肝切除模型小鼠急性肝损伤研究

第20卷第1期北华大学学报(自然科学版)Vol.20No.12019年1月JOURNAL OF BEIHUA UNIVERSITY(Natural Science)Jan.2019文章编号:1009-4822(2019)01-0055-04DOI :10.11713/j.issn.1009-4822.2019.01.011Con A 建立小鼠急性免疫性肝损伤模型研究单莹莹,王佳烨,王晓丽,于佳卉,王春梅,李㊀贺,孙红霞,张成义,陈建光,孙靖辉(北华大学药学院,吉林吉林㊀132013)摘要:目的㊀探讨刀豆蛋白A(Con A)诱导急性免疫性肝损伤小鼠模型的最适剂量及最佳给药途径.方法㊀选用雄性ICR 小鼠180只,分为尾静脉注射与腹腔注射两种给药途径,每个给药途径分为6组,对照组㊁Con A 10,20,30,40和50mg /kg 剂量组,Con A 各剂量组注射相应剂量的Con A,对照组注射生理盐水,在注射8h 后,检测各组血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的水平,采用苏木素-伊红(HE)染色法观察肝组织病理变化.结果㊀与对照组比较,腹腔注射Con A 各剂量组的ALT 和AST 水平无明显变化;尾静脉注射Con A 40mg /kg 剂量组的ALT 和AST 水平明显升高(P <0.05);组织学病理显示:肝损伤明显,Con A 10,20,30mg /kg 剂量组ALT 和AST 水平变化不明显,50mg /kg 剂量组死亡率较高.结论㊀小鼠尾静脉注射40mg /kg 的Con A 可成功诱导ICR 小鼠的急性肝损伤.关键词:刀豆蛋白A;免疫性肝损伤;小鼠中图分类号:R364.5文献标志码:A收稿日期:2018-05-13基金项目:吉林省科技计划项目(20170307016YY);吉林省教育科学技术研究项目(JJKH20180373KJ).作者简介:单莹莹(1994-),女,硕士研究生,主要从事抗炎免疫药理学研究,E-mail:a186********@;通信作者:孙靖辉(1979-),男,博士,副教授,主要从事抗炎免疫药理学研究,E-mail:sunjinghui2008@.Con A on Establishing Acute ImmunologicalLiver Injury Model in MiceShan Yingying,Wang Jiaye,Wang Xiaoli,Yu Jiahui,Wang Chunmei,Li He,Sun Hongxia,Zhang Chengyi,Chen Jianguang,Sun Jinghui(College of Pharmacy ,Beihua University ,Jilin 132013,China )Abstract :Objective To investigate the optimal dose and route of Con A administration on acute immunological liver injury in mice.Method 180ICR mice were divided into intraperitoneal and intravenous injection of two routes of administration.Each route was divided into control group,Con A 10,20,30,40,50mg /kg dose groups.The mice in Con A group were injected with Con A and those in control group were intraperitoneally injected with normal saline.After the administration for 8h,the levels of Aspartate aminotransferase (AST)and Alanine aminotransferase (ALT)were measured,the histomorphological liver were observed by hematoxylin and eosin (HE)stain.Results Compared with the control group,there were not significantly changed in the levels of AST and ALT by intraperitoneal injection.While in intravenous injection group,the levels of AST and ALT of mice in Con A 40mg /kg group were increased obviously and the histomorphological examination of liver indicated that there was an obvious injury,and those in Con A 10,20,30mg /kg groups were not significantly changed.The mortality rate was higher in 50mg /kg dose group.Conclusion Intravenous injection of 40mg /kg Con A can induce acute liver injury in ICR mice.Key words :Con A;immunological liver injury;mice㊀㊀肝脏疾病严重影响人类健康,目前进行肝脏疾病的治疗仍然是世界性的问题,建立与人类肝脏疾病病理机制相似的实验性肝损伤动物模型,有助于肝脏疾病发病机制的研究,因此,成功建立科学性㊁实用性㊁重现性良好的实验性肝损伤动物模型是研究肝病发生机制㊁筛选保肝药物㊁探索保肝作用的重要工具[1].