高效液相色谱在药物分析中的应用与优化

高效液相色谱技术在药物分析中的应用

导语：

药物分析是药学领域中的重要分支，它涉及到药物的质量控制、研究与开发等方面。而高效液相色谱技术（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）由于其高灵敏度、高分辨率、高选择性和广泛适用性等特点，在药物分析领域得到了广泛的应用。

一、HPLC技术原理

HPLC技术是一种液相色谱分离方法，其原理是将待测样品通过一定方式注入到固定相柱中，再通过流动相的作用下，样品成分在固定相上发生分离。在HPLC系统中，流动相的选择和条件的控制对于药物分析具有重要的意义。

二、药物分析中常用的HPLC技术

1. 反相色谱法

反相色谱法是药物分析中应用最广的HPLC技术之一。常用的反相色谱固定相包括C18、C8、C4等。反相色谱法适用于疏水性药物的分析，其分离效果好，分析时间短。

2. 离子对色谱法

离子对色谱法适用于具有阴、阳离子特性的药物分析。通过加入适当的离子对试剂，可以改变流动相的离子性，使某些离子化合物在色谱柱上发生离子对形成，从而实现对药物的选择性分离。

3. 手性色谱法 手性色谱法主要用于对具有手性结构的药物进行分析。由于手性药物对于人体的作用机制存在差异，因此对药物的手性分析具有重要意义。手性色谱可通过手性固定相或手性添加剂来实现对手性化合物的选择性分离。

三、HPLC技术在药物质量控制中的应用

药物质量控制是药物研究与开发的重要环节，而HPLC技术在药物质量控制中起到了关键作用。通过HPLC技术，可以对药物的纯度、含量、残留物等进行准确测定，确保药物的质量安全。

四、HPLC技术在药物研究与开发中的应用

在药物研究与开发过程中，HPLC技术发挥了重要的作用。通过HPLC技术，可以对药物的代谢产物、药代动力学等进行研究，从而了解药物在体内的转化和效应。此外，HPLC技术还可用于药物配方的优化和稳定性研究等方面。

五、HPLC技术在中药分析中的应用

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超高效液相色谱在药物分析中的应用观察

作者：周之鸽

来源：《现代养生·下半月》2014年第05期

【摘 要】在研究微量复杂混合物的高通量与分离的过程中，超高效液相色谱为其深入研究提供了平台。超高效液相色谱技术适用于药物制剂或者是药物的分析、检测、代谢以及质量控制等研究。本文主要对超高效液相色谱的本质以及原理进行阐述，进而分析超高效液相色谱的优缺点，对其在药物分析过程中的应用做深入分析。

【关键词】超高效液相色谱；应用；药物分析；高效液相色谱

在化学成分的分离中，高效液相色谱属于常规的检测技术，最近几年以来，在药物分析中得到普遍使用。高效液相色谱的主要优点为处理样品的方法比较简便、全自动化检测、具有较宽的适用范围、分离药物成分的效率比较高、检测中具有较高的灵敏度等[1]。随着科学技术的不断发展，超高效液相色谱作为一个新的研究方向，在药物分析领域中的应用得到广泛的认可，本文主要阐述超高效液相色谱在药物分析中的应用。

1 超高效液相色谱技术

1.1 作用原理

超高效液相色谱主要是结合了小颗粒填料色谱柱中的液相色谱技术，这样能使分离色谱峰的程度以及检测的灵敏度得到改善，同时能有效的缩短分析样品所需周期。超高效液相色谱的理论基础就是范德米特方程，方程式：HETP=AdP+B/v+CdP2v[2]。流动相线速度表示v，传质因子表示C，分子径向扩散系数表示B，粒径表示dP，涡流扩散系数表示A，理论塔板高度表示HETP。如果微粒具有较小的颗粒度，色谱柱会随之升高；微粒的不同颗粒度大小会与其色谱柱流速相对应；颗粒度越小，线速度的范围也就越宽；颗粒度越小，其效点会逐渐移动到高流速的方向。由此可见，在微粒颗粒度降低的同时，能使色谱柱效以及速度会得到提高。在色谱柱中的填料颗粒如果发生粒径下降，那么会提高色谱的分离度。通过研究可以发现，填料颗粒粒径在2μm以下时，会扩大上述方程式所包含的理论塔板高度值的范围，说明微粒粒径在2μm以下时，所得的色谱柱效更高，不对影响分离高度，能使分析样品速度以及微粒流速得到提高。如图1所示。

