遥目前袁市场上的茁原胡萝卜素产品主要有化学合成品和天然产品两种类型遥天然茁原胡萝卜素因其功能性强尧安全性好及生物利用度高等优点而日益受到人们的青睐遥发酵法是目前生产天然茁原胡萝卜素的主要途径遥在可合成茁原胡萝卜素的微生物中袁菌种三孢布拉氏霉无论是生物量渊缘园早干菌体辕蕴冤袁还是菌体细胞中茁原胡萝卜素的含量渊可达菌体干重的员豫耀缘豫冤都是较理想的袁已成为目前国内外研究和生产天然茁原胡萝卜素的主要菌种咱圆暂遥在前期发酵条件优化的基础上咱猿暂袁本研究通过各种理化因子对生产菌株三孢布拉氏霉的负菌进行诱变选育袁以期进一步提高茁原胡萝卜素的发酵产量遥员材料与方法员援员菌种三孢布拉氏霉正菌渊月造葬噪藻泽造藻葬贼则蚤泽责燥则葬垣冤尧三孢布拉氏霉负菌从中国典型培养物保藏中心购买遥员援圆培养基孕阅粤培养基院新鲜马铃薯圆园园早尧葡萄糖圆园早尧琼脂圆园早尧自来水员园园园皂蕴遥平板初筛培养基院含有园援猿豫脱氧胆酸钠渊杂阅悦冤的孕阅粤遥三角瓶复筛培养基院源豫玉米粉尧圆豫大豆粉尧员豫麸皮浸出液尧园援员豫运匀圆孕韵源尧园援园缘豫酝早杂韵源尧园援园员豫维生素月员尧员豫植物油袁责匀苑援园遥员援猿孢子悬浮液制备将活化的三孢布拉氏霉负菌接种至孕阅粤平板培养基上袁圆远益培养缘凿袁每个平板加入圆园皂蕴无菌水袁用接种环轻轻刮洗下表面的孢子袁将孢子悬浮液合并转入装有玻璃珠的无菌三角瓶中袁振荡将孢茁原胡萝卜素高产菌株的选育左乐袁余茜炜袁向梦雄袁蔡俊袁王常高渊湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室/工业发酵湖北省协同创新中心/生物工程学院袁武汉源猿园园远愿冤摘要院采用紫外线和硫酸二乙酯对三孢布拉氏霉渊月造葬噪藻泽造藻葬贼则蚤泽责燥则葬冤负菌进行了圆次诱变处理袁通过平板初筛和三角瓶摇瓶复筛袁得到了一株突变菌株哉原阅原圆袁其茁原胡萝卜素产量渊员圆猿远皂早辕蕴冤较原始菌株渊远猿缘皂早辕蕴冤提高了怨源援远豫遥遗传稳定性试验结果表明袁该突变菌株具有较好的遗传稳定性遥关键词院茁原胡萝卜素曰三孢布拉氏霉渊月造葬噪藻泽造藻葬贼则蚤泽责燥则葬冤曰菌株选育中图分类号院匝怨猿怨援怨苑文献标识码院粤文章编号院0439原愿114渊圆园14冤17原4148-03月则藻藻凿蚤灶早杂贼则葬蚤灶憎蚤贼澡匀蚤早澡茁原糟葬则燥贼藻灶藻孕则燥凿怎糟贼蚤on在哉韵蕴藻袁再哉载蚤原憎藻蚤袁载陨粤晕郧酝藻灶早原曾蚤燥灶早袁悦粤陨允怎灶袁宰粤晕郧悦澡葬灶早原早葬燥渊运藻赠蕴葬遭燥则葬贼燥则赠燥枣云藻则皂藻灶贼葬贼蚤燥灶耘灶早蚤灶藻藻则蚤灶早袁酝蚤灶蚤泽贼则赠燥枣耘凿怎糟葬贼蚤燥灶辕匀怎遭藻蚤孕则燥增蚤灶糟蚤葬造悦燥燥责藻则葬贼蚤增藻陨灶灶燥增葬贼蚤燥灶悦藻灶贼藻则燥枣陨灶凿怎泽贼则蚤葬造云藻则皂藻灶贼葬贼蚤燥灶辕杂糟澡燥燥造燥枣月蚤燥造燥早蚤糟葬造耘灶早蚤灶藻藻则蚤灶早袁匀怎遭藻蚤哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠燥枣栽藻糟澡灶燥造燥早赠袁宰怎澡葬灶源猿园园远愿袁悦澡蚤灶葬冤粤遭泽贼则葬糟贼院月造葬噪藻泽造藻葬贼则蚤泽责燥则葬袁皂葬贼蚤灶早贼赠责藻渊原冤袁憎葬泽皂怎贼葬贼藻凿遭赠怎贼则葬增蚤燥造藻贼渊哉灾冤葬灶凿凿蚤藻贼澡赠造枣怎造枣葬贼藻渊阅耘杂冤twice援One皂怎贼葬灶贼哉原阅原圆憎葬泽燥遭贼葬蚤灶藻凿遭赠责造葬贼藻泽糟则藻藻灶蚤灶早枣蚤则泽贼葬灶凿泽澡葬噪藻枣造葬泽噪泽糟则藻藻灶蚤灶早泽藻糟燥灶凿援陨贼泽赠蚤藻造凿燥枣茁原糟葬则燥贼藻灶藻渊员圆猿远皂早辕蕴冤怨源援远豫wasmore贼澡葬灶thatof贼澡藻燥则蚤早灶葬造贼则葬蚤灶渊远猿缘皂早辕蕴冤援栽澡藻贼藻泽贼of早藻灶藻贼蚤糟泽贼葬遭蚤造蚤贼赠蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿贼澡藻早藻灶藻贼蚤糟泽贼葬遭蚤造蚤贼赠of皂怎贼葬灶贼wasgood援运藻赠憎燥则凿泽院茁原糟葬则燥贼藻灶藻曰月造葬噪藻泽造藻葬贼则蚤泽责燥则葬曰遭则藻藻凿蚤灶早第53卷第17期圆园14年9月湖北农业科学匀ubei粤gricultural杂ciences灾燥造援53No.17Sep援袁圆园14.com.cn. All Rights Reserved.第17期

表2三孢布拉氏霉负菌紫外线诱变复筛结果菌株编号原始菌株U-1U-2U-3U-4U-5茁-胡萝卜素产量//mg/L642686785852894650子打散形成单孢子悬浮液遥员援源孢子诱变处理将制备的单孢子悬浮液分别用不同剂量的紫外线渊哉灾冤或硫酸二乙酯渊阅耘杂冤进行处理袁之后将孢子悬液涂布于平板上进行培养遥员援缘突变菌株平板初筛将经过诱变处理后的孢子悬浮液涂布在含有园援猿豫杂阅悦的孕阅粤平板培养基上袁圆远益培养猿耀缘凿袁经过多次诱变处理袁根据三孢布拉氏霉负菌菌落颜色深浅及孢子生长数量从平板上挑选了缘株比较理想的突变菌株袁以供复筛遥员援远突变菌株三角瓶摇瓶复筛将从初筛平板上挑选的菌株接种至三角瓶复筛培养基中袁同时接入三孢布拉氏霉正菌袁圆远益尧员愿园则辕皂蚤灶培养缘凿袁测定其茁原胡萝卜素的产量遥员援苑茁原胡萝卜素产量的测定将每瓶培养好的菌丝分别用双层纱布过滤袁自来水冲洗菌丝至滤过液无色袁挤干菌丝水分后置于真空干燥箱中缘园益干燥圆园澡袁称取干菌丝体的重量袁计算生物量遥将干菌丝体碾碎袁称取适量干菌体粉末袁加入远园耀怨园益沸程的石油醚浸泡至菌粉呈白色袁测定浸出液在波长源缘园灶皂下的吸光度袁根据标准曲线计算出干菌体中茁原胡萝卜素的含量袁再算出茁原胡萝卜素的产量遥圆结果与分析圆援员茁原胡萝卜素标准曲线精确称取茁原胡萝卜素标准品袁用远园耀怨园益沸程的石油醚溶解并稀释成不同浓度袁分别测定其在波长源缘园灶皂下的吸光度遥以茁原胡萝卜素浓度为横坐标袁吸光度为纵坐标绘制标准曲线袁结果见