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透明质酸高产菌株选育研究

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透明质酸高产菌株选育研究

叶倩文;卢陆洋;李新松

【摘 要】从新鲜水牛鼻粘膜分离筛选得到15株菌株,经生化反应鉴定其中5株为透明质酸(HA)产生菌.对产量最高的菌株B发酵液精提物进行红外吸收光谱(IR)、核磁共振(13CNMR)、紫外吸收光谱(UV)分析,证明其发酵液精提物确为HA.菌株B经超声波/紫外线复合诱变处理后,HA产量由0.793 g·L-1提高到1.46 g·L-1.

【期刊名称】《化学与生物工程》

【年(卷),期】2010(027)003

【总页数】4页(P51-54)

【关键词】透明质酸高产菌株;筛选;鉴定;物理诱变

【作 者】叶倩文;卢陆洋;李新松

【作者单位】东南大学化学化工学院,生物材料和药物释放实验室,江苏,南京,211189;东南大学化学化工学院,生物材料和药物释放实验室,江苏,南京,211189;东南大学化学化工学院,生物材料和药物释放实验室,江苏,南京,211189

【正文语种】中 文

【中图分类】TQ921.7

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)，是以N-乙酰氨基葡萄糖胺和葡萄糖醛酸为单位，由β-1,3-糖苷键和β-1,4-糖苷键连接的高分子直链酸性粘多糖，广泛存在于高等动物的结缔组织及部分细菌内[1]。由于其溶液具有高粘性和独特的粘弹性而广泛应用于临床、诊断、化妆品等领域[2]。

透明质酸的生产方法主要有提取法和发酵法两种。由于组织提取成本较高、工艺复杂，因此应用更多的是以链球菌为发酵菌种的微生物发酵法[3]。目前透明质酸的产生菌主要为链球菌A群和C群。其中链球菌A群具有人致病性，所以一般采用链球菌C群为发酵起始菌株。国外发酵法HA生产已达产业化阶段，但我国利用发酵法生产HA的技术仍不成熟，关键是没有高产HA的菌种。所以从自然界寻找HA高产菌株已成为发酵法生产HA的研究热点[4]。

作者从新鲜的水牛鼻粘膜分离筛选出15株菌株，经生化反应鉴定其中5株为透明质酸产生菌。对HA产量最高的菌株的发酵液精提物进行红外吸收光谱、核磁共振、紫外吸收光谱分析，并对其进行超声波/紫外线复合诱变，透明质酸产量大幅提高。

1 实验

1.1 材料

新鲜水牛鼻粘膜，采自南京市江宁区某养牛专业户新宰杀水牛，共24份。

1.2 培养基

(1)脑心浸液培养基

牛脑浸粉10.0 g，牛心浸粉10.0 g，胰蛋白胨10.0 g，葡萄糖2.0 g，NaCl 5.0

g，琼脂20.0 g，加蒸馏水至1000 mL，调pH值至7.0，121℃下灭菌20 min。

(2)血琼脂平板培养基

将灭菌后的脑心浸液培养基冷却至50℃，在无菌条件下加入10%新鲜无菌脱纤维羊血后倒入平板冷却。

(3)种子培养基

葡萄糖10.0 g，酵母膏10.0 g，牛肉膏10.0 g，MgSO4·7H2O 2.0 g，K2HPO4

2.0 g，加蒸馏水至1000 mL，调pH值至7.0，121℃下灭菌20 min，冷却至常温，在无菌条件下加入10%小牛血清。 (4)发酵培养基

葡萄糖10.0 g，酵母膏20.0 g， MgSO4·7H2O 2.0 g，K2HPO4 2.0 g，加蒸馏水至1000 mL，调pH值至7.0，121℃下灭菌20 min。

1.3 菌种的分离筛选

1.3.1 初筛

将新鲜的水牛鼻粘膜接入1%蛋白胨溶液中，36℃、150 r·min-1下摇床培养12 h。将培养液梯度稀释至不同浓度分别涂布于血琼脂平板上，36℃下培养24 h。观察各菌落在血琼脂平板上的形态和溶血性，用接种针挑起看粘度。选取与文献[3]描述类似的菌株，革兰氏染色镜检，并进行链球菌C群生化反应鉴定。