２００７年１１月第４５卷第２０期

高效液相色谱法（Ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）是在经典液相色谱法的基础上，引入气相色谱法的理论和实践技术，以高压输送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器，发展而完成的现代液相色谱分析方法［１］。ＨＰＬＣ具有同时分离和分析的功能，对于体内药物分析和体内内源性物质的分析及成分复杂的重要分析尤为重要，色谱分离后排除了干扰，大大提高了分析测定的选择性和准确性。ＨＰＬＣ的分离功能还广泛用于药物的纯化和制备，也适合于一些微量成分和痕量成分（如杂质或代谢产物）的分析。医药分析包括对药物含量主成分的含量测定，以及对各种可能存在的杂质、分解产物等微量成分的鉴别和分析，及药品质量标准中的定性、定量和杂质检查测定，还包括对药物的开发研究至生产阶段的每个环节进行质量追踪，同时还包括药物代谢产物的分析、鉴定以及临床治疗药物的监测和体内物质的分析、测定。ＨＰＬＣ在西药的分析中应用于质量控制，尤其表现在微量成分和痕量成分的分析。而在中药材鉴定和质量分析上也越来越重要，它的应用将促进我国中药质量的标准化和规范化。１高效液相色谱法１．１高效液相色谱的基本分析方法类型：（１）定性分析：既包括有效成分或主要成分的定性鉴别，也包括杂质的鉴别，在体内药物分析中还包括各种代谢产物的鉴别。（２）定量分析：包括上述各种组分的定量测定。（３）杂质限度实验。分类：（１）定性分析方法：①色谱鉴别法；②化学鉴别法；③光谱鉴别法。（２）定量分析方法：①峰高和峰面积；②外标法；③内标法；④内加法。（３）药物杂质总量限度测定法。（４）制备型高效液相色谱法。１．２液相色谱的优点（１）不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广。（２）可选用不同性质的各种溶剂作为流动相，而且流动相对分离的选择性有很大作用，因此分离选择性高。（３）一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。２药物分析中的应用２．１体内药物分析的特点被测定的药物和代谢物的浓度极低；样品介质复杂，其中存在各种各样直接或间接影响测定结果的物质，大多需要分离和净化；仅有少量样品可供分析，尤其是在连续测定过程中，很难再度获得完全相同的样品；样品的稳定性需要特别注意。２．２ＨＰＬＣ在体内药物分析中的应用２．２．１研究实例１———ＲＰ－ＨＰＬＣ荧光检测法同时测定血浆中的盐酸维拉帕米和活性代谢物去甲维拉帕米的浓度［２］。２．２．１．１色谱行为Ｖｅｒ、Ｎｏｒ及Ｇａｌ的色谱峰保留时间分别为１８．２、１６．４和２１．８ｍｉｎ，分离度Ｒｖｅｒ－ｎｏｒ≥１．２，Ｒｎｏｒ－ｇａｌ≥１．８，无内源性杂质峰及维拉帕米其他代谢产物干扰。２．２．１．２标准曲线的制备于空白血浆中加入Ｖｅｒ（３．８９μｇ／ｍＬ）、Ｎｏｒ（３．６７μｇ／ｍＬ）的标准溶液，使其浓度分别为７．７８和７．３４；１９．４５和１８．３５；３８．９和３６．７；９７．２５和９１．７５；１９４．５和１８３．５；２９１．７５和２７５．２５；３８９和３６７；４８６．２５和４５８．７５ｎｇ／ｍＬ，处理，测定。以样品的浓度（Ｘ，ｎｇ／ｍＬ）为横坐标，样品与内标色谱峰高比值（Ｙ）为纵坐标作直线回归计算。结果表明，在５～５００ｎｇ／ｍＬ范围内（ｎ＝８）线性良好（Ｖｅｒ的治疗血药浓度不超过５００ｎｇ／ｍＬ）。Ｖｅｒ、Ｎｏｒ在人血浆中回归方程及相关系数分别为：Ｙｖｅｒ＝０．００４８＋５．３２４×１０－３Ｘ，ｒ＝０．９９９７；Ｙｖｏｒ＝０．０７７１＋５．７１９×１０－３Ｘ，ｒ＝０．９９９４。２．２．１．