近年来,国内外常用Con A建立急性免疫性肝损伤动物模型,而Con A的剂量并没有统一标准,干预时间也不一致,这对实验操作造成了一定的困难[2].为此,本研究以ICR小鼠为研究对象,观察尾静脉注射Con A建立急性肝损伤模型的适用剂量,为急性肝损伤模型建立时所用Con A的剂量选择提供参考.1㊀材料与方法1.1㊀实验动物雄性SPF级ICR小鼠(长春市亿斯实验动物技术有限公司,合格证号:SCXK(吉)2016-0003),体质量(22ʃ2)g.1.2㊀试剂与仪器刀豆蛋白A(Con A)Ⅳ型(美国Sigma公司);血清ALT,AST试剂盒(南京建成生物工程研究所);酶标仪(瑞士Tecan公司);荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS公司).2㊀实验方法2.1㊀动物分组及给药雄性ICR小鼠180只,分为尾静脉注射与腹腔注射两种给药途径,每个给药途径分为6组:对照组㊁Con A10,20,30,40,50mg/kg剂量组,每组15只.将Con A各剂量组注射相应剂量的Con A,对照组注射同等体积的生理盐水,给药后小鼠禁食不禁水8h,取血和肝脏待测.2.2㊀血清ALT,AST的测定将血液3000r/min㊁离心10min以获得血清,按试剂盒说明书进行AST和ALT检测,运用酶标仪于520nm处测定吸光度值.2.3㊀肝组织病理切片的制备将肝组织放置在配好的福尔马林溶液中固定,石蜡包埋,切片,苏木素-伊红(H&E)染色,于显微镜下观察肝组织病理改变.2.4㊀统计学分析应用SPSS19.0软件进行统计分析,所有值均以平均值ʃ标准差(ʏxʃs)表示,以P<0.05为差异具有统计学意义,从P<0.01为差异具有显著统计学意义.3㊀结㊀㊀果3.1㊀Con A注射后各组小鼠死亡数量尾静脉注射Con A10,20,30,40mg/kg剂量组在8h内小鼠死亡0只,50mg/kg剂量组8h内小鼠死亡8只,腹腔注射Con A剂量组8h内小鼠未见死亡.3.2㊀Con A对各组小鼠血清ALT,AST含量的影响与对照组比较,在尾静脉注射Con A剂量为10,20,30mg/kg时,血清中AST与ALT的水平无明显差异,Con A剂量为40和50mg/kg时,血清中AST与ALT的水平明显升高(P<0.01).见表1.与对照组比较,腹腔注射Con A各剂量组血清中ALT 与AST水平未见明显变化.见表2.表1㊀尾静脉注射不同剂量Con A对小鼠血清中AST 及ALT含量的影响Tab.1㊀Effect of different dosages of Con A on AST and ALT levels in miceλ/(U㊃L-1)组别n AST ALT对照组1552.63ʃ12.5235.23ʃ3.41 Con A10mg/kg1558.74ʃ0.7538.15ʃ7.38 Con A20mg/kg1563.96ʃ10.7143.09ʃ10.33 Con A30mg/kg1567.22ʃ10.8945.94ʃ12.80 Con A40mg/kg15164.79ʃ18.09∗∗140.27ʃ19.35∗∗Con A50mg/kg15214.69ʃ38.39∗∗233.25ʃ30.65∗∗㊀注:与对照组比较,∗:P<0.05;∗∗:P<0.01表2㊀腹腔注射不同剂量Con A对小鼠血清中AST 及ALT含量的影响Tab.2㊀Effect of different dosages of Con A on AST and ALT levels in miceλ/(U㊃L-1)组别n AST ALT对照组1547.57ʃ8.9330.30ʃ8.71 Con A10mg/kg1551.71ʃ14.3634.31ʃ15.29 Con A20mg/kg1544.76ʃ23.0633.46ʃ16.27 Con A30mg/kg1548.32ʃ18.4335.38ʃ24.87 Con A40mg/kg1548.97ʃ27.3640.71ʃ22.70 Con A50mg/kg1552.93ʃ29.3637.96ʃ15.93㊀注:与对照组比较,∗:P<0.05;∗∗:P<0.013.3㊀Con A对各组小鼠肝脏病理组织学的影响在200倍光镜下,对照组肝组织形态大小正常,肝小叶结构清晰.与对照组比较,尾静脉注射Con A10,20,30mg/kg剂量组未见明显异常,40和50mg/kg剂量组出现大量淋巴细胞浸润,中央静脉充血,且可见大量肝细胞核破裂和凋亡小体,65北华大学学报(自然科学版)第20卷并可见片状坏死,肝小叶失去正常结构,肝索排列紊乱[3].见图1.腹腔注射Con A 50mg /kg 剂量组出现少量淋巴细胞浸润,中央静脉少量充血并可见少量肝细胞坏死,而其他各剂量组均未见异常.