1.3.2 复筛

取初筛菌株1～2环，接入种子培养基中，36℃、200 r·min-1下培养16 h，转入发酵培养基中，继续在36℃、200 r·min-1下培养48 h，接种量为10%。

发酵液经5000 r·min-1离心10 min，上清液加入2.5 BV乙醇，沉淀完全，再次离心10 min，取沉淀加入与起始发酵液等量的生理盐水溶解，稀释适当倍数后以硫酸咔唑法[3]测定HA的产量。选取产量最高菌株的发酵液参照文献[5]提纯，对发酵液精提物进行红外吸收光谱(IR)、核磁共振(13CNMR)、紫外吸收光谱(UV)分析，并对其进行诱变。

1.4 菌种的诱变选育

1.4.1 单细胞培养液制备

将细菌培养液在4000 r·min-1下离心5 min，倾去上清液，将菌体打散，加入无菌生理盐水洗涤数次，重新悬浮于10 mL生理盐水中，摇匀后倒入装有玻璃珠的已灭菌三角瓶内，振荡20 min。菌液过滤，单细胞滤液装入管内，作为待处理液[6，7]。

1.4.2 超声波/紫外线复合诱变处理 取10 mL处理好的单细胞培养液用超声波破碎，在20 kHz、200 W、220 V的超声条件下处理10 min，梯度稀释，涂布于血琼脂平板上，暗培养24 h。取其中菌落大、隆起高的菌落，再次制备单细胞培养液。取10 mL单细胞培养液加入培养皿内，置于磁力搅拌器上紫外照射90 s[8，9]，紫外灯的功率为20 W、照射距离为30 cm。菌液梯度稀释，涂布于血琼脂平板上，暗培养24 h。

1.4.3 突变株筛选

从血琼脂平板上挑菌落大、隆起高、溶血性较弱的菌株。选取1～2环接入装有种子培养基的摇瓶中，36℃、200 r·min-1下培养16 h，转入发酵培养基中，继续在36℃、200 r·min-1下培养48 h，接种量为10%，测定各菌株透明质酸的含量。

选取HA产量较高的菌株，传代6次后重复以上操作，再次测定HA含量。

2 结果与讨论

2.1 菌种初筛及生化反应鉴定结果

按1.3.1方法，选择血琼脂平板上圆而微凸、有光泽、用接种针挑起呈明显丝样粘连状的菌株[10]进一步分离纯化，得到15株具有链球菌典型菌落特征的菌株。将其编号为A～O，进行革兰氏染色镜检及生化反应鉴定，结果见表1。适宜产HA的链球菌C群特征为β-溶血、革兰氏阳性菌、水解七叶苷、水解精氨酸、不水解明胶、不水解马尿酸盐[11]。

表1 形态类似菌株生化鉴定结果Tab.1 Biochemical identification results of

morphology similar strains注：“+”为发生水解反应，“-”为没有发生水解反应菌株编号β-溶血革兰氏染色水解七叶苷水解精氨酸水解明胶水解马尿酸盐A+++++-B++++--C+++--+D+++-++E--F+++-++G++++--H++++--I--J++++--K++-+-+L-+-+++M++++--N++++++O-+-++-

由镜检、溶血性、生化反应特征鉴定结果判断，菌株B、G、H、J、M符合链球菌C群的特征，进一步摇瓶复筛；菌株E、I非β-溶血，革兰氏染色阴性，为杂菌，弃去；其余菌株虽具有链球菌的菌落特征，但不符合链球菌C群的生化反应特征，虽可能产生透明质酸，但亦可能具有致病性，不宜作为发酵起始菌株，弃去。

2.2 菌种复筛结果

2.2.1 透明质酸产量分析

采用硫酸咔唑法测定菌株B、G、H、J、M的HA产量，结果如图1所示。

图1 菌株B、G、H、J、M的透明质酸产量Fig.1 The HA yields of strain

B,G,H,J,M

从图1可以看出，菌株B产酸能力最强，为0.793 g·L-1；其次是H和M，产酸量在0.65 g·L-1左右；菌株J产HA能力最差，仅为0.305 g·L-1。由于菌株B产HA能力最强，选择B作为诱变起始菌株，并对其发酵液精提物进行进一步鉴定。