３最低检测限测定当信噪比（Ｓ／Ｎ）＝３时，Ｖｅｒ和Ｎｏｒ的最低检测限分别为１．９和１．８ｎｇ／ｍＬ。２．２．１．４方法回收率各取空白血浆１ｍＬ，分别加入Ｖｅｒ、Ｎｏｒ标准液，配成低、中、高浓度（４０、２００、４００ｎｇ／ｍＬ）的标准血浆各５批，测定，代入标准曲线计算，与加入的实际浓度比较，计算方法回收率。Ｎｏｒ高、中、低浓度的方法回收率分别为（１０１．９±１．９）％、（１００．８±５．３）％、（１０２．６±８．５）％。Ｖｅｒ低、中、高浓度的方法回收率分别为（１１１．９±５．７）％、（１０１．１±３．４）％、（１００．３±３．５）％。２．２．１．５精密度试验准确配制高（４００ｎｇ／ｍＬ）、中（２００ｎｇ／ｍＬ）、低（４０ｎｇ／ｍＬ）３个浓度的血样，同日内处理测定５批，计算日内相对标准偏差；隔日测定１批，连续５批，计算日间相对标准偏差。以高、中、低浓度顺序Ｖｅｒ的日内差ＲＳＤ为５．１３％、高效液相色谱技术及其在药物分析中的应用刘慧明（南方医科大学药学院２００４级药学，广州５１０５１５）［摘要］高效液相色谱是一高效、快速的分离分析技术，灵敏度高且选择性好。ＨＰＬＣ能直接分析难挥发、大分子、强极性及热稳定性差的化合物，适用于体内药物分析，广泛应用于药物合成的各步反应的监控和临床治疗药物的监测，同时也用于分离天然植物药的有效成分和分析中成药的各种有效成分。［关键词］ＨＰＬＣ；体内药物分析；天然药物［中图分类号］Ｏ６５７．７［文献标识码］Ａ［文章编号］１６７３－９７０１（２００７）２０－１５５－０２・综述・ＣＨＩＮＡＭＯＤＥＲＮＤＯＣＴＯＲ中国现代医生１５５２００７年１１月第４５卷第２０期３．３５％、３．５１％，日间差ＲＳＤ为４．０３％、２．９１％、１．５２％。Ｎｏｒ的日内差ＲＳＤ为８．２９％、５．２１％、１．９２％，日间差ＲＳＤ为７．８３％、２．６０％、３．１０％。２．２．１．６方法学应用８名健康志愿者，晨起标准餐后３ｈ单次口服Ｖｏｒ片（４０ｍｇ×２），分别于服药后０、０．３３３、０．６６７、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、４．０、６．０、８．０、１２．０、２４．０ｈ，前臂静脉取血２ｍＬ，分离血浆后处理测定，得出Ｖｅｒ和Ｎｏｒ的药时曲线。２．２．２研究实例２———ＲＰ－ＨＰＬＣ荧光检测法测定人血浆中酒石酸唑吡坦的浓度［３］。２．２．２．１色谱条件分析柱：ＨｙｐｅｒｓｉｌＯＳＤ２（中国科学院大连化学物理所，２００ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ）；流动相为乙腈０．０２３。２．２．２．２血样预处理取血浆样品５００μＬ，置１０ｍＬ离心管中，加入２５０μＬ０．２５ｍｏｌ／ＬＫＯＨ，振荡１ｍｉｎ，加５ｍＬ乙醚，涡旋振荡２ｍｉｎ，于１００００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取醚层４ｍＬ，转移至５ｍＬ离心管中，于３７℃水浴氮气吹干，残渣用２５０μＬ甲醇溶解，５０μＬ进样。２．２．２．３血浆标准曲线及最低检测限取健康人空白血浆共６份，依次加入酒石酸唑吡坦标准液使成５．０、１０．０、２５．０、５０．０、１００．０和２５０．０ｎｇ／ｍＬ的不同浓度，按前述方法处理后进样，以所测峰面积对浓度进行线性回归。结果表明，酒石酸唑吡坦在５．０～２５０ｎｇ／ｍＬ范围内线性良好，回归方程为Ａ＝６２５．５＋７７２．６Ｃ，ｒ＝０．９９９５，检测限为０．２５ｎｇ（Ｓ／Ｎ＝３），血浆中最低检测浓度为２．５ｎｇ／ｍＬ。３天然化学中的应用３．１天然药物现状随着中药研究事业的不断发展，中药材在国内和国际的需求量越来越大，国际上对药材的质量要求也越来越高。