见图2.A:Control;B:Con A 10mg /kg;C:Con A 20mg /kg;D:Con A 30mg /kg;E:Con A 40mg /kg;F:Con A 50mg /kg;a:中央静脉;b:淋巴细胞图1尾静脉注射不同剂量Con A 对小鼠肝组织形态学的影响Fig.1Effect of different doses of Con A on morphology of liver tissue inmiceA:Control;B:Con A 10mg /kg;C:Con A 20mg /kg;D:Con A 30mg /kg;E:Con A 40mg /kg;F:Con A 50mg /kg图2腹腔注射不同剂量Con A 对小鼠肝组织形态学的影响Fig.2Effect of different doses of Con A on morphology of liver tissue in mice4㊀讨㊀㊀论Con A 作为一种植物凝集素,具有促进有丝分裂的作用,可以激活T 淋巴细胞,引起T 细胞介导的肝损伤,其损伤具有特异性和剂量依赖性[4].利用Con A 诱导小鼠特异性肝损伤模型是最近几年来新发展起来的,它的建立和应用为深入研究肝损伤发病机制以及对治疗药物筛选提供了非常方便和理想的试验动物模型[5].ALT 与AST 对肝脏疾病的检测有重要意义,ALT 存在于肝细胞胞质,AST 存在干细胞胞质与线粒体[6].当干细胞受损时,大量AST 与ALT 被释放入血,血清中的ALT 与AST 可以间接地反映肝脏受损程度,是最为经典的肝损伤检测指标[7].近年来,大量研究报道了Con A 诱导免疫性肝损伤动物模型的建立,但给药途径和注射剂量有很大差异,张炜等[8]研究发现:小鼠腹腔注射20mg /kg 的剂量能够成功建立急性肝损伤模型,马静[9]的研究结果表明:BALB /C 小鼠尾静脉注射11mg /kg 的Con A 可成功诱导肝损伤,刘悦晖等[10]研究结75第1期单莹莹,等:Con A 建立小鼠急性免疫性肝损伤模型研究果表明:尾静脉注射Con A20mg/kg能够成功诱导BALB/C小鼠的肝脏损伤.在本研究中,通过腹腔注射和静脉注射两种给药途径,结果显示:小鼠尾静脉注射40mg/kg的Con A后可见大量肝细胞凋亡坏死和明显的淋巴细胞浸润现象,并且血清中AST和ALT转氨酶水平明显升高,虽然50mg/kg的Con A也可引起明显的肝脏损伤,但死亡率较高.腹腔注射Con A的各个剂量组血清中AST和ALT水平均未出现明显变化,且组间数据离散程度较大,表明腹腔注射给药途径存在不稳定因素,不适宜进行进一步推广.于慧杰等[2]研究也证明了这一结果.因此,ICR小鼠尾静脉注射Con A40mg/kg建立急性免疫性肝损伤实验模型,具有稳定性高㊁死亡率低㊁损伤明显等特点,能够为今后急性免疫性肝损伤模型的建立提供参考.参考文献:[1]李红,于慧杰,盛国光.刀豆蛋白A诱导的C57BL/6J小鼠急性免疫性肝损伤模型的研究[J].中西医结合肝病杂志,2016,26(2):93-95,131.[2]于慧杰,李红,郭明星,等.ConA不同给药途径所致C57小鼠急㊁慢性肝损伤模型的建立与比较[J].湖北中医药大学学报,2014,16(4):5-7.[3]周琼,刘芳萍,刘颖姝,等.四氯化碳致小鼠急性肝损伤动物模型建立方法的研究[J].东北农业大学学报, 2012,43(6):77-81.[4]Kaneko Y,Harada M,Kawano T,et al.Augmentation of Vα14NKT cell mediated cytotoxicity by interleukin4in an autocrine mechanism resulting in the development of concanavalin A induced hepatits[J].J Exp Med,2000, 191(1):105-114.[5]Tiegs G,Hentschel J,Wendel A.A T cell-dependent experimental liver injury in mice inducible by concan-avalin A[J].Journal of Clinical Investigation,1992, 90(1):196-203.[6]张雯,黄磊,陈叶香,等.复方龙垂草水煎剂对CCl4致小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中药新药与临床药理,2015,26(3):280-284.[7]刘慧敏,韩延忠,郭玉明,等.六味五灵片对刀豆蛋白A诱导的小鼠急性免疫性肝损伤的保护作用研究[J].中国药理学通报,2017,33(1):133-140. [8]张炜,陈明,傅涓涓.不同剂量刀豆蛋白A诱导Balb/c小鼠肝纤维化的量效关系[J].徐州医学院学报, 2007,27(6):375-378.[9]马静.刀豆蛋白A致肝损伤模型条件优化及痰热清注射液对其保护作用研究[A].中国毒理学会中药与天然药物毒理专业委员会.中国毒理学会中药与天然药物毒理专业委员会第一次(2016年)学术交流大会论文集[C].中国毒理学会中药与天然药物毒理专业委员会,2016:2.[10]刘悦晖,范学工,李宁,等.刀豆球蛋白A所致实验性肝损伤模型的构建[J].中国感染控制杂志,2008,7(5):297-301.ʌ责任编辑:陈丽华ɔ85北华大学学报(自然科学版)第20卷。

