组织分离培养母种、母种的转管(课堂PPT)

菌种分离与培养（1）人们采取无菌操作的方法，把某种食用菌从混杂的微生物中，单独地分离开来，这个过程叫做菌种分离。

从分离过程中得到的菌丝体纯化后，就是纯菌种。

在实验室条件下，以人工使纯菌种大量生长和繁殖的方法，叫做培养。

一、母种培养(一)菌种分离菌种分离通常采用的方法有孢子分离法、组织分离法和寄主分离三种方法，三种方法各有特点，可根据不同的菌类和生产条件选择使用。

1.孢子分离法孢子分离法，是利用成熟子实体的有性孢子能自动从子实体层中弹射出来的特性，在无菌条件下和适宜的培养基上，使孢子萌发成菌丝，而获得纯种的一种方法。

(1)孢子的采集①种菇的选择用作分离菌种的种菇，应选择出菇早、朵型好、个体肥大、生长健壮、无病虫害、八成熟的菇体。

一进入出菇期，就要注意观察选择，并作好标记。

不同的食用菌选择的具体要求是：香菇菇型圆整，菇体肥大，柄细而短，菌盖呈深褐色，出菇早，无病虫害，一般为八成熟的子实体。

双孢蘑菇菇型圆整，光滑直立，颜色洁白，柄粗盖厚，无病虫害，生长快而健壮的单生菇。

草菇菇型端正，肥大健壮，包被未破，无病虫害的单生菇。

平菇出菇早，菌盖厚实，重叠丛生，菌柄粗短，色泽鲜亮，尚未散发孢子，八成熟而无病虫害的子实体。

木耳选朵大、耳片厚、色黑、生长健壮、褶皱多、无病虫害的春耳。

银耳朵大肉肥、色泽洁白、展片良好、朵型美观、八成熟、无病虫害的子实体。

猴头形状正常、颜色洁白、出菇早、生长健壮、菌刺丰满、无病虫害的子实体。

金针菇出菇早而均匀、生长健壮、朵型正常、菌柄长短适中、无病虫害的子实体。

②种菇的消毒子实体采回后要及时切除基部，并进行表面消毒。

对子实体层未外露的种菇(如蘑菇等)，可浸入0.1%升汞溶液中消毒约1分钟，用镊子捏出后经无菌水冲洗数次，再用无菌纱布将表面水吸干；对于子实层裸露的种菇(如香菇等)，只能用75%酒精揩擦菌盖及菌柄表面；而对于银耳、木耳类子实体，却千万不能接触消毒剂，只能置于烧杯中用无菌水洗涤，然后捏起再经无菌水冲洗数次，同样用无菌纱布吸干表面水。

