肌糖原酵解
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肌糖原酵解
【实验目的】
1.了解糖酵解作用在糖代谢过程中的地位及生理意义。
2.学习鉴定糖酵解作用的原理和方法。
3.了解有关组织代谢实验应注意的一些问题。
【实验原理】
在动物、植物、微生物等许多生物机体内,糖的无氧分解几乎都按完全相同的过程进行。
本实验以动物肌肉组织中肌糖原的酵解过程为例。
肌糖原的酵解作用,即肌糖原在缺氧的条件下,经过一系列的酶促反应,最后转变成乳酸的过程。
肌肉组织中的肌糖原首先磷酸化,经过己糖磷酸酯、丙糖磷酸酯、甘油磷酸酯、丙酮酸等一系列中间产物,最后生成乳酸。
该过程可综合成下列反应式:
(1/n)(C6H10O5)n+H2O 2CH3CHOHCOOH
肌糖原的酵解作用是糖类供给能量的一种方式。
当机体突然需要大量的能量,而又供氧不足(如剧烈运动时),则糖原的酵解作用可暂时满足能量消耗的需要。
在有氧条件下,组织内糖元的酵解作用受到抑制,而有氧氧化则为糖代谢的主要途径。
糖原酵解作用的实验,一般使用肌肉糜或肌肉提取液。
在用肌肉糜时,必须在无氧条件下进行;而用肌肉提取液,则可在有氧条件下进行。
因为催化酵解作用的酶系统全部存在于肌肉提取液中,而催化呼吸作用(即三羧酸循环和氧化呼吸链)的酶系统,则集中在线粒体中。
糖原或淀粉的酵解作用,可由乳酸的生成来观测。
在除去蛋白质与糖后,乳酸可以与硫酸共热便成乙醛,后者再与对羟基联苯反应生成紫罗兰色物质,根据颜色的显现加以鉴定。
该法比较灵敏,每毫升溶液含1~5ug乳酸即给出明显的颜色反应。
若有大量糖类和蛋白质等杂质存在,则严重干扰测定,因此实验中应尽量除尽这些物质。
另外,测定时所用的仪器应严格地洗干净。
【实验器材及试剂】
1. 材料:兔的肌肉糜
2. 试剂:
1)1/15mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)
2)对羟基联苯试剂:称取对羟基联苯1.5g溶于100ml 0.5%NaOH中,配成1.5%的溶
液。
若对羟基联苯颜色较深,应用丙酮或无水乙醇重结晶,放置时间较长后,会出
现针状结晶,应摇匀后使用。
3)0.5%淀粉溶液
4)液体石蜡
5)饱和CuSO4溶液
6)Ca(OH)2粉末
7)20%三氯乙酸
8)浓硫酸
3. 器材:
试管及试管架;移液管;电子天平;滴管;玻璃棒;恒温水浴锅;漏斗;烧杯;滤纸;量筒;旋涡搅拌器
【操作方法】
一、处死动物和制备肌肉糜
二、肌肉糜的糖酵解
取4支试管,编号后各加入新鲜肌肉糜0.5克。
1、2号管为样品管,3、4号管为空白管。
向3、4号空白管内加入20%三氯乙酸3mL,用玻璃棒将肌肉糜充分打散,搅匀,以沉淀蛋白质和终止酶的反应。
然后分别向4支试管内加入3mL磷酸缓冲液和1mL0.5%淀粉溶液。
用玻璃棒充分搅匀,加液体石蜡以隔绝空气,并将4支试管同时放入37℃恒温水浴中保温。
1h后,取出试管,去石蜡油,立即向1、2号试管内各加入20%三氯乙酸3mL,充分混匀,过滤,弃沉淀,各取5mL滤液。
然后向每管内加入饱和硫酸铜溶液1mL,混匀,再加入0.4克氢氧化钙粉末,充分搅匀放置10min,使还原糖沉淀完全,过滤,保留滤液。
三、乳酸的测定
取4支洁净、干燥试管,编号,各加入浓硫酸2mL ,将试管置于冰水浴中冷却,分别取每个样品的滤液1~2滴,逐滴加入到已冷却的浓硫酸溶液中,随加随摇动试管,避免试管内的溶液局部过热。
将每个试管混合均匀后,放入沸水浴中煮5min ,加入对羟联苯试剂1或2滴,混匀试管内容物,比较和记录各管溶液的颜色深浅。
【实验结果】
实验结果如下图
图1 肌糖原酵解实验结果(从左到右依次为1、2、3、4号试管)
1、2号试管(样品)溶液变为紫罗兰色,3、4号试管(空白)溶液为无色,说明样品管内发生肌糖原的酵解。
本次实验很成功。
样 品
空 白
试管编号 1 2 3 4 肌肉糜 0.5g 0.5g 0.5g 0.5g 20%三氯乙酸 3ml 3ml 磷酸缓冲液 3ml 3ml 3ml 3ml 0.5%淀粉溶液
1ml
1ml
1ml
1ml
充分搅拌,液体石蜡封口,37℃水浴1h ,去石蜡油
20%三氯乙酸
3ml 3ml
取4支试管过滤,弃沉淀,各取5ml 滤液
饱和CuSO 4 1ml 1ml 1ml 1ml Ca(OH)2粉末
0.4g 0.4g
0.4g
0.4g
充分搅拌,放置10min ,不时搅动,分别过滤,弃沉淀
【注意事项】
1. 对羟基联苯试剂一定要经过纯化,使成白色。
2. 在乳酸测定中,试管必须洁净、干燥,防止污染,影响结果。
所用滴管大小尽可能一致,减少误差。
若显色较慢,可将试管放入37℃恒温水浴中保温10min,再比较各管颜色。
3. 在3、4号试管中加入三氯乙酸后,一定要将肌肉糜充分打散,搅匀,以使酶完全失活,使其不能进行糖酵解过程。
【讨论】
实验成功的两个关键步骤:
(1)向空白管加入20%三氯乙酸。
20%三氯乙酸的作用是使肌肉糜失活,这一步一定要保证肌肉糜完全失去活性,以增强最终显色的比色效果,判定肌肉糜失活的标识是肌肉糜呈惨白色,无血色。
(2)加入饱和CuSO4和Ca(OH)2粉末。
加入饱和CuSO4和Ca(OH)2粉末的作用是去除反应体系中的糖和蛋白质,对羟基联苯反应非常敏感,若体系中含有糖和蛋白质,可能会对以后的颜色鉴别产生影响,因此这步非常关键。