细胞色素氧化酶染色液(联苯胺法)使用说明

酶免疫细胞化学染色操作指南-1一、材料和试剂1、玻片：须用免疫组化专用玻片，或用2%多聚赖氨酸包被处理玻片。

2、5-10%正常山羊血清封闭液，用PBS配。

3、3%牛血清白蛋白（BSA），用PBS配。

4、0.01M pH7.4 PBS5、1% BSA-PBS（含0.05% Tween20）6、AEC底物（1）底物缓冲液（20X） PH 4.6醋酸（分子量60.6） 30.6mlTriton X-100醋酸钠 3H2O（分子量136.1）66.68克加蒸馏水到960ml，调pH到4.6，最后加蒸馏水到总体积1000ml。

（2）AEC（20X）AEC 15mg/ml，溶在DMF（二甲基甲酰胺，分子式HCOH(CH3)2 分子量73. 10中）（3）0.6% H2O2（20X）临用时，（1）（2）（3）各50ul，在1ml双蒸馏水中混匀30分钟内有效。

7、DAB（即DAB-4HCL）（1）1.5克DAB在100ml水溶液中（20X）（2）1M Tris（20X），用HCl调PH到7.4（1）（2）（3）各滴加入1ml二蒸水中，新鲜配，避光，30分钟内有效。

溶解后（可加热到50℃），加水合氯醛50克（水合氯醛Chloral H yclrate，分子量165.4），枸橼酸1克，充分溶解，于棕色瓶中，室温或400C保存。

8、苏木素复染液苏木素 1克碘酸钠 0.2克钾矾 50克水 1000ml9、含10%及2%小牛血清的DMEM培养液。

10、3% H2O2：30% H2O21份，加9份双蒸水，临用时配。

11、细胞抗原玻片及96孔细胞抗原板12、封片液：1克明胶，溶于30ml 35℃水中，加入35ml甘油（或用甘油封片）和650mg石碳酸（先溶于0.6ml水中）。