2.2.2 菌株B发酵液精提物红外吸收光谱分析

用KBr压片法制备样品，扫描范围为4000～700 cm-1。菌株B发酵液精提物红外吸收光谱图如图2所示。

图2 HA标准品(a)和菌株B发酵液精提物(b)的红外吸收光谱图Fig.2 Infrared

absorption spectra of HA standard(a) and fermentation extract of strain

B(b)

从图2可以看出，菌株B发酵液精提物在3400 cm-1处出现强烈的-OH的伸缩振动特征吸收峰，表明有多羟基结构；在2920 cm-1附近有-CH2、-CH或-CH3的伸缩振动特征吸收峰；在1620 cm-1、1560 cm-1处有-C=O、-C-N的伸缩振动特征吸收峰，表明存在乙酰氨基结构；在1400～1320 cm-1处有-COO中-C-O的伸缩振动和-OH的弯曲振动耦合产生的2个吸收峰，表明存在解离羧基结构和多糖羟基结构的糖醛酸。发酵液精提物与HA标准品红外吸收图谱基本一致[12]。

2.2.3 菌株B发酵液精提物核磁共振分析

对菌株B发酵液精提物进行核磁共振分析，频率为300 MHz，扫描温度为313 K，控温误差为±0.1℃。结果如图3所示。

从图3可以看出，在δ177.51及δ176.61处出现-COO-及=CO的特征峰；在δ105.80和δ103.15处出现-O(O)CH-的特征峰；在δ71.17～δ85.49处出现一系列=CHOH的特征峰；在δ56.93处出现=CHNH的特征峰；在δ60.25处出现侧基-CH2OH的特征峰；在δ25.11处出现侧基上-CH3的特征峰。由菌株B发酵液精提物与HA标准品的13CNMR图谱对比可知，两者结构基本一致[5]。

图3 菌株B发酵液精提物13CNMR图谱Fig.3 13CNMR spectrum of

fermentation extract of strain B

2.2.4 菌株B发酵液精提物紫外吸收光谱分析

对菌株B发酵液精提物的溶液与HA标准品溶液分别在190～280 nm范围内进行紫外扫描，测定其最大紫外吸收波长，结果见图4。

图4 HA标准品(a)和菌株B发酵液精提物(b)的紫外吸收光谱图Fig.4 UV

absorption spectra of HA standard(a) and fermentation extract of strain

B(b)

从图4可以看出，菌株B发酵液精提物最大吸收波长为205 nm，与HA标准品相同，且两者的峰型一致。

2.3 超声波/紫外线复合诱变结果

2.3.1 复合诱变前后菌落形态变化(图5)

图5 菌株B诱变前(a)和诱变后(b)菌落形态Fig.5 Colony morphogenesis of

strain B before (a) and after (b) mutation

从图5可以看出，经物理诱变(超声波/紫外线复合诱变)处理后，部分菌落明显变大，隆起变高，呈粘连状，且溶血性明显变弱，表明适宜作为发酵菌株。

2.3.2 复合诱变前后HA产量变化

采用超声波/紫外线复合诱变菌株B，选择5株菌落大、隆起高、溶血性弱的菌株，

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论文：透明质酸的研究进展

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透明质酸的研究进展

摘要：

透明质酸(Hyaluronic Acid简称HA)是一种国际上公认的生物大分子保湿剂，用于眼科显微手术、关节炎治疗、高级化妆品等领域。目前，透明质酸的生产方法逐渐由动物组织提取法转向微生物发酵法.。采用微生物发酵法生产透明质酸，培养条件选择pH6．5、摇速100次/分、培养温度37℃、培养时间48小时，添加生产因子，透明质酸产量增加近一倍。

关键词：透明质酸，微生物发酵法，培养条件，生产因子，影响微生物发酵的因素，透明质酸的应用前景

透明质酸（HA）又称玻璃酸钠，由β–D葡萄糖醛酸和β–D–N–乙酰氨基葡萄糖的双糖单位反复交替连接而成的高分子物质，是一种具有特殊功能的胞外酸性粘多糖，是构成皮肤真皮层的物质，广泛应用于脊椎动物的各种组织间质中。自20世纪30年代Mayer首次从动物眼玻璃体中提取得到HA后，HA的生产和应用研究至今已有70余年的历史。HA有独特的黏弹性和生理功能，是细胞外基质的主要成分，具有保水、润滑、调节渗透压等作用，可保护正常细胞免受毒性细胞、自由基等的侵袭，并可影响细胞增生、分化等。因此，HA广泛用于骨科、眼科、妇科、外科手术后防粘连、整形美容及保健食品等领域。近年的研究结果展示了HA有许多新的应用领域，并出现了新的衍生物，为开发HA的新用途奠定了基础。