食用菌的制种（母种的分离和培养）()---食用菌菌种质量的优劣，直接影响到栽培的成败和产量的高低，只有优良的菌种，才能获得优质高产的食用菌。

因此食用菌的制种，是生产中一项极其重要的工艺。

食用菌的菌种按培养阶段和来源的不同，可分母种、原种和栽培种三种。

从食用菌的孢子分离培养或从组织分离培养、基内菌丝分离培养所得到的第一代菌丝体，称为母种。

从母种扩大培养的菌丝体，称为原种。

从原种扩大培养直接用于生产上播种的菌丝体；称为栽培种。

一、母种的分离和培养（一）母种培养基的配制1.母种培养基的种类母种是菌种生产的关键，要求纯度高，不能混生杂菌，同时母种的菌丝体较为纤细，分解培养料的能力较弱。

因此，母种菌丝体需要培养在营养丰富，易被吸收，表面光滑易于鉴别有无杂菌感染的琼脂培养基上。

适合母种菌丝生长的琼脂培养基种类很多，常用的有下列几种：（1）马铃薯——葡萄糖——琼脂培养基马铃薯（去皮） 200克琼脂 20克葡萄糖（或蔗糖） 20克水 1000毫升（2）麦芽汁——葡萄糖——琼脂培养基干麦芽 250克琼脂 15～20克葡萄糖（或蔗糖） 10克水 1000毫升（3）胡萝卜——葡萄糖——琼脂培养基胡萝卜 100克琼脂 20克葡萄糖（或蔗糖） 20克水 1000毫升（4）蘑菇汁——葡萄糖一一琼脂培养基（适用于蘑菇）鲜蘑菇 250克琼脂20克葡萄糖（或蔗糖） 20克水 1000毫升（5）蛋白胨——葡萄糖——琼脂培养基蛋白胨 2克葡萄糖 20克磷酸氢二钾 2克维生素B1（硫胺素） 0.5毫克磷酸二氢钾 0.5克琼脂 18克硫酸镁 0.5克水l000毫升2.母种培养基的制法兹以最常用的马铃薯——葡萄糖——琼脂培养基的制法为例介绍如下：先将马铃薯去皮，洗涤，切成小块，加水1000毫升，煮沸15～20 分钟，取双层纱布过滤，取其滤液，加入琼脂和葡萄糖（或蔗糖），用文火加热使其溶化，最后补足水分，使其容量仍为1000毫升。

趁热分装于试管中，装量约为试管长度的1/5左右，装管时要注意不使培养基沾污试管壁和试管口。

香菇母种繁育技术用香菇的组织、孢子或菇木的菌丝经分离、纯化和转管培养出来，再用于繁殖原种或保存用的菌种，称为母种。

但具体如何繁育？有以下几项要点。

一、菌种分离1、组织分离要培养出优良的菌种，必须要有好的母种，好的母种又来源于健壮的香菇个体，因此，首先必须选择发育正常、个体健壮、没有虫咬的新鲜菇蕾作为分离的材料。

菇蕾采回后，不需用水洗，也不需用药水消毒。

放入干净的培养皿内，用消毒过的手或解剖刀将香菇从中剖开，在盖与柄接触的部分切取黄豆大小的菌肉，放在已准备好的培养基上，塞上棉花即可。

2、孢子分离选择个体强壮，八分成熟的香菇，除去菌柄，菌褶朝下挂在玻璃漏斗上一条特制的铁丝钩上，漏斗盖住培养皿(培养皿放在一只垫有纱布的搪瓷盆中)，静放12-20小时，菌褶上的孢子(种子)便大部分落在培养皿内，形成一层白色粉末状物，即可作为分离培养使用。

孢子接种时，用接种针取出少量孢子，用无菌水配制成孢子悬浮液。

再用接种针，取出少量悬浮液，用划线的方法接种于培养皿内的培养基上，待孢子萌发，生成菌落后，选择孢子最先萌发并生长最好的菌落进行纯化转管繁殖。

3、菇木菌丝分离选取未出过菇或刚出过菇不久、但已恢复菌丝生长的菇木(肉眼看不见杂菌)一小段，拿回室内，不需表面消毒，用皮带冲在要分离的部分，将树皮取掉，然后用酒精消毒皮带冲，冲口在酒精灯火焰上灭菌，灭菌后，即时打入菇木已取皮的部分，迅速取出皮带冲，用灭过菌的小剪刀在冲口菇木块中间，剪下黄豆粒大小的一块，接入培养基上即可。

以上三种分离法，整个过程均应在无菌室内进行，一切用具均应经过严格消毒，以防杂菌污染。

无菌室事前要用5%的石炭酸喷射，有条件的再经过紫外线灯照射20-30分钟。

接种台上最好铺上一块用2%的来苏尔消毒过的湿纱布。

二、培养菌种分离接种后，放在25℃左右条件下培养，两三天即可看见白色棉花状的菌丝从菇肉或木块上长出，三、四天便可看见从孢子萌发出的白色菌丝，十多天整个试管长满菌丝。