二、细胞内源过氧化物酶阻断（使用HRP标记二抗或SP法时必须阻断）1、从冰箱取出细胞片或细胞板，置室温或37℃ 10-15分钟，使恢复温度。

医院检验中心过氧化物酶(POX)染色操作规程[原理]粒细胞和单核细胞脑浆内含过氧化物酶，能借助受体(联苯胺)脱氢催化过氧化氢而释放新生氧。

受体被氧化成联苯胺蓝。

再与亚硝基铁氰化钠结合成稳定的蓝色颗粒而沉淀于脑浆内。

[试剂]1．联苯胺溶液：联苯胺0．38，加36％亚硝基铁氰化钠溶液1ml，再取95％乙醇加到100ml，水浴加热助溶。

贮于棕色瓶中，可保存数月。

工作时应小心溶液污染皮肤。

2.稀双氧水：临用前将30％双氧水用蒸馏水1：80稀释。

[操作](1)新鲜干燥血片或骨髓片，加联苯胺液5—8滴，使布满整张涂片，固定1—2分钟。

(2)加等量稀双氧水，用吸球吹吸，使两液混匀，作用4—8分钟。

(3)涂片用流水冲洗。

待干后再用瑞氏染液复染，复染时间约30分钟。

[结果观察]可报告阳性程度或阳性细胞％。

阴性：无蓝色颗粒和蓝色物质。

弱阳性：蓝色颗粒量少且细小，相当于(十)。

阳性：‘蓝色颗粒量多，粗细不一。

相当于(++)。

强阳性：细胞充满粗大紧密蓝色颗粒。

相当于(+++）。

[临床意义](1)粒系统细胞除早期原粒细胞阴性外，晚期原粒细胞及以下各阶段细胞均含有不同程度的蓝色颗粒。

嗜酸性粒细胞颗粒更粗大，呈深蓝色。

嗜碱性细胞为阴性。

(2)单核细胞中，除早期原始阶段外，皆呈弱阳性反应，其颗粒细小稀疏。

(3)某些网状细胞及吞噬细胞可呈不同程度的过氧化物酶阳性反应。

(4)所有淋巴细胞过氧化物酶染色皆为阴性。

(5)该化学染色是区别急性淋巴细胞性白血病和急性非淋巴细胞性白血病的关键化学染色。

FAB分型规定前者阳性率＜3％。

[附注](1)联苯胺溶液若明显变色发绿，应重新配制。

(2)亚硝基铁氰化钠溶液也可在临用前取0．368溶解于1ml蒸馏水中，加热助溶后应用。

(3)双氧水浓度若过高，则有抑制酶作用。

双氧水浓度太高、制片太厚、涂片冲洗不净以及粒细胞破坏过多，可造成假阳性。

涂片中粒细胞若看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即示双氧水过浓。

氧化酶试剂，氧化酶试纸产品使用参见华越洋随带产品包装随带纸质说明书氧化酶试剂，氧化酶试纸产品介绍:英文名称： Oxidase reagent产品用途：用于O157:H7菌氧化酶试验，以及其他病理类菌属检测鉴别。

氧化酶试剂，氧化酶试纸使用方法：取一条滤纸，沾取试验菌的菌落少许。

然后加一滴1%的四甲基对苯二胺试剂，仅使滤纸湿润，不可过湿，在10s内出现红色者为阳性，10—60s 呈现红色者为延迟反应，60s以上出现红色者，按阴性处理，铁可催化试剂，不能使用，可用白金丝或玻璃棒取菌。

保存：2-8℃避光保存氧化酶试剂，氧化酶试纸氧化酶（oxidase）过氧化物酶体中的主要酶类，氧化酶约占过氧化物酶体酶总量的一半，包括：尿酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶和L-α-羟基酸氧化酶等。

各种氧化酶作用于不同的底物，其共同特征是氧化底物的同时，将氧还原成过氧化氢：RH2 + O2 →R + H2O2实验试剂：1%盐酸二甲基对苯二胺溶液：少量新鲜配制，干冰箱内避光保存。

1%α-萘酚－乙醇溶液。

试验方法：取白色洁净滤纸沾取菌落。

加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深；再加α-萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。

阴性于两分钟内不变色。

以毛细吸管吸取试剂，直接滴加于菌落上，其显色反应与以上相同。

氧化酶试验(oxidasetest)氧化酶又名细胞色素氧化酶、细胞色素氧化酶C或呼吸酶。

试验用于检测细菌/是否有该酶存在。

原理是氧化酶在有分子氧或细胞色素C存在时，可氧化四甲基对苯撑二胺出现紫色反应。

假单胞菌属、气单胞菌属等阳性，肠杆菌科阴性，可区别。

血浆凝固酶：由金黄色葡萄球菌致病性菌株产生。

能使含有抗凝剂的人或兔血浆发生凝固。

在感染部位由于凝固酶的产生，使体液中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白，沉积于细菌表面，可阻碍吞噬细胞对细菌的吞噬和杀灭作用。

凝固酶试验(coagulase test)原理：致病性葡萄球菌→凝固酶→血浆中纤维蛋白原(液态) 纤维蛋白(固态) →血浆凝固方法：①玻片法：检测结合凝固酶②试管法：检测游离凝固酶应用：作为鉴别葡萄球菌致病性的重要指标。

过氧化物酶染色标准操作程序1.检验目的通过对血细胞内过氧化物酶的染色测定，可用于白血病细胞的鉴别与分型。

2.检测原理血细胞内过氧化物酶（POX）能将无色的二氨基联苯胺的氢原子转移给过氧化氢，使前者变为有色染料沉积在细胞质酶所在部位。

1.标本新鲜的骨髓细胞涂片及血液细胞涂片。

2.试剂联苯胺液(A液)、H2O2(B液) 、瑞姬氏染液(C液) 、磷酸盐缓冲液(D液) 3.环境和安全5.1环境温度要求：2~8℃保存,有效期12个月。

5.2安全控制：工作中所有与病人的样本接触或有潜在性接触可能的样本都视为污染物。

在操作时有必要穿戴保护性的工作服、外套和手套。

在处理废弃样本时不可触摸废弃物，一定戴手套和护目镜以避免直接接触。

如果操作人员不小心接触血液、试剂、废弃物/皮肤或衣物上沾到了样本、试剂及废液，用大量清水冲洗并适当考虑必要的医疗措施。

4.操作步骤6.1新鲜的涂片滴加A染色液数滴(以覆盖涂片为宜),再滴加B染色液数滴(A 液:B液=1:1),混合后室温染色5~10分钟,流水冲洗2分钟，待干。

6.2然后用瑞姬氏染色(C液)与磷酸盐缓冲液(D液)1:2比例混合，对其染色3~5分钟,流水冲洗,干后镜检。

7.检验结果解释阴性------胞质内无沉淀物（无色）阳性------胞质内出现棕黄或蓝黑色沉淀物8.实验室临床解释8.1粒细胞系统呈集中状颗粒强阳性反应，单核细胞系统呈弥散状颗粒弱阳性反应，部分原始单核细胞可呈阴性反应。

