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土壤净氮矿化率的测定—厌氧培养法(Anaerobic method)一,实验目的1.掌握厌氧培养法测定土壤净氮矿化率的基本原理与操作方法2.掌握凯氏定氮的原理和蒸馏定氮器或氨气敏电极的使用方法返回二,实验内容1.土样的野外采集与处理2.土样水淹状态下厌氧矿化培养3.凯氏定氮法测定土样矿化率返回三,实验原理1.背景知识①土壤中的氮素氮素是蛋白质和核酸的重要组成部分,同时又是叶绿素,酶,维生素,生物碱等的必要成分,在植物细胞的生长,分化和各种代谢过程中,氮素都起着重要的作用.土壤中的氮绝大部分(约90%以上)以复合态存在于有机质或腐殖质中,而大多数的植物所吸收利用的氮素主要是无机态的铵态氮和硝态氮.土壤中的有机质和腐殖质等有机态氮通过氮素矿化作用(主要是土壤微生物作用)释放出无机态氮(主要是铵态氮与硝态氮),为植物吸收利用.返回②氮素矿化作用与土壤净氮矿化率氮素矿化作用是土壤中有机态氮经土壤微生物的分解,转化为无机态氮的过程,它在生态系统中是土壤对植物生长供给氮素的关键过程.土壤净氮矿化率则是描述土壤氮素矿化作用速率的指标,指单位时间内土壤有机态氮经矿化作用转化为易被植物利用的无机态氮的量.它在一定程度上反映了土壤对植物氮素的供应能力,对农业生产中作物的选择和肥料的施用都起着指导性的作用.③测试方法简介目前国内外土壤矿化氮的测定方法主要是生物培养法,此法测定的是土壤中氮的潜在供应能力,其结果与植物生长的相关性较高.生物培养法分为好氧培养法(aerobic method)和厌氧培养法(anaerobic method).好氧培养法:使土样在适宜的温度,水分,通气条件下进行培养,测定培养过程中释放出的无机态氮,即在培养之前和培养之后测定土壤中无机态氮(铵态氮和硝态氮等)的总量,二者之差即为矿化氮.好氧培养法沿用至今已有很多改进,主要反映在:用的土样质量(10～15g),加或不加填充物(如砂,蛭石)以及土样和填充物的比例,温度控制(25～35℃),水分和通气调节(如土10g,加水6mL或加水至土壤持水量的60%),培养时间(14～20天)等.很明显,培养的条件不同,测出的结果也会不同.厌氧培养法:通常以水淹创造条件进行培养(water logging method),测定土壤中有机态氮经矿化作用转化的无机态氮的量.其培养过程中条件的控制比较容易掌握,不需要考虑同期条件和严格的水分控制,可用较少土样和较短培养时间,方法简单且快速,结果的再现性较好,更适合于例行分析.故本试验采用厌氧培养法. 2,基本原理厌氧培养法基本原理用水淹保温法处理土壤,利用厌氧微生物在一定温度下矿化土壤有机态氮成为NH4+—N,再用2mol·L-1 KCl溶液浸提,浸出液中的NH4+—N,在碱液和还原剂的作用下用蒸馏法将NH3 蒸出,冷凝后用吸收液接收并滴定,从中减去土壤初始无机态氮(即原存在于土壤中的NH4+—N和NO3-—N),得到土壤矿化氮量.(也可以用氨气敏电极测定水溶性氨,取代滴定过程)四,实验仪器,试剂及配制1.主要仪器半微量定氮蒸馏装置;半微量滴定管(5ml)或PNH3-1-氨气敏电极四,实验仪器,试剂及配制2.试剂① 40%NaOH溶液称取工业用固体NaOH400g(用小烧杯做容器称取),取硬质1000ml玻璃烧杯,先加蒸馏水600mL,将称好的NaOH缓缓倒入并不断搅拌,以防止烧杯底角固结.冷却后倒入试剂瓶备用.(每样品用量5ml)四,实验仪器,试剂及配制②甲基红—溴甲酚绿混合指示剂0.5g溴甲酚绿和0.1g甲基红溶于100mL乙醇中.③ 20g·L-1 H2BO3—吸收液20g H2BO3(化学纯)溶于1L水中,每升H2BO3溶液中加入甲基红—溴甲酚绿混合指示剂5mL并用弱酸或弱碱(0.1mol/L的Hcl或NaOH)调节至紫红色.(指示剂灵敏范围紫黑色——紫红色,吸收液易受到酸碱污染,临用前配制并调色.)翠绿色暗绿色灰黑色紫黑色暗紫色紫红色酒红色碱————————————————————————————酸(每样品用量10ml)④0.02 mol·L-1 (1/2H2SO4)标准溶液(根据实际情况可选择合适浓度酸液)先配制0.10 mol·L-1 (1/2H2SO4)溶液,然后用标准碱液标定,再准确稀释而成.(精确)(每样品用量2-5ml)⑤ 2.5mol/L KCl称取KCl(化学纯)186.4g,溶于800ml蒸馏水中,定容至1L.(每培养样用量80ml) 四,实验仪器,试剂及配制⑥ 2.0mol/L KCL称取KCL(化学纯) 149g, 溶于800ml蒸馏水中,定容至1L.(每初始样用量100ml) 返回⑦ FeSO4—Zn粉还原剂将Fe SO4·7H2O(化学纯)和Zn粉共同磨细(或分别磨细,分别保存,可数年不变,用时按比例混合)以5 :1混合盛于棕色瓶中备用(混合后易氧化,保存不可超过一星期).(每样品用量1.2g)⑧ 比色液吸收液调色完成后,吸取吸收液10ml,置于50ml三角瓶中,用蒸馏水稀释置40ml. 五,实验方法与步骤1.土样的采集与处理土壤是一个不均一体,影响它的因素错综复杂,因此土壤样品的代表性与采样误差的控制直接相关,采样时要贯彻"随机"原则,即样品应当随机的取自所代表的总体.① 一般土样采取自2-10cm土层土壤,也可根据采集地主要作物根系深度采取土样.为样品的保存和工作的方便,从野外采回的土样都先进行风干.② 将采回的土样,放在塑料布上,摊成薄薄的一层,置于室内通风阴干.在土样半干时,须将大土块捏碎(尤其是黏性土壤),以免完全干后结成硬块,难以磨细.风干场所力求干燥通风,并要防止酸蒸气,氨气和灰尘的污染.③ 样品风干后,应拣去动植物残体如根,茎,叶,虫体等和石块,结核(石灰,铁,锰),再经研细,使之通过2mm孔径的筛子待测.五,实验方法与步骤2.