② 激活Kupffer细胞、中性粒细胞、吞噬 细胞和单核细胞通过细胞膜上NADPH氧 化酶，释放大量氧自由基 ③ 缺血、缺氧可使细胞色素氧化酶功能失 调，使细胞内线粒体膜电势丧失，呼吸 链功能障碍电子传递链电子漏率增加， 从而促进氧自由基的产生
氧自由基对肝细胞损伤机制主要有： ①氧自由基对细胞膜双分子层磷脂结 构中的重要脂类进行氧化作用，生成 多种脂质过氧化物，超氧化物和过氧 化物促进铁蛋白释放铁，使其与过氧 化氢反应形成羟自由基，从而直接损 伤细胞
顺高浓度差进入细胞内
钙超载是肝细胞损伤关键机制之一： ① 激活Ca2+依赖蛋白酶，破坏细胞骨架与 胞膜联接的完整性 ② 激活Ca2+依赖磷脂酶C和磷脂酶A2, 使 双分子层结构紊乱破坏膜性结构 ③ 线粒体钙超载使其膜电位丧失，氧化磷 酸化脱偶联，引起严重能量代谢障碍， 并促进了氧自由基的产生，这些终致细 胞不可逆损伤
Stansby观察12例人类供肝在冷保存期间及 灌注后，短期供肝内的ET-1浓度均显著的 高于正常水平，Textor临床研究结果类似 上述结果提示，在肝脏缺血再灌注过程中， 肝窦内皮细胞合成及分泌ET的能力明显增 强。这可能是因为一方面缺氧及胞浆内 Ca2+浓度升高可促使内皮细胞产生ET，另 一方面在再灌注短期内由门静脉进入肝脏 的肠源性内毒性也可刺激内皮细胞产生ET
Kupffer细胞触发的炎症反应导致局
部组织炎症，表现为轻度的肝酶或胆红素
升高。这种肝缺血性损害常被临床忽视，
而机械通气、全静脉营养、儿茶酚胺等药
物的使用更加重休克肝损伤。肝损伤影响
危重病患者的死亡率，因此对肝损伤的早
期发现在临床上至关重要
治疗 急性肝损害肝继发于失血、大手术、 呼吸衰竭、二重感染、或休克，持续的微 循环衰竭、全身炎症反应过度激活及ICU治 疗策略的副作用均促进其发病。对其早期 认识，可降低死亡率