食用菌制种工艺流程图随着食用菌产业的蓬勃发展，菌种需要量随之增加，而现有菌种生产单位明显偏少，许多菇农不得不向外引种。

长途购运菌种不仅花费大，成本高而且菌种因破瓶而易引起杂菌污染，从而严重影响栽培食用菌的经济效益。

菇农若能掌握菌种生产程序和制种技术，自行制种，逐步发展成制种专业户，也是一项很好的致富门路。

菌种生产程序，通常分为母种、原种和栽培种，也就是通常所说的一级、二级、三级菌种。

其中母种的分离选育技术性强，要求精化；而原种和栽培种的制作则比较简单。

下面介绍各级菌种的制作技术：一、母种的分离选育：母种主要采用人工选择、诱变育种、杂交育种和原生质融合等手段获得。

作为一般制种专业户，可以采用人工选择方式分离培育母种，具体步骤与操作方法如下。

1、采集种源从野生成人工栽培群体中，选择有代表性的优良菇体作为种源。

种菇的标准是：八成熟，朵形圆正、肉质肥厚，无病虫害。

采集1--2朵符合上述标准的种菇编上号码，作为分离母种的材料。

从栽培室采集的应标有原菌株代号。

2、培养基配制琼脂培养基又叫PDA培养基，常用配方为：马铃薯200--250克，琼脂15--20克，葡萄糖20--25克，清水1000毫升。

也可以加硫酸镁1--1．5克，维生素B1微量，磷酸二氢钾2--3克。

先将马铃薯洗净去皮，挖去芽眼，切成薄片，置于铝锅内加水煮沸30分钟，捞起后用4层纱布过滤，取汁。

然后将琼脂加入汁内，边加热边搅拌，让琼脂充分溶化；再将葡萄糖等加入，稍煮几分钟后，同样用4层纱布过滤，取其汁液。

将汁液趁热装入玻璃试管内。

装至管长的1／5，管口用棉花塞紧，或将汁液装入玻璃三角瓶内，装量20毫升。

然后置于高压锅内，在98--108千帕／厘米的压力下灭菌30分钟左右。

灭菌后及时取出，趁热将试管斜排于桌面上，冷却后即成为固体斜面培养基。

3、母种分离方法有孢子弹射分离、组织分离和基内分离3种方法。

(1)孢子弹射法。

将种菇表面消毒，吸干水分后，将菇体悬挂于装有琼脂培养基的三角瓶内，让菇体内的袍子自然散落在培养基上萌发菌丝。

菌种的分离与培养在自然界里，食用菌都不是单独存在的，而是和许多细菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。

所谓菌种分离，就是把这些和食用菌一起生活的杂菌分离出来，通过培养，获得纯的优良菌种。

菌种分母种、原种、栽培种。

(一）母种的分离培养食用菌母种的分离，可分为孢子分离法、组织分离法以及基内菌丝分离等。

1.孢子分离法孢子分离法，是用食用菌的有性孢子或无性孢子萌发成菌丝，培养成菌种的方法。

这种菌种生活力较强，但孢子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。

（l）单孢分离法：是每次或每支试管只取一个担孢子，让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法。

蘑菇和草菇用单孢分离得到的菌丝，有结实能力，可采用此法分离生产纯菌种。

单孢分离生产上较少采用，而且技术复杂，一般采用多孢分离法。

（2）多孢分离法：就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。

具体操作方法，有以下几种：①种菇孢子弹射法：选择个体健壮、朵形圆正，无病虫害、出菇均匀、高产稳产，适应性强的八九分成熟的种菇，切去大部分，菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。

在接种箱或无菌室内，把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面，漏斗倒盖在培养皿上面；上端小孔用棉花塞住。

培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上，静置12～20小时，菌褶上的孢子就会散落在培养皿内。

形成一层粉末状孢子印（平菇极淡紫色，蘑菇、草菇为褐色，香菇、金针菇孢子印白色）。

用接种针沾取少量孢子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种。

待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养。

还可用孢子采集器收集孢子。

方法是选好种菇后，按上述程序，轻轻掀开玻璃钟罩，将种菇柄朝下插在孢子采收器的钢丝架上，放在培养皿正中央。

随即盖好玻璃罩，用纱布将钟掌周围塞好。

并在纱布上倒少许升汞或无菌水。

移入20℃左右恒温箱培养。

②褶上涂抹法：按无菌操作分离时；应选择成熟的种菇，用接种针直接插入褶片之间，轻轻抹取褶片表面子实体尚未弹射的孢子，再在培养基上划线接种。

灵芝菌种扩制母种转管方法灵芝母种转管技术分离、保藏的母种数量少，需扩大繁殖成再生母种才能满足原种制作的需求。

母种是菌种生产之本，必须纯度高，生活力强。

凡保藏时间长和衰老的母种，需复壮后方可应用。

在无菌条件下，把斜面菌丝移植到空白斜面上的方法称为转管。

其程序是：1.选取新鲜灵芝斜面菌种1支，在酒精灯火焰旁将棉塞顺时针转松并稍往外移动，而后右手小指和无名指基部夹紧棉塞取下，同时拿起接种刀垂直火焰上烧红并慢慢倾斜灼烧至接种时可能伸入试管内的刀柄部分，反复灼烧数次，伸人试管内贴在管壁上冷却，从斜面底部往前纵切1~2刀，以切破菌苔为度。