8.2淋巴细胞系、红细胞系、巨核细胞系、浆细胞系等均为阴性反应。

8.3在白血病细胞的鉴别与分型中的应用：强阳性提示：FAB中的M1，M2，M3；部分强阳性与弥散状弱阳性提示：FAB中的M4；弥散状弱阳性提示：FAB中的M5；阴性提示：FAB中的M0，M5，M6，M7，ALL等。

9.变异潜在来源若样本采集后不能及时测定，可采用95%乙醇固定2分钟后，可保存数天。

宜可使用某些抗凝血（肝素、EDTA），样本在未染色前切勿沾有甲醇和氧化剂类试剂，以免细胞内的过氧化物酶被抑制或破坏。

广州市外显子生物技术有限公司
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苯胺蓝染色液
产品说明：
苯胺蓝染色液是 Masson 三色染色试剂盒的组成之一。

苯胺蓝染色液主要有苯胺蓝、弱酸等组成，呈酸性，常与丽春红品红染色液等配合使用对胶原纤维进行染色，染色后肌纤维呈红色，胶原纤维呈蓝色，主要用于区分胶原纤维和肌纤维。

产品组成：
货号 产品 规格 储存条件 S-1528 苯胺蓝染液 100ml
2-4℃ -- 说明书
1份
有效期：12个月 操作步骤(仅供参考)： 以Masson 三色染色为例 1.切片脱蜡至水。

2.Weigert 铁苏木素使用前（Weigert 铁苏木素 A 、 B 液等比例混合）。

染 10-20 分钟，流水稍洗。

3.盐酸酒精分化，流水冲洗数分钟。

4.丽春红酸性品红染液染 5-10 分钟，蒸馏水稍冲 洗。

5.磷钼酸溶液处理约 5 分钟，去掉溶液，不用水洗， 直接用苯胺蓝染液复染 5 分钟。

6.1%冰醋酸处理 1 分钟，95%酒精脱水。

7.无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。

注意事项：
1. 切片脱蜡应尽量干净。

2. 切片入苯胺蓝染色液染色前不要水洗，否则可能出现不着色。

3. 不同染色参照具体的实验要求。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作 染色结果：
神经节组织×400 结果判定：主要用于神经组织、细胞、结缔组织的染色，使胶原纤维呈蓝色。

酶类染色液北京华越洋生物------------------------------------------------------碱性磷酸酶染色液(改良Gomori钙钴法) 3×50ml 酶类染色40% 4℃,避光,3个月碱性磷酸酶染色，适用于石蜡切片属于金属沉淀法,碱性磷酸酶活性出呈棕黑色,可能出现假阳性,采用阴性对照。

二甲苯应采用AR以上级别。

碱性磷酸酶染色液(改良Gomori钙钴法) 3×100ml 酶类染色40% 4℃,避光,3个月碱性磷酸酶染色，适用于石蜡切片属于金属沉淀法,碱性磷酸酶活性出呈棕黑色,可能出现假阳性,采用阴性对照。

二甲苯应采用AR以上级别。

碱性磷酸酶-PAS联合染色液6×50ml 酶类染色40% 4℃,避光,3个月碱性磷酸酶染色与过碘酸雪夫试剂合用,同时显色碱性磷酸酶和PAS阳性物质。

适用于冰冻切片、石蜡切片,碱性磷酸酶活性部位呈黑色,PAS阳性物质呈紫红色。

染色过程中注意控制过碘酸处理的时间,否则容易褪色。

中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP) 4×2ml 酶类染色40% 4℃,避光,6个月专门用于血液或骨髓细胞涂片的中性粒细胞的碱性磷酸酶染色,又称同时偶联法。

碱性磷酸酶活性部位呈蓝色,位于胞桨中。

油镜下计数100个中性粒细胞,求出百分比和积分。

非特异性反应少，结果可靠。

中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP) 4×10ml 酶类染色40% 4℃,避光,6个月专门用于血液或骨髓细胞涂片的中性粒细胞的碱性磷酸酶染色,又称同时偶联法。