肝损伤动物模型的研究进展肝损伤是指肝脏受到各种原因引起的不同程度损害的病理过程。

肝损伤的研究对于深入了解肝脏病理生理学机制、发现新的治疗靶点和开发新的药物具有重要意义。

动物模型是肝损伤研究的重要手段之一，通过构建适用的动物模型，可以模拟人类肝损伤的发生和发展过程，为肝损伤的基础研究和临床治疗提供有力支持。

常用的肝损伤动物模型包括化学性损伤模型、物理性损伤模型和生物学性损伤模型。

化学性损伤模型是利用特定的化学物质对动物肝脏进行损伤，常用的化学物质有四氯化碳、二乙二酸、乙醇和亚硝酸等。

物理性损伤模型是通过不同的物理因素对动物肝脏造成损伤，常见的有手术切除、缺血再灌注和冷冻等。

生物学性损伤模型是利用病原体感染、毒素作用或基因突变等因素引起肝损伤。

在化学性损伤模型中，四氯化碳（CCl4）是常用的肝损伤诱导剂。

CCl4会在肝脏中产生活性氯自由基，进而导致肝细胞膜的破坏和肝细胞损伤。

研究表明，CCl4模型可以模拟急性和慢性肝损伤的发生和发展过程。

在物理性损伤模型中，手术切除是常用的研究方法，通过肝叶的摘除可以模拟肝切除术后的肝再生和组织损伤修复过程。

在生物学性损伤模型中，病原体感染模型是研究肝炎和肝硬化等感染性肝损伤的重要手段。

近年来，肝损伤动物模型的研究得到了广泛关注，取得了一系列重要进展。

利用基因编辑技术构建特定基因敲除或过表达的动物模型，可以探究特定基因在肝损伤中的功能和作用机制。

使用CRISPR/Cas9技术敲除一些促炎因子基因，可以研究这些基因在非酒精性脂肪性肝病和肝纤维化中的作用。

利用转基因和基因表达技术构建特定基因表达的动物模型，可以模拟人类肝病的发病机制和临床表现。

构建APOE敲除小鼠模型，可模拟人类高脂血症和动脉粥样硬化的发生过程。

利用大型动物模型，如猪、猴等，可以更好地模拟人类的肝损伤，并提高疗效和安全性的评价。

猪模型可以模拟人类慢性肝炎病毒感染和肝硬化的发展过程。

肝损伤动物模型的研究已经取得了重要进展。

急性肝损伤模型的研究进展作者：刘彦双朱淑霞王永利作者单位：050200 河北省石家庄市卫生学校（刘彦双）;河北武警总队医院（朱淑霞）;河北医科大学药理教研室（王永利）【关键词】急性肝损伤肝损伤实验动物模型的复制是进行防治肝损伤药物研究的前提。

目前，肝损伤动物模型的复制主要有生物性、免疫性、化学性等方法，生物学方法要求实验条件高且费用昂贵，限制了应用。

免疫方法是造成免疫肝损伤，主要用于通过免疫机制而抗肝损伤的药物研究。

化学方法则是通过化学性肝毒物质，如四氯化碳、氨基半乳糖、硫代乙酰胺、黄曲霉素等致肝损伤。

在我国卫生部颁布的《中药药理实验指导原则》中明确指定应用四氯化碳和氨基半乳糖肝损伤动物模型进行保肝降酶新药的药理实验，应用四氯化碳和氨基半乳糖复制肝损伤动物模型，条件要求低，技术易于掌握，可靠性强，重复性好，是其他任何肝损伤模型无法比拟的，故目前研究抗肝损伤新药常采用四氯化碳和氨基半乳糖复制动物模型。

1 化学性肝损伤动物模型1.1 四氯化碳性肝损伤四氯化碳（CCl4 ）溶于精致植物油，配制0.1%浓度，按10ml.kg小鼠腹腔注射，12～24h后处死动物。

测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红质（TB）、总蛋白（TP）、白蛋白（A）、，肝匀浆脂质过氧化物（LPD）或丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）或还原性谷胱甘肽（GSH）等反映肝功能及脂质过氧化的指标，并进行组织病理学检查。

关于CCl 4 肝毒的作用机制，存在多种假设，但都一致公认，自由基的形成及引发的链式过氧化反应是其主要机制。

CCl 4在体内可经肝微粒体细胞色素P450 代谢激活，生成两个活性自由基（CCl 3 O 2 和Cl）及一系列氧活性物，可与肝细胞质膜或亚细胞结构的膜脂质发生过氧化反应，膜磷脂大量降解，从而破坏细胞膜结构完整性，引起膜通透性增加，最终导致肝细胞死亡［1］。