药物的重要有效成分的含量成为质量检查必不可少的参数，高效液相色谱的使用也越来越广泛。单味中药：（１）含生物碱的中药：麻黄、黄连、延胡索、防己、吴茱萸等。（２）含黄酮类化合物的中药：黄芩、葛根、银杏叶、红花等。（３）含蒽醌类化合物的中药：大黄、何首乌、决明子。中成药：蛇胆川贝液、葛根芩连片、黄连上清片、速效牛黄丸、半夏泻心散、木香顺气丸、逍遥丸、丹参注射液等。３．２反相高效液相色谱法的应用研究实例３———反相高效液相色谱法同时测定补阳还五汤中芍药苷和阿魏酸的含量［４］。３．２．１对照品贮备液的制备称取芍药苷４．４５９ｍｇ和阿魏酸０．２１９２ｍｇ，置于１０ｍＬ棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容，摇匀，得浓度为４４５．９μｇ／ｍＬ芍药苷溶液和２１．９２μｇ／ｍＬ阿魏酸溶液。３．２．２供试溶液的制备《医林改错》古方，取黄芪１２０ｇ，当归６ｇ，赤芍４．５ｇ，地龙、川芎、桃仁、红花各３ｇ，置１０００ｍＬ烧杯中，加５００ｍＬ水浸泡３０ｍｉｎ，武火煎煮沸腾后，文火再煎３０ｍｉｎ，共煎２次，每次３０ｍｉｎ，合并提取液。将煎好的补阳还五汤用纯化水稀释１０倍，摇匀，１５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，上清液用０．２２μｍ微孔滤膜过滤，取续滤液备用。３．２．３阴性对照溶液的制备按处方比例配成不含川芎、当归和赤芍的补阳还五汤样品，然后制备阴性对照溶液。３．２．４线性关系考察精密吸取芍药苷、阿魏酸对照品储备液适量于６个１０ｍＬ棕色容量瓶中，加甲醇定容，摇匀备用，得到一系列不同浓度的对照品混合溶液。分别取各梯度混合对照品溶液适量，进样２０μＬ。分别以芍药苷、阿魏酸对照品的浓度（Ｘ，μｇ／ｍＬ）为横坐标，以其峰面积积分值（Ｙ）为纵坐标绘制标准曲线，结果芍药苷：Ｙ＝８７．７０５Ｘ－４．９３４，ｒ＝０．９９９９，线性范围４～２４μｇ／ｍＬ；阿魏酸：Ｙ＝１２０．７９９Ｘ＋９１．８１６，ｒ＝０．９９９８，线性范围０．４～２．０μｇ／ｍＬ。由此可见，芍药苷和阿魏酸对照品在所选的范围内线性关系良好。４结论高效液相色谱法在体内药物分析中具有样品处理简便、快速，标准曲线的线性较好，精密度和灵敏度均能够符合药动学研究和治疗药物监测的需要的优点。而且，ＨＰＬＣ能同时进行分离和定量测定，这在治疗药物监测和药代动力学中应用极为广泛［５］。近年来，ＨＰＬＣ在仪器、检测器、固定相等方面都有很大的发展，这大大促进了在中、西药的药物分析应用。但每一种分析技术均有其使用范围和方法的局限性，因此色谱技术联用变得越来越普遍。现在主要是色谱－色谱联用、色谱－光谱联用、高效液相色谱－质谱联用，还有柱切换技术以及高效液相色谱－傅立叶变换红外吸收光谱联用等。高效液相色谱与其他技术的联用是高效液相色谱今后的主要发展方向。［参考文献］［１］李发美．医药高效液相色谱技术［Ｍ］．北京：人民卫生出版社，１９９９：１１０－１５０．［２］邹豪，蒋雪涛，马伯良，等．ＲＰ－ＨＰＬＣ荧光检测法同时测定血浆中的盐酸维拉帕米和活性代谢物去甲维拉帕米的浓度［Ｊ］．中国药学杂志，２００１，３６（８）：５３７－５３９．［３］宋洪杰，李珍，石晶，等．高效液相色谱－荧光检测法测定人血浆中酒石酸唑吡坦的浓度［Ｊ］．中国药学杂志，２００１，３６（５）：３３３－３３５．［４］朱伟，王学美．反相高效液相色谱法同时测定补阳还五汤中芍药苷和阿魏酸的含量［Ｊ］．医药导报，２００６，２５（１）：６０－６２．［５］吕娟涛，杨伟丽，潘秋燕．高效液相色谱法在药学研究中的应用与进展［Ｊ］．实验与学习，２００５，２３（２２）：９１－９２．（收稿日期：２００７－０９－３０）・综述・１５６中国现代医生ＣＨＩＮＡＭＯＤＥＲＮＤＯＣＴＯＲ