培养土样准备称取过筛后的风干土样20.0g (记录质量)置于150mL三角瓶中,加蒸馏水20.0mL,摇匀(土样必须被水全部覆盖).加盖橡皮塞,置于40±2℃恒温生物培养箱中培养待测(七昼夜).3.土壤初始氮的测定① 称取过筛后的风干土样20.0g(记录质量),置于250mL三角瓶中,加2mol·L-1 KCl溶液100mL,加塞振荡30min,过滤于150mL三角瓶中.② 由进样口加入FeSO4—Zn粉还原剂1.2g,用吸管吸取滤液30mL由进样口加入(此过程尽量将还原剂冲入反应室),再加40%NaOH溶液5mL,立即封闭进样口并将预先将盛有20g·L-1硼酸—吸收液10mL的50ml三角瓶置于冷凝管下.③通蒸汽蒸馏,当吸收液达到40mL时停止蒸馏,取下三角瓶,用0.02mol·L-1 (1/2H2SO4) 标准液滴定并与比色液进行比色,当吸收液与比色液颜色基本一致后停止滴定,并记录滴定所用酸的量.同时做空白试验.(亦可采用氨气敏电极测定)注:如滴定用去的酸液少于1ml或超过5ml需调节酸浓度,使多数滴定值在2ml-4ml 之间.加碱液和加吸收液不能用同一个吸耳球,避免造成吸收液的污染.如果实验过程中发现原吸收液被污染,应停止实验,重新对原吸收液调色,并重新配置比色液.4.土壤矿化氮和初始氮之和的测定培养一周后取出矿化培养土样,加80mL 2.5mol·L-1 KCl溶液,再用橡皮塞塞紧,在振荡机上振荡30min,取下立即过滤于150mL三角瓶中.蒸馏滴定过程同土壤初始氮的测定.同时做空白试验.(亦可采用氨气敏电极测定)六,实验结果与计1.结果计算2.实验数据记录表3.拟结果记录表七,讨论对土壤矿化率可能产生影响的因素及产生影响的可能原因.(包括对人为误差产生的讨论)本实验除考虑测定样地土壤矿化率外,也可以分不同的小组从多个角度进行测定,并对各小组的实验结果进行比较,(如对不同土质土壤矿化率或同一土质不同深度的土壤矿化率进行对比实验)讨论结果并分析影响土壤矿化率的因素.八,思考题①如果矿化率为负值,讨论造成此实验结果的可能原因.②请根据本组或其他小组所完成的实验结果,分析影响土壤矿化率的因素和影响因素的作用机制.九,附录:半微量蒸馏定氮器使用方法(Makham型)此仪器有两种型号(见图1,2), 其结构极其相似,不同的是: 1型进样漏斗位置在蒸馏器上方,易于操作,装置合理,洗涤方便,但是保温能力稍差.2型进样漏斗在中部,保温层'7'几乎全部包围反应室,其优点保温好,蒸馏快.本仪器无蒸汽发生器,需自行配套.图1中的蒸汽发生装置可供参考,其制作如下:取2000ml或1000ml三角烧瓶, 装上胶塞和安全管, 通入绝缘导线,连接500W 电热丝,并外套瓷珠以绝缘,加入蒸馏水,通电加热,外接调压器可调节蒸汽大小.(也可用1000ml烧瓶和酒精灯自制简易蒸汽发生器)返回九,附录:半微量蒸馏定氮器使用方法(Makham型)操作方法先连接好冷却水(由' 4 '进水' 5 '出水) 并接通蒸汽发生器.先通蒸汽洗涤定氮器内室,待外室充满蒸汽后,关闭6.蒸数分钟,关闭进汽开关A.略等数秒钟,反应室2内废液即倒吸到7 (因蒸汽冷凝收缩形成负压所至),废液由6放出.返回九,附录:半微量蒸馏定氮器使用方法(Makham型) 返回样品测定把冷凝管下口插入接收瓶,催化剂和测试样品由进样漏斗加入,加NaOH5ml后迅速盖塞,加水液封.通入蒸汽,关闭6,从蒸馏出第一清蒸馏液(或指示剂变绿)开始计时,蒸馏约10-20分钟,将接收液离开冷凝管口,再蒸馏1分钟后停止,接收液马上进行滴定.蒸馏完毕后,由进样漏斗倒入蒸馏水洗涤反应室,同前反复洗涤倒吸3次,即可测下一个样品.九,附录:半微量蒸馏定氮器使用方法(Makham型) 返回注意事项(1)加样时,开关6须打开,以免倒吸.(2)吸收液应保持冷却,防氨挥发而损失.九,附录:半微量蒸馏定氮器使用方法(Makham型)附录 2 PNH3-1-氨气敏电极的基本原理与操作方法返回气敏电极是离子选择性电极的一个重要分支.它是指对样品中溶解的气态物质能直接响应的电极.因此氨气敏电极可直接响应水样中气态氨量,也可以在改变水样的pH等条件测定NH4-N总量.它是利用气体可渗透而离子不可渗透的膜,将样品溶液和内充溶液分开的一种电极.样品中溶解的气态物质,借助化学反应使其逸出,以扩散方式透过膜,从而引起膜内电解质中某一离子活度的变化,使得紧贴于膜内的离子选择性电位也变化,其电位变化值和样品溶液中气态物质的存在形态及其含量有关.附录 2 PNH3-1-氨气敏电极的基本原理与操作方法返回在溶液中, 当溶液的PH值大于14时溶液中的NH4+全部变成NH3 + H+附录 2 PNH3-1-氨气敏电极的基本原理与操作方法适用范围:水溶性氨浓度10-1 —— 5*10-6 mol/L 温度5-45 oC具体操作:1,蒸馏过程与半微量凯氏蒸馏滴定法基本相同,(直接使用20g·L-1 的H2BO310ml作为吸收液,而不用加指示剂),当吸收液达到40ml-50ml时将吸收液倒入100ml容量瓶中并加水定容,定容后倒入200ml烧杯中.2,将氨气敏电极插入烧杯中并开动搅拌器.3,加入40% NaOH溶液2-3ml,开动搅拌器3-5分钟后,读取电极电位值: E1. 4,从曲线上查得其浓度.5,根据稀释倍数可推算出样品中无机氮的含量。
实验十厌氧菌的分离和培养（第三篇）实验十厌氧菌的分离和培养1 目的1.1 了解厌氧微生物的生长特性1.2 观察厌氧微生物（双歧杆菌）的形态特征1.3 掌握厌氧微生物的滚管分离、培养与计数技术2 原理目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括有：厌氧箱培养技术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术；亨盖特厌氧滚管技术。