图员遥圆援圆紫外线诱变致死曲线保持紫外灯功率和照射距离不变袁控制不同的时间照射三孢布拉氏霉负菌单孢子悬浮液袁以照射时间为横坐标袁孢子致死率为纵坐标绘制致死曲线袁结果见图圆遥随着照射时间的延长袁三孢布拉氏霉负菌单孢子致死率逐渐升高遥一般认为致死率在苑缘豫左右时诱变效果较好袁但三孢布拉氏霉在任何生长阶段都是多核体袁且茁原胡萝卜素高产突变属于隐形突变袁因此必须采用高剂量诱变处理袁使孢子形成生理上的单核体袁才有可能得到稳定的高产突变菌株咱源暂袁故后面的诱变处理采用员园皂蚤灶照射遥圆援猿紫外线诱变平板初筛经过多次诱变处理袁根据三孢布拉氏霉负菌菌落颜色深浅及孢子生长数量从平板上挑选出了缘株比较理想的突变菌株渊表1冤袁以供复筛遥圆援源紫外线诱变三角瓶复筛从表圆可以看出袁初筛得到的突变菌株哉原源的茁原胡萝卜素产量最高袁为愿怨源皂早辕蕴袁比原始菌株的产量提高了猿怨援猿豫袁同时在平板上生长的孢子也比较丰富袁所以选择突变菌株哉原源作为进一步诱变的菌株遥突变菌株哉原缘在平板上颜色很深袁基本上呈红色袁其茁原胡萝卜素产量与原始菌株相当袁说明其表1三孢布拉氏霉负菌紫外线诱变初筛结果菌株编号原始菌株U-1U-2U-3U-4U-5菌落颜色黄色深黄色深黄色橙黄色橙红色红色孢子数量++++++++++++++注院野+冶表示孢子数量遥下同遥图员茁原胡萝卜素标准曲线0.450.400.350.300.250.200.150.100.050.000.00.20.40.60.81.01.21.41.6标准品浓度//滋g/mLy=0.2644x+0.0057R2=0.9992图圆三孢布拉氏霉负菌单孢子悬浮液紫外线诱变致死曲线10090807060504030201000246810照射时间//min左乐等院茁原胡萝卜素高产菌株的选育4149.com.cn. All Rights Reserved.湖北农业科学2014年

渊责任编辑赵娟冤菌落颜色可能是一些其他的色素类物质遥圆援缘硫酸二乙酯诱变致死曲线在员园皂蕴菌株哉原源的孢子悬浮液中加入不同量的阅耘杂袁以配成不同浓度的阅耘杂袁充分振荡使阅耘杂分散均匀袁猿园益振荡处理圆澡后袁加入缘皂蕴圆缘豫晕葬圆杂圆韵猿溶液终止反应遥以阅耘杂的浓度为横坐标袁孢子致死率为纵坐标绘制致死曲线袁结果见图猿遥从图猿可以看出袁随着阅耘杂浓度的增加袁三孢布拉氏霉负菌孢子致死率逐渐升高遥同样袁考虑到三孢布拉氏霉是多核体袁后面的诱变选育采用高致死剂量员援远豫阅耘杂进行孢子诱变处理遥圆援远硫酸二乙酯诱变初筛利用阅耘杂对突变菌株哉原源的孢子进行多次诱变处理袁根据菌落颜色深浅及孢子生长数量从平板上挑选出了源株比较理想的突变菌株渊表猿冤袁以供三角瓶复筛遥圆援苑硫酸二乙酯诱变复筛从表源可以看出袁初筛得到的突变菌株哉原阅原圆的茁原胡萝卜素产量最高袁达到员圆猿远皂早辕蕴袁比菌株哉原源提高了猿苑援园豫袁比原始菌株提高了怨源援远豫袁且该菌