碱性磷酸酶活性部位呈蓝色,位于胞桨中。

油镜下计数101个中性粒细胞,求出百分比和积分。

非特异性反应少，结果可靠。

碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法) 4×2ml 酶类染色40% —20℃,避光,6个月用于石蜡切片、冰冻切片、骨髓细胞涂片、血液涂片等的碱性磷酸酶染色,又称同时偶联法碱性磷酸酶活性部位呈蓝色,位于胞桨中。

南京森贝伽生物科技有限公司 网址：/第1页 仅供科研版本号：171024过氧化物酶染色液(联苯胺法)【产品组成】【保存条件】4℃,避光 ,6个月【产品概述】过氧化物酶(Peroxidase ，简称POX 或MPO)是由微生物或植物所产生的一类能催化很多反应的以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶氧化还原酶，主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。

过氧化物酶染色液(联苯胺法)是ICSH 推荐采用的POX 染色液，其原理是细胞内的过氧化物酶能将无色的3,3-二氨基联苯胺(DAB)的氢原子传递给过氧化氢，使前者催化成有色染料沉积在细胞质中的POX 所在部位。

该染液可用于血液、骨髓或细胞涂片过氧化物酶染色,POX 活性部位呈棕黄色。

【使用方法】1、血液、骨髓或细胞涂片滴加预冷的BFA 固定液，4℃固定30～60s ，稍水洗。

2、滴加配制好的POX 孵育液，室温(20～25℃)避光孵育10～15min ，水洗2min 。

3、滴加WG 染色液，孵育30～60s 。

4、直接滴加等量WGbuffer ，染色10～15min 。

5、水洗、晾干、镜检。

【染色结果】粒细胞系除早期原粒细胞阴性外，分化好的原粒细胞以下阶段细胞随细胞成熟而阳性反应增强，衰老中性粒细胞反应程度减弱单核细胞系弱阳性，淋巴细胞系为阴性。

浆细胞及巨核细胞均为阴性。

嗜酸性粒细胞和Auer 小体呈强阳性反应。

阳性反应强度的判断：【临床意义】1、急性粒细胞白血病晚期的原粒细胞呈阳性，颗粒较少且大。

2、急性单核白血病细胞呈阴性或弱阳性，颗粒小且稀疏。

3、单核急性白血病呈阴性或弱阳性。

4、急性早幼粒白血病呈强阳性，某些早幼粒细胞呈阳性，恶性组织细胞呈阴性。

5、急性淋巴细胞白血病呈阴性。

【注意事项】1、血液或骨髓涂片应新鲜，薄厚适宜，及时固定，否则会影响酶的活性。

2、POX孵育液易失效或降低阳性强度，即配即用，不宜久置。

Calcein-AM/PI 活细胞/死细胞双染试剂盒说明书货号：CA1630规格：500T保存：-20°C 避光干燥保存，一年有效。

产品内容：名称规格保存Calcein-AM Solution(2mM)50μL -20°C 避光干燥保存PI Solution （1.5mM ）150μL -20°C 避光干燥保存10×Assay Buffer 50mL -20℃保存，经常使用可放在4℃保存。

产品说明：Calcein-AM 是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光（Ex=490nm,Em=515nm ）。

因其在传统的Calcein （钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM ）基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。

一旦进入细胞后，Calcein-AM （本身不发荧光）被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein ，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。

与其它同类试剂（如BCECF-AM 和CFDA)相比，由于Calcein,AM 细胞毒性极低，是最适合用于活细胞染色的荧光探针，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。

由于死细胞缺乏酯酶，Calcein-AM 仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。

因此，Calcein-AM 常常与死细胞荧光探针如碘化丙啶（PI ）等联合使用，同时进行活细胞和死细胞的荧光双重染色。

碘化丙啶（Propidium iodide ，PI ）不能穿过活细胞的细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA 双螺旋从而产生红色荧光（Ex=535nm,Em=617nm ），因此PI 仅对死细胞染色。

由于Calcein 和PI-DNA 都可被490nm 激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。

而用545nm 激发，仅可观察到死细胞。

本试剂盒的工作原理就在于Calcein-AM 和PI 的双重染料，来进行活细胞和死细胞的双重染色标记，从而进行活细胞和死细胞水平的分析。