这里介绍的是亨盖特厌氧滚管技术。
亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特（Hungate）于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。
以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趣完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一整套完整技术。
而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。
亨盖特厌样滚管培养技术不仅可用于有益厌氧菌如双歧杆菌等的分离、与活菌培养计数，还可以用于有害腐败菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭状芽孢杆菌）的分离与鉴定。
3 材料3.1 样品双歧酸奶（液体）、双歧杆菌制剂（固体）。
3.2 培养基改良MRS培养基，PTYG培养基。
3.3 仪器和器具亨盖特厌氧滚管装置一套，厌氧管，厌氧瓶，滚管机，定量加样器。
4 流程铜柱除氧→预还原培养基→稀释用液制备→稀释样品→滚管→培养→计数5 方法5.1铜柱系统除氧铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。
此管的大小为40—400mm，两段被加工成漏斗装，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。
铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，一端连接出气管口。
由于从气钢瓶出来的气体如N2、C O2和H2等通常都含有O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。
当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。
此铜柱可以反复使用，并不断起到除氧的目的。
当然H2源也可以由氢气发生器产生。
厌氧性细菌的分离培养法厌氧菌需有较低的氧化—还原势能才能生长 (例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化—还原电势降低至 0.11V 时才开始生长 )，在有氧的环境下，培养基的氧化—还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。
为使培养基降低势，降低培养环境的氧压是十分必要的。
现有的厌氧培养法甚多，主要有生物学，化学和物理学 3 种方法，可根据各实验室的具体情况而选用。
1．生物学方法培养基中含有植物组织 (如马铃薯、燕麦、发芽谷物等 )或动物组织 (新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等 ) ，由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而消耗氧气(如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能消耗氧气，碎肉培养基的应用，就是根据这个原理 )，组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—还原电势下降。
另外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧消耗后，使厌氧菌能生长。
其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌(如枯草杆菌 )，另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37恒温箱中培养2~3d 后，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。
2．化学方法利用还原作用强的化学物质，将环境或培养基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降低氧化—还原电势。
此法系用连二亚硫酸纳 (Sodium hydrosulphite) 和碳酸钠以吸收空气中的氧气，其反应式如下：Na2S204 十Na2C03十O2 一→ Na2SO4十Na2SO3 十C02取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内 (如系液体培养基，则直立于罐内 )，最上端保留可容纳 1~2 个平皿的空间 (视玻罐的体积而定 )，按玻罐的体积每1000cm3 空间用连二亚硫酸纳及碳酸钠各 30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。
若用无盖玻罐，则可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐罩于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭 (如图１－５ )。
厌氧培养箱的原理及使用
厌氧培养箱是一种在无氧环境下进行细菌培养及操作的专用装置，可培养
难生长的厌氧生物，又能避免以往厌氧生物在大气中的操作时接触氧而死亡
的危险性嘲。
结构特点：该产品由培养操作室、取样室、气路及电路控制系统、熔蜡消
毒器等部分组成。
温控系统采用高精度数显式控温仪，能准确直观的反映箱
内实际温度，加上有效的限温保护装置，安全可靠。