１．目前HA的工业生产有两种方法:即提取法和发酵法。提取法主要利用鸡冠、人脐带、牛眼的玻璃体等为原料，进行生产，而且组织必须是新鲜采集，这样不但动物组织来源困难，且价格昂贵，成本高，这给HA的生产带来了一定的困难。发酵法生产HA，是利用链球菌将廉价的葡萄糖转化为HA，不依赖于动物器官，产量不受限制，成本也低，发酵液中的HA易于分离纯化，产品纯度高，但发酵法HA的产量不高。为此，我们对发酵法制备HA的工艺条件进行了实验研究，旨在提高HA产量，降低生产成本。

（１）．透明质酸的动物组织提取方法：以公鸡鸡冠为原料、以黄牛眼睛为原料和以人脐带为原料提取透明质酸。在此以公鸡鸡冠的提取工艺为例：鸡冠→丙酮预处理→去离子水提取→氯仿、正丁醇除杂物→95%乙醇沉淀→氯仿、正丁醇分离→链酶蛋白酶处理→氯仿、正丁醇再除杂→十六烷基三甲基溴化铵（CATB）沉淀→0.8摩尔/升氯化钠溶解→95%乙醇沉淀→真空干燥箱中干燥（２）．透明质酸的微生物发酵法：

透明质酸合成途径在乳酸乳球菌中的建立及微生物合成透明质酸分子量调控机制的初步研究

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透明质酸(hyaluronic acid,HA)作为一种高分子量的黏多糖,广泛存在于脊椎动物细胞中,发挥着结构、信号传导和信号识别的功能。HA由于其优异的黏弹性、保湿性和支撑作用,被广泛的应用于医药、化妆品、药物传递系统、疫苗和功能健康食品。

目前,工业上主要经由革兰氏阳性C型链球菌如兽疫链球菌(Streptococcus

zooepidemicus)发酵生产。但作为生产菌株,链球菌生长速度慢、培养基成本高等劣势日益显现出来,而寻找新的优秀野生生产菌株的希望渺茫。

所以,利用基因工程构建合成HA的工程菌株不但有利于克服链球菌作为发酵生产HA菌株的劣势,而且对提高HA的品质,扩大HA的应用范围具有理论意义和应用价值。乳酸乳球菌(Lactoccus lactis)作为革兰氏阳性菌的模式生物,已被广泛应用于食品发酵生产中,且被认定为GRAS(generally regarded as safe)微生物。

乳酸乳球菌由于其自身的优良特性,正越来越多地被应用于代谢工程改造过的现代工业中。在过去的25年中,乳酸乳球菌的基因操作方法日益成熟,其中一系列的诱导表达启动子得到了深入的研究,并已开始应用于工业生产。

通过改变小肽、单糖的浓度或诱导温度等调控因子,这些启动子能够实现乳酸乳球菌工程菌株中目的蛋白的可控表达。NICE(the nisin controlled gene

expression)系统是乳酸乳球菌中研究最深入和最有效的基因工程操作系统之一,已被广泛地应用于该菌株的代谢工程改造。

不但诱导剂乳酸链球菌素(nisin)是一种理想的高效安全无毒的食品级诱导分子,而且在NICE系统中可以将染色体上lacF基因缺失的乳酸球菌菌株以及含有lacF基因的质粒结合使用,用食品级筛选标记lacF替代抗生素抗性基因,构建食品级表达系统,而且该方式构建的工程菌株遗传稳定(deRuyter,Kuipers & de

发酵法生产透明质酸

发酵法生产透明质酸

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1页 发酵法生产透明质酸

透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是一种大分子的粘多糖,是一种由-D-N -乙酰氨基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸为结构单元,β-1，4-糖苷键连接成的一种链状高分子粘多糖。其分子量在几十万到几百万之间，又称糖醛酸，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，为目前所公认的最佳保湿成分，在化妆品工业、医学研究、临床治疗等领域有广泛的应用。