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浅析高效液相色谱在药物分析中的应用

班级10级生物技术 学号110122801252 姓名冯越越

摘要 高效液相色谱技术是现在检测防腐剂的常用技术，通过此技术同时检测多种防腐剂，不仅省时而且省力。本实验的难点就是确定流动相的组成、配比、流速以及检测波长，以求同时检测出以上四种防腐剂。确定方案之后，本实验的重点就是样品的前处理，样品的检测，检测方法的稳定性与准确性。本论文的目的旨在准确测定防腐剂的含量，并希望引起广大消费者的关注。

关键词 液相色谱；气相色谱；药物分析

引言 HPLC近年来在食品分析检测上应用后，扩大了分析检测范围，提高了分析水平，尤其对食品中残留的微量，痕量有毒有害物质，能快速，准确的分析出来，进一步提高了食品卫生质量，保障了食品安全和人民身体健康，促进了食品出口。HPLC法在食品分析检测中有广泛的应用前景。

1高效液相色谱的简介

高效液相色谱简称HPLC，又称高速或高压液相色谱。该法吸收了普通液相层析和气相色谱的优点，经过适当改进发展起来的，既有普通液相层析的功能，又有气相色谱的特点（即高压，高速，高分辨和高灵敏度）。HPLC是近年来迅速发展起来的一项新颖的分离技术，不仅适用于很多不易挥发，难热分解物质（如蛋白质，肽类，氨基酸及其衍生物等）的定性定量分析，而且也适用于上述物质的制备和分离。HPLC法由于兼备液相和气相两种色谱分析方法的优点，近年来在食品检测和分析上应用并飞速发展。

1.1HPLC与气相柱色谱法(GC)相比较，主要有以下几点优势：

(1) GC的分析对象仅限于蒸汽压低、沸点低的样品(仅占有机物总数的20%)，不适于分析高沸点有机物、高分子化合物、热稳定性差的有机物及生物活性物质。而HPLC不受此限制，能对80%的有机物进行分离与分析。

(2)GC流动相为惰性气体，不能与待测组分发生作用。HPLC流动相选择余地大，可与待测组分发生作用，而且通过改变流动相的组成，可改善分离的选择性(相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数)。