箱内装有紫外线杀菌灯，气体经过过滤后进入箱内，可有效避免细菌污染。
歧路装置可任意调节流量，能任意输入各种气体。
操作室均由不锈钢板制成。
其前窗采用透明耐冲压特
种玻璃制成。
操作使用专用手套，可靠、舒适、灵活、使用方便。
操作室内
配有特殊接种棒灭菌器，熔蜡消毒装置，还装有除氧催化器。
注意事项：禁止在真空状态下打开舱门、手套口压盖或进行拆卸检修。
内
置电源为220V、50Hz、1KW。
手套应先于或同时于箱体抽真空，后于或同时
于箱体停止抽真空。
外接气源管件应适配、接插应密封牢靠，充气时不宜超
过零压即1个大气压。
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实验六、厌氧菌检验一、厌氧培养1、刨肉基法方法：将破伤风梭菌、产气荚膜梭菌分别接种在庖肉培养基中，35℃48h，观察结果。
2、厌氧罐法方法：将破伤风梭菌接种在高渗芽孢培养基中并放置于厌氧罐中；将破伤风梭菌、产气荚膜梭菌分别接种在血平板中并置于厌氧罐中，放厌氧袋，密闭，置35℃48h观察结果。
二、观察厌氧菌培养结果：1、庖肉基1）破伤风梭菌：肉汤混浊，部分消化，微变黑，有少量气体，有腐败性恶臭味。
2）产气荚膜梭菌：产生气体，肉渣呈粉红色，不被消化。
2、血平板1）破伤风梭菌：呈薄膜状生长，菌落半透明、灰白色、边缘疏松呈羽毛状，伴β溶血。
2）产气荚膜梭菌：多数菌株有双层溶血环，内环完全溶血，外环不完全溶血。
3、梭菌平板破伤风梭菌：形成直径1mm 以上不规则的菌落，中心紧密，周边疏松，似羽毛状。
三、涂片、革兰染色镜检：破伤风梭菌产气荚膜梭菌G-，细长，芽胞圆形，比菌体大，G+，粗短大杆菌，两端钝圆，单个或成双排列。
位于菌体顶端，使细菌呈鼓槌状芽胞椭圆形，位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于菌体四、芽孢染色：制片①5%孔雀绿加热3~5min，水洗甩干；②0.5%沙黄水溶液染色0.5~1.0min，水洗甩干干后镜检，如图所示：菌体呈红色，芽孢呈淡绿色。
破伤风梭菌产气荚膜梭菌五、汹涌发酵试验（试教）产气荚膜梭菌：分解乳糖产酸，使酪蛋白变性，同时产生大量气体，将凝固的酪蛋白冲成蜂窝状，并将液面上的凡土林层向上推挤，甚至冲开管口棉塞，气势凶猛，为“汹涌发酵”。
六、讨论：1、做生化试验时，有些细菌为致病菌，故实验时要保护好自己，且实验废弃物要妥善处理，以免发生有害菌的感染。
2、所有接种的菌株暴露于有氧环境中不得超过20min3、厌氧菌检验：可据厌氧菌的菌体形态、染色反应、菌落性状以及对某些抗生素的敏感性等作出初步鉴定。
最后鉴定则要进行生化反应及终末代谢产物等项检查。
4、破伤风梭菌微生物检验：根据破伤风的典型临床表现即可作出诊断，故一般不作细菌学检查。
厌氧菌在有氧的情况下不能生长。
要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。
通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。
如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。
常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。
1.厌氧缸法：接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。
2.厌氧袋：即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。
塑料袋透明而不透气，内装气体发生管、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。
放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。
先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。
如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。
3.厌氧手套箱：是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。
它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。
箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。
欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。
箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。
该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。
金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。
4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。
5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物，消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。
我没见过。
6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。
厌氧菌在有氧的情况下不能生长。