透明质酸的提炼的方法有三种：组织提取，微生物发酵和化学合成。组织提取法和化学合成法的成本高，产量低，受原料资源限制，不能满足市场需求。而微生物发酵法生产透明质酸具有不受原料资源限制、成本低、产量高、有较高的相对分子量、分离纯化工艺简便、易于大规模生产等特点成为透明质酸生产的发展方向，因此开发先进的微生物发酵法生产HA的技术十分必要。目前HA产业前景广阔，发酵法己成为HA生产的主流工艺，而发酵法生产HA的工艺仍需进一步完善。

微生物产HA的研究可以追溯到上个世纪30年代，1937年，Kendall发现链球菌可以产生HA，后来发现主要是一些A群和C群链球菌，它们具有合成与代谢以HA为主要成分的荚膜的能力。随后很多人进行了大量的研究。研究结果证明某些种属链球菌在一定的环境条件下，能同化吸收葡萄糖或其他碳源，以代谢物形式产生HA。随后经过不断地选育菌种和优化工艺，借助现代深层发酵技术与设备，HA的微生物发酵法被建立和应用起来。目前多选用链球菌、乳酸球菌类等（因此以下均以链球菌举例说明）。日本用发酵法生产了HA制剂．并对该产品做了大量的药效、毒理、药代动力学等非临床实验和临床实验。结果表明，发酵法生产的HA无局部及全身毒副作用、安全性高、疗效确切。

发酵法生产透明质酸主要包括两部分：发酵部分和下游提取工艺部分。发酵法生产HA的质量主要取决于菌种、培养基和分离提纯工艺的选择。

一.发酵部分：

兽疫链球菌的改良及其发酵生产透明质酸论文

兽疫链球菌的改良及其发酵生产透明质酸论文

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摘要

透明质酸作为一种重要的生物高分子化合物，具有广泛的应用价值。然而，其传统的生产方法存在一些问题，如成本高、产量低等。因此，本论文旨在研究兽疫链球菌的改良及其在透明质酸生产中的应用。通过优化兽疫链球菌的培养条件、改良发酵工艺等方法，提高透明质酸的产量并降低生产成本，从而推动透明质酸产业的发展。

引言

透明质酸是一种多糖酸，是由葡萄糖和N-乙酰葡萄糖胺通过β-(1,3)和β-(1,4)的糖苷键连接而成。它具有很高的黏性和保水性，被广泛应用于医药、化妆品和食品等领域。传统的透明质酸生产主要依赖于动物组织的提取，这种方法成本高昂且资源有限。因此，寻找更加经济、高效的透明质酸生产方法具有重要意义。

兽疫链球菌是一种常见的细菌，广泛存在于土壤、水体等环境中。它具有很强的代谢能力和适应性，可以利用多种底物产生透明质酸。因此，通过改良兽疫链球菌的生理特性和发酵工艺，可以提高透明质酸的产量和质量，并降低生产成本，从而推动透明质酸产业的发展。

兽疫链球菌的改良

兽疫链球菌的改良主要包括改良菌种、优化培养条件和遗传工程改造等方面。

改良菌种

传统的透明质酸生产菌种主要为野生兽疫链球菌，但其透明质酸产量较低且生长较慢。因此，研究人员通过随机诱变和遗传工程等方法，改良了菌种的生理特性。例如，选育出透明质酸高产菌株，能够在较短时间内产生大量的透明质酸。

优化培养条件

透明质酸的产量受到兽疫链球菌的培养条件的影响较大。研究人员通过优化培养基的组成、调节培养条件等方式，提高透明质酸的产量。例如，添加适当的氮源和碳源可以促进兽疫链球菌的生长和代谢，从而提高透明质酸的产量。

遗传工程改造

通过遗传工程改造兽疫链球菌，可以大幅提高其透明质酸产量。研究人员利用基因工程技术，将透明质酸合成相关基因导入兽疫链球菌中，从而增强其透明质酸合成能力。此外，通过基因敲除、基因表达调控等方法，也可以调控透明质酸产生相关基因的表达水平，提高透明质酸的产量。