取出接种刀放在接种工具架上，换取接种锄，跟上述一样灼烧处理，将斜面菌种自底部往前横切若干刀，整个斜面菌种被分割成许多方形小块，也可用接种钩纵横划成小菌块，塞上原棉塞并把切割的斜面菌种放在左手掌心和食指之间。

取空白斜面1支，放在左手中指与无名指之间与斜面菌种试管紧靠，管口对齐，并旋松棉塞。

2.手拿接种铲或接种刀，如上述方法灼烧灭菌。

以下操作均需使试管口靠近火焰，并略向下倾斜。

3.用右手无名指与小指基部夹住菌种试管的棉塞，小指基部与手掌夹住空白斜面棉塞，轻轻拔下。

4.将灼烧后的接种刀伸入空白斜面内贴住管壁前后移动冷却，然后取出伸入菌种试管内，挑取1小块稍带琼脂的菌苔，慢慢抽出并迅速伸入空白斜面试管内，将菌块安放在斜面中央。

5.灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上接种后的斜面试管上。

6.将刀部灼烧灭菌后放回架上，腾出手将塞塞紧放在一旁。

然后重新取空白斜面放在左手菌种试管旁，如前接第二支斜面。

如此，直至全部斜面接完。

每支斜面一般转管30支以上空白斜面。

接后在试管上方贴上标签，注明名称、菌号、日期，放入28度恒温箱内培养。

以上就是xx对灵芝的介绍，如您有更好的补充请在下方留言告诉我们。

一、实验目的1. 掌握母种转管及培养的基本操作流程；2. 熟悉无菌操作技术，确保菌种纯度；3. 了解食用菌母种在培养过程中的注意事项，提高菌种繁殖能力。

二、实验原理母种转管及培养是指将原始菌种接种到培养基上，经过一定时间的培养，使其繁殖成一定数量的菌丝体，以便进行后续的菌种扩繁和栽培。

无菌操作技术是保证菌种纯度的重要手段。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：马铃薯、葡萄糖、琼脂、水、食用菌菌种、无菌试管、无菌培养基、酒精灯、接种针、接种环、镊子、酒精棉球、火焰炉、培养箱等。

2. 实验仪器：天平、三角瓶、烧杯、漏斗、玻璃棒、剪刀、棉花、线绳、牛皮纸、皮筋、纱布等。

四、实验步骤1. 培养基配制（1）称取马铃薯200g，去皮，切成小块，加水1200-1300ml，煮沸20min；（2）用双层纱布过滤，取滤液1000ml；（3）将滤液加热至将沸腾时，加入琼脂15-20g，不断搅拌；（4）待琼脂完全溶解后，加入葡萄糖20g，搅拌均匀；（5）用精密pH试纸检测pH值，调整至自然pH值；（6）将培养基分装到无菌试管中，每管约10ml，塞上棉塞；（7）将试管置于高压蒸汽灭菌器中，121℃灭菌30min。

2. 接种（1）将灭菌后的试管取出，待其冷却至室温；（2）用火焰炉烧灼接种针、接种环，待其冷却；（3）用接种针从原始菌种中挑取少量菌丝，接种到无菌培养基上；（4）用火焰炉烧灼接种针、接种环，待其冷却；（5）将接种后的试管放入培养箱中，25℃恒温培养。

3. 转管（1）待菌丝长满试管斜面后，用火焰炉烧灼接种针、接种环，待其冷却；（2）用接种针将菌丝挑取到新的无菌培养基上；（3）将接种后的试管放入培养箱中，25℃恒温培养。

4. 培养与观察（1）定期观察菌丝生长情况，记录菌丝生长速度、颜色、形态等；（2）发现杂菌感染时，及时挑除；（3）待菌丝长满试管斜面后，即可进行后续的菌种扩繁和栽培。

五、实验结果与分析1. 在实验过程中，严格按照无菌操作技术进行操作，确保菌种纯度；2. 通过观察菌丝生长情况，发现菌丝生长速度较快，颜色正常，无杂菌感染；3. 经过转管培养，菌丝繁殖能力得到提高。