要培养厌氧菌，必须创造一个环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。
如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。
常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。
1.厌氧缸法：接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。
2.厌氧袋：即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。
塑料袋透明而不透气，内装气体发生管、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。
放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。
先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。
如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育（较为推荐）。
3.厌氧手套箱：是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。
它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。
箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。
欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。
箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。
该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。
金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。
4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。
5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物，消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。
我没见过。
6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。
焦性末食子酸与碱反应后耗氧。
厌氧培养箱之厌氧菌的培养操作厌氧菌在有氧的情况下不能生长。
要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。
通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。
如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。
常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。
1．厌氧缸法接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。
2．厌氧袋（Bio-bag）即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。
塑料袋透明而不透气，内装气体发生管（有硼Q化钠的碳酸氢钠固体以及5%柠檬酸安瓿）、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。
放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。
先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。
如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。
3．厌氧手套箱（Anaerobie glove box）即厌氧培养箱。
它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。
箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。
欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气（H2，CO2，N2）达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。
箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。
该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。
金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。
4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。
5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物（多是植物），消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。
我没见过。
6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。
厌氧发酵原理
厌氧发酵是一种在缺氧条件下，微生物在有机物质中产生能量的过程。
它通过一系列复杂的化学反应来转化有机物质，并产生产物。
厌氧发酵的过程涉及到许多微生物，如细菌和真菌。
这些微生物利用有机物作为它们的碳源和能源。
在缺氧条件下，它们通过代谢途径来分解有机物质，并将其转化为不同的化合物。
厌氧发酵的过程包括以下几个主要步骤：
1. 底物降解：有机物质被微生物降解为简单的化合物，如有机酸、醇和气体等。
2. 发酵产物生成：在降解过程中，微生物产生各种形式的代谢产物，如酒精、乳酸、醋酸等，这些产物可以进一步用于其他工业过程或食品生产中。
3. 能量生成：在发酵过程中，微生物通过代谢途径产生能量。
这种能量产生主要是通过有机物质的氧化还原反应释放出的能量来实现的。
厌氧发酵的原理是基于微生物对缺氧环境下氧化还原反应的利用。
在缺氧的条件下，微生物无法利用氧气来进行呼吸作用，因此它们通过其他一些氧化还原反应来产生能量。
总体来说，厌氧发酵是微生物在缺氧条件下利用有机物质产生
能量的一种过程。
通过这种过程，可获得多种有用的产品，如酒精、乳酸和醋酸等。
这种过程被广泛应用于医药、食品和能源工业等领域。
厌氧细菌培养技术一、厌氧菌的培养方式厌氧菌的培养过程中，最重要的就是为其提供厌氧生长环境，厌氧环境的提供可以从以下两方面着手。
一方面可以提供厌氧装置如厌氧手套箱，厌氧产气罐或者厌氧产气袋。
另一方面可以提供含有还原剂的特殊培养基，如含少量琼脂，L-半胱氨酸，硫乙醇酸钠，巯基乙醇等的液体培养基。
要注意的是，如果没有厌氧手套箱，我们在对厌氧菌活化或者是转接操作的时候，动作要快，防止厌氧菌在空气中暴露的时间过长。
二、我们正常的大气环境中是有氧环境，这类厌氧菌通常生活在哪里呢我们研究这类菌有什么意义呢我们的大气环境确实是一个有氧环境。
但是，地球上还存在很多厌氧环境比如深海和淤泥中，厌氧菌在我们人体中也普遍存在。
我们研究厌氧菌，一方面是因为厌氧菌是临床上一类重要的病原菌；另一方面，哺乳动物肠道菌群中99%是厌氧菌，其中许多是促进消化吸收的有益菌，不管是从致病机理，还是开展疾病治疗来说对厌氧菌的研究意义都很重大。
三、为什么好氧菌在生长繁殖过程中必须有氧气存在，而厌氧菌在生长过程中氧气却对对其产生毒害作用呢微生物虽然可以利用氧，通过有氧呼吸来产生更多的能量，满足机体的需要，但是氧对一切生物都会产生有毒害的代谢产物，比如会产生超氧阴离子，过氧化氢和羟自由基。
超氧阴离子和羟自由基是强氧化剂，能氧化细胞内的大分子物质和有机化合物，对细胞造成损伤，过氧化氢也会损害一些细胞组分。
但是，微生物细胞可以通过产生过氧化氢酶，超氧化物歧化酶和超氧化物还原酶等等这些酶类来清除细胞内的毒性氧。
对于好氧菌来说，细胞内往往会产生超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，所以氧气对这类微生物不会产生毒害。
那么对于厌氧菌来说，细胞内无法合成超氧化物歧化酶〔SOD〕和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。
所以，这类微生物无法消除氧气对它的毒害作用。
只能在无氧的环境中通过发酵或无氧呼吸产能。
厌氧微生物培养技术的目的和原理厌氧微生物培养技术是一种特殊的微生物培养技术，用于培养需要在无氧（或低氧）条件下生长的微生物。
传统的培养技术通常在常氧（或高氧）条件下进行，但很多微生物对氧气敏感，只有在无氧或低氧条件下才能生长和繁殖。
因此，厌氧微生物培养技术通过提供适宜的无氧（或低氧）环境，使得这些微生物能够在实验室中进行培养和研究。
下面将对厌氧微生物培养技术的目的和原理进行详细的阐述。
1.研究厌氧微生物的生长特性：通过培养厌氧微生物，可以研究其生长速度、代谢途径、产生的代谢产物等生物学特性。
这有助于了解厌氧微生物的生态功能和对环境的影响。
2.分离和纯化厌氧微生物：通过厌氧培养技术，可以将混合微生物群体中的厌氧微生物单独分离出来。
这有助于研究单个厌氧微生物的特性，并为进一步的研究提供纯化的微生物株。
3.研究厌氧微生物的代谢途径和产物：许多厌氧微生物具有特殊的代谢途径，如厌氧呼吸、厌氧发酵等。
通过培养这些厌氧微生物，可以研究其代谢途径和产物，有助于理解它们在生物地球化学循环中的角色。
1.提供无氧（或低氧）环境：为了使厌氧微生物能够生长和繁殖，必须在培养过程中提供无氧（或低氧）的条件。
通常采用的方法是使用密封的容器或瓶子，将培养物与外界的氧气隔离开来。
为了进一步确保无氧环境，可以添加还原剂如硫化钠或葡萄糖，以降低培养液中的氧气含量。
2.确定厌氧微生物的生长需求：不同的厌氧微生物对培养条件有不同的要求，如温度、pH值、营养物质等。
在培养之前需要进行调查和研究，以确定最适合其生长和繁殖的条件。
3.选择适当的培养基：为了培养厌氧微生物，需要选择适合其生长的培养基。
一般来讲，培养基中需要添加适量的有机物、无机盐和维生素等营养物质。
此外，还可以添加一些特殊的成分，如胶体杰尔线、酶还原剂等，以促进厌氧微生物的生长。
4.控制培养条件：在培养过程中，需要注意控制培养条件，如温度、pH值等。
这可以通过使用恒温箱、恒温培养箱和PH计等仪器设备来实现。
厌氧性细菌的分离培养法厌氧菌需有较低的氧化—还原势能才能生长(例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化—还原电势降低至0.11V时才开始生长)，在有氧的环境下，培养基的氧化—还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。
为使培养基降低势，降低培养环境的氧压是十分必要的。
现有的厌氧培养法甚多，主要有生物学，化学和物理学3种方法，可根据各实验室的具体情况而选用。