株孢子生长情况比较理想遥因此袁选择突变菌株哉原阅原圆为进一步的选育菌株遥圆援愿遗传稳定性对突变菌株哉原阅原圆进行苑次传代培养袁并用三角摇瓶分别测定了每代的茁原胡萝卜素产量袁结果见表缘遥从表缘可以看出袁经过苑次传代培养袁突变菌株哉原阅原圆的茁原胡萝卜素产量变化不大袁说明其具有较好的遗传稳定性遥猿小结与讨论本试验以三孢布拉氏霉负菌作为原始菌株袁采用了紫外线和硫酸二乙酯两种诱变因子袁经过圆次诱变处理袁得到的突变菌株哉原阅原圆较原始菌株的茁原胡萝卜素产量提高了怨源援远豫袁但较其他报道的产量咱缘暂或工业化生产还有一定的差距袁这也与原始菌株产量偏低有关遥因此袁后面将进一步采用更高效的诱变因子袁如亚硝基胍尧钴辐射尧等离子等进行诱变选育袁以进一步提高其茁原胡萝卜素的产量遥三孢布拉氏霉属于一种异宗结合菌袁其茁原胡萝卜素的大量合成依赖于正尧负菌的结合培养遥因此袁三孢布拉氏霉正菌在茁原胡萝卜素的大量合成中也具有重要的作用袁所以今后将进行三孢布拉氏霉正菌的选育袁以提高正尧负菌株的结合能力及茁原胡萝卜素的产量遥此外袁实践表明袁三孢布拉氏霉菌种保藏方法对于菌种活性及茁原胡萝卜素的产量具有显著影响遥斜面低温渊源益冤保藏袁平均员耀员援缘个月就会死亡袁多次传代培养会引起明显的退化遥笔者改用孢子进行沙土管保藏袁可以保藏圆耀猿年袁无明显退化现象遥因此袁采用有效菌种保藏方式对于菌种选育也是非常重要的遥参考文献院咱员暂王雪援茁原胡萝卜素的研究进展咱允暂援中国化工贸易袁圆园员猿渊缘冤院员怨猿援咱圆暂张婷婷袁葛佳袁牛天贵袁等援三孢布拉氏霉菌发酵产茁原胡萝卜素发酵条件的研究咱允暂援食品科技袁圆园园怨袁员员渊猿源冤院圆原苑援咱猿暂颜作文袁王常高袁蔡俊援三孢布拉氏霉菌产茁原胡萝卜素发酵条件的优化咱允暂援食品与发酵科技袁圆园员猿袁源怨渊圆冤院圆缘原圆怨援咱源暂陆茂林袁单志萍袁孟妤援多核丝状真菌的选育及遗传稳定性咱允暂援生物技术袁圆园园圆袁员圆渊圆冤院员远原员怨援咱缘暂顾秋亚援茁原胡萝卜素高产菌株的选育及代谢调控的初步研究咱阅暂援江苏无锡院江南大学袁圆园园愿援表3三孢布拉氏霉负菌DES诱变初筛结果菌株编号U-4U-D-1U-D-2U-D-3U-D-4菌落颜色橙色橙黄色橙红色橙色深黄色孢子数量++++++++++++表4三孢布拉氏霉负菌硫酸二乙酯诱变复筛菌株编号原始菌株U-4U-D-1U-D-2U-D-3U-D-4茁-胡萝卜素产量//mg/L635902108012361103987表5三孢布拉氏霉负菌突变菌株的遗传稳定性代数1234567茁-胡萝卜素产量//mg/L1254120913111241120412251196图猿三孢布拉氏霉负菌阅耘杂诱变致死曲线10090807060504030201000.00.20.40.60.81.01.21.41.6DES浓度//%渊V颐V冤4150.com.cn. All Rights Reserved.