1．生物学方法培养基中含有植物组织(如马铃薯、燕麦、发芽谷物等)或动物组织(新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等)，由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而消耗氧气(如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能消耗氧气，碎肉培养基的应用，就是根据这个原理)，组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—还原电势下降。
另外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧消耗后，使厌氧菌能生长。
其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌(如枯草杆菌)，另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37恒温箱中培养2~3d后，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。
2．化学方法利用还原作用强的化学物质，将环境或培养基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降低氧化—还原电势。
（１）李伏夫(B．M．JIbbob)法此法系用连二亚硫酸纳(Sodium hydrosulphite)和碳酸钠以吸收空气中的氧气，其反应式如下：Na2S204十Na2C03十O2一→Na2SO4十Na2SO3十C02取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内(如系液体培养基，则直立于罐内)，最上端保留可容纳1~2个平皿的空间(视玻罐的体积而定)，按玻罐的体积每1000cm3空间用连二亚硫酸纳及碳酸钠各30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。
若用无盖玻罐，则可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐罩于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭(如图１－５)。
一、实验目的1. 了解厌氧菌的生物学特性及其在土壤中的分布情况。
2. 掌握厌氧菌的分离、培养和鉴定方法。
3. 探讨厌氧菌在土壤生态系统中的作用及其与土壤环境的关系。
二、实验原理厌氧菌是一类在无氧或低氧条件下生长的微生物，广泛分布于土壤、水体、动物肠道等环境中。
土壤中的厌氧菌在有机质分解、氮素循环、硫素循环等方面发挥着重要作用。
本实验通过分离、培养和鉴定土壤中的厌氧菌，分析其生物学特性，探讨其在土壤生态系统中的作用。
三、实验材料与方法1. 实验材料（1）土壤样品：采集于某农田土壤，充分混合均匀后，分成若干份备用。
（2）厌氧菌培养基：疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基、牛心脑浸液培养基等。
（3）厌氧菌鉴定试剂：氧化酶试剂、过氧化氢酶试剂、硝酸盐还原试剂等。
2. 实验方法（1）土壤样品的预处理将采集的土壤样品充分混合均匀，称取一定量的土壤样品，加入适量的无菌水，充分搅拌，制成土壤悬液。
（2）厌氧菌的分离将土壤悬液接种于厌氧菌培养基中，在厌氧条件下培养。
选取生长良好的菌落，进行纯化培养。
（3）厌氧菌的鉴定对纯化后的厌氧菌进行形态观察、生理生化实验和分子生物学鉴定。
1）形态观察：观察菌落的形状、颜色、大小、边缘等特征。
2）生理生化实验：进行氧化酶、过氧化氢酶、硝酸盐还原等实验，鉴定厌氧菌的生理生化特性。
3）分子生物学鉴定：采用PCR技术扩增厌氧菌的16S rRNA基因，进行基因序列分析，鉴定厌氧菌的种属。
四、实验结果与分析1. 厌氧菌的分离与纯化经过厌氧培养，成功分离出多种厌氧菌。
纯化后的菌落形态各异，具有一定的生物学特征。
2. 厌氧菌的鉴定通过对纯化后的厌氧菌进行形态观察、生理生化实验和分子生物学鉴定，确定其种属。
（1）氧化酶实验：部分厌氧菌表现出氧化酶活性，可氧化还原性物质。
（2）过氧化氢酶实验：部分厌氧菌表现出过氧化氢酶活性，可分解过氧化氢。
（3）硝酸盐还原实验：部分厌氧菌具有硝酸盐还原酶活性，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
一、实验目的1. 掌握厌氧菌的分离方法。
2. 学习厌氧菌的鉴定技术。
3. 了解厌氧菌的生长特性及其在自然界中的分布。
二、实验原理厌氧菌是一类在无氧条件下生长繁殖的微生物，其代谢过程中不需要氧气。
本实验通过分离和鉴定厌氧菌，旨在了解其在自然界中的分布和作用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 酵母膏- 葡萄糖- 琼脂- 麦芽糖- 磷酸氢二钠- 氯化钠- 硫化氢生成剂- 氨水- 氨化钠- 氨水- 硫化氢指示剂- 酚红指示剂- 酚红- 氨水- 碘液- 水浴锅- 火焰光度计- 紫外分光光度计- 显微镜- 培养箱- 无菌操作台2. 实验仪器：- 离心机- 高压蒸汽灭菌器- 玻璃器皿- 移液器- 恒温培养箱- 紫外可见分光光度计- 电子天平四、实验方法1. 厌氧菌的分离（1）样品采集：从土壤、水体、动物粪便等环境中采集样品。
（2）样品处理：将样品进行梯度稀释，取适量稀释液涂布于厌氧菌培养基上。
（3）培养：将涂布好的培养基置于厌氧培养箱中，37℃恒温培养24小时。
（4）观察：观察菌落形态，挑取典型菌落进行进一步鉴定。
2. 厌氧菌的鉴定（1）形态学鉴定：观察菌落形态、颜色、大小等特征。
（2）生化鉴定：a. 硫化氢生成试验：将分离得到的菌落接种于硫化氢生成培养基上，观察硫化氢生成情况。
b. 氨水试验：将分离得到的菌落接种于氨水培养基上，观察氨水颜色变化。
c. 碘液试验：将分离得到的菌落接种于碘液培养基上，观察碘液颜色变化。
d. 紫外分光光度计测定：测定菌落生长过程中产生的代谢产物，如有机酸、醇类等。
（3）分子生物学鉴定：a. 16S rRNA基因扩增：提取分离得到的菌落DNA，进行16S rRNA基因扩增。
b. 序列分析：将扩增得到的16S rRNA基因序列进行BLAST分析，与数据库中的已知序列进行比对，确定菌种。
五、实验结果与分析1. 厌氧菌的分离结果从土壤、水体、动物粪便等环境中分离得到多种厌氧菌，菌落形态各异，如球形、杆状、螺旋状等。
污水的厌氧生物处理污水的处理是保护环境和保障人类健康的重要工作之一。
在污水处理过程中，厌氧生物处理是一种重要的方法，具有高效、经济和环保等优点。
1. 厌氧生物处理的基本原理厌氧生物处理是指在缺氧或没有氧气存在的条件下，利用厌氧微生物对有机废水进行处理的过程。
其基本原理是通过厌氧微生物的代谢活动，将有机废水中的有机物质转化为沼气和水。
2. 厌氧生物处理的工艺流程厌氧生物处理的工艺流程包括进水处理、反应器设计、微生物菌群培养和沼气收集等步骤。
2.1 进水处理进水处理是指对进入处理系统的废水进行预处理，主要包括除沉淀、除磷和除氮等工艺。
这些工艺的目的是降低进水中的悬浮物、有机物和营养物质的浓度，以减轻后续处理过程的负荷。
2.2 反应器设计反应器设计是厌氧生物处理的关键环节，主要包括反应器类型、体积和混合方式等。
常见的反应器类型有厌氧池、厌氧滤池和厌氧反应器等。
反应器的体积和混合方式的选择取决于处理规模和废水的特性。
2.3 微生物菌群培养微生物菌群培养是指在反应器内培养适宜的厌氧微生物，以促进有机物质的降解和沼气的。
菌群培养需要注意维持适宜的温度、pH值和营养物质等条件，以提高厌氧处理效果。
2.4 沼气收集沼气是厌氧生物处理的产物之一，该过程需要收集和利用沼气。
沼气中主要成分为甲烷和二氧化碳，可以作为能源利用或其他用途，如发电、供暖和热水等。
3. 厌氧生物处理的优势和应用3.1 优势厌氧生物处理具有以下优势：高效：厌氧微生物对有机废水具有较强的降解能力，可以高效处理高浓度有机废水。
经济：厌氧生物处理过程中产生的沼气可以用作能源，降低能源消耗和处理成本。
环保：厌氧生物处理过程中产生的沼气是一种清洁能源，减少了温室气体排放。
3.2 应用厌氧生物处理广泛应用于各类生活污水、工业废水和农业废水等领域。
在城市污水处理厂和工业废水处理厂中，厌氧生物处理已成为常见的处理技术。
4. 厌氧生物处理的挑战和发展趋势4.1 挑战厌氧生物处理面临以下挑战：技术难题：厌氧生物处理的反应器设计和微生物菌群培养等环节仍存在一定的技术难题，需要进一步研究和探索。
厌氧培养法原理
厌氧培养法是一种在无氧或极低氧气条件下进行细菌或真菌的培养的方法。
其原理是通过创建一个完全无氧的环境来模拟对某些微生物最有利的生长条件。
在厌氧培养法中，培养基必须经过严格的处理，以去除其中的氧气。
一种常用的方法是将培养基置于密封的容器中，并通过添加化学物质（如还原剂）或使用真空泵来将氧气排除。
另外，厌氧培养箱也可以提供稳定的无氧环境。
厌氧条件下的细菌或真菌在生长中利用其他氧化剂（如硝酸盐或硫酸盐）代替氧气。
这些微生物通常具有特殊的代谢途径，可以在无氧环境下存活和繁殖。
厌氧培养方法可以用于分离和鉴定对氧敏感的微生物，例如肠道菌群中的某些细菌。
在厌氧培养法中，还需要采取其他措施来确保无氧条件的持久性。
例如，一些厌氧培养方法会添加指示剂，当氧气进入培养基时，指示剂会发生变色，以提醒操作人员需要更换无氧环境。
此外，培养过程中的一些操作，如传递和分离菌落，也需要在无氧环境下进行。
总的来说，厌氧培养法通过创建无氧环境来提供最适宜某些微生物生长和繁殖的条件。
这种方法对于研究厌氧菌的生物学特性以及诊断和治疗与氧气敏感相关的疾病都具有重要的应用价值。
一、厌氧培养的原理
厌氧培养的原理有两方面：一是除去与培养基接触的空气中的氧气；二是增强培养基的还原能力，达到吸收容量中的氧气的目的，是微生物处于无氧的环境中。
二、实验器材
菌种：魏氏梭菌
培养基：卵黄琼脂培养基、疱肉培养基
仪器：恒温水是培养箱、干燥器、真空泵、玻璃平皿、无菌脱脂棉、透明胶三、实验内容及方法
取疱肉培养基试剂管煮沸10——15分钟，感触其溶解的氧气，取出，并迅速冷却，切勿摇动，并按下列步骤操作：
1、接种样品均质液1——2ml或10ml，置于恒温30.C的培养箱内培养五天。
若无异常现象可再培养十天。
若产生混浊并散发奇臭怪味或发酵形成消化肉渣（底部出现黑色沉淀）的即为疱肉培养基试管呈阳性，咋可待用。
2、从阳性疱肉培养基试管中挑出菌种（菌株），划线于卵黄琼脂平板待用。
3、将上述处理后的平板至于干燥器内，在干燥器上涂一层凡士林使其密封，用真空泵抽成真空，立刻关闭干燥器活塞
4、在干燥器底部预先装2.0克焦性没食子酸粉末，并斜置一烧杯，其中装有200ml20%KOH溶液，当抽气完毕关闭干燥器的活塞后，轻轻摇动干燥器，使烧杯倾斜使焦性没食子酸粉末与KOH溶液互相混合，此时容器中的氧便被吸收
5、在干净的玻璃平皿底面上预先称取1g焦性没食子酸，盖上一块无菌脱脂棉，加入10%NAOH1ml，使其缓慢均匀地流入脱脂棉的四周及中心，待脱脂棉呈棕色时，迅速将待用划线卵黄琼脂培养基扣紧，接口处用宽透明胶带贴数圈（不得有气泡，保证平整）
6、将干燥皿、干燥器放入恒温37.C的培养箱培养24小时即可。
四、实验结果
观察菌是否生长。
