分子荧光光谱法-课件(PPT·精·选)

光致发光（Photoluminescence）: 荧光和
磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时 的发光现象.
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低 振动能级回到基态所发出的辐射。
磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基 态所发出的辐射。
1~3 ;
荧光分析法的特点
★★★
因应能试
为用提样
有范供用
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
☆振动驰豫 (Vibrational relaxation)
☆荧光发射(Fluorescence)
荧光分析法的应用
无机物分析 无机离子中除少数例外一般不发荧光.但很多 无机离子能怀一些有机试剂形成荧光络合物,而进行定量 测定.
生物化学及生理医学方面的应用 荧光法对于生物中许多 重要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性,故广用 于生物化学分析,生理医学和临床分析.
药物分析
目前还采用荧光分光光度计作为高效液相色谱,薄层色谱 和高效毛细管电泳等的检测器,使有效的分离手段与高灵 敏度,高选择性的测定方法结合起来,可用于测定复杂的混 合物.
荧光与环境因素的关系
★温度降低会使荧光强度增大； ★PH 带有酸性或碱性取代基的芳 香化合物的荧光与pH有关； ★溶剂 溶剂极性增加有时 会使荧光强度增加，荧光波长红移； 若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧 光物质电离状态改变，会使荧光强度 、荧光波长改变；含重原子的溶剂 （碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱。 ★溶解氧的存在往往使荧光强度 降低。 ★激发光的照射

O
CC
3b
Counts
60000 40000
O C 2H 5
20000
0 300 350 400 450 500 550 600
Wavelength (nm)
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8
从图可看出激发光谱同荧光光谱大致成
镜相对称 a.荧光光谱(发射光谱）形状与基态S0振能级的分布情况（即能量间
隔情况）有关 b. 激发光谱(吸收谱)形状与激发态S1振动能级的分布有关 c. S0、、S1态中振动能级的分布是相似的(说明峰形状相 似）
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一般情况下，多采用相对灵敏度来表示。相对灵敏度是以喹啉硫酸氢 盐的0.05mol/L硫酸溶液为标准，并定为1，然后与相同浓度荧光物 质的荧光强度比较，可求该物质的相对灵敏度。
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3. 荧光分析法的选择性 很多分子在紫外可见区有吸收，但其中
只有一部分能再发射荧光或磷光，故荧光法 固有干扰很少，选择性较好。
b. 荧光物质的激发态分子M*与基态分子M形成激发态的二聚体（M*M）。
c. 基态的荧光物质分子的缔合。荧光自猝灭是与浓度有关的效应，因而 通过在荧光测定前稀释溶液的办法，可避免这一现象的发生，或减 小它所产生的影响。
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三、发光强度同浓度的关系
荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产
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❖ 3、降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子，继续降落到基态 的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是荧光；
❖ 4、到达基态的各个不同振动能级的分子，再通过无辐射跃迁最后回 到基态的最低振动能级。
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分子产生荧光必须具备两个条件：

激发态分子在发射荧光之前，很快经历了振动松 弛或者内转化的过程损失了一部分激发能，致使 发射向对于激发总是有一定的损失。
荧光光谱 磷光光谱
辐射跃迁只使激发态分子衰变到基态的不同振动 能级，然后通过振动松弛进一步损失能量。
图2 萘的激发光谱I、荧光II和 磷光光谱III
荧光与分子结构的关系
具有大的共轭π键的结构 化合物
ϕF
λex/nm
λem/nm
含有π→π＊跃迁能级的芳 苯
0.11
205
278
香族化合物的荧光最强芳环 蒽
0.29
286
321
越大其荧光峰越移向长波长 萘
0.46
365
400
方向，且荧光长度往往比较
丁省
0.60
390
480
强。
戊省
0.52
580
640
取代基的影响
给电子基团，如-0H、-OR、 -NH2、-CN、-NR2等，使 荧光增强。
分子荧光光谱法
molecular fluorescence analysis
CONTENTS
01 概述/ 02 荧பைடு நூலகம்分析基本原理/ 03 荧光分析仪器 /
04 检测结果与分析/ 05 对比与发展 /
Part 01
概述
overview
原子光谱法 分子光谱法
主要研究内容
The Main Contents Of The Research
系间窜越 isc
03 不同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁过 程（例如S1---T1，T1---S0）
内转换
振动弛豫
S2
系间跨越
S1
能
量

电子通常的情况下分子的电子处于最低的能级状态（大多数有机物的分子 的基态是处于单重态的）。用S0表示。若分子受激发，其电子从基态的电子能 级跃迁到较高的电子能级，即激发态，用S1, S2……表示。
（一）荧光和磷光的产生
处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当分子吸收能量，若 电子在跃迁过程中不发生自旋方向的改变，通常跃迁至第一激发态单重态轨道 上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。这种跃迁是符合光谱选律的。
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（二）激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线 荧光和磷光均为光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，可根 据它们的激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时，固定测量波 长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测 得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制 激发光谱 曲线。
应该指出，激发光谱曲线与其吸收曲线可能相同，但激发光谱 曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则是吸光度与波长的 关系曲线，两者在性质上是不同的。当然，在激发光谱曲线的最大 波长处，处于激发态的分子数目是最多的，这可说明所吸收的光能 量也是最多的，自然能产生最强的荧光。
处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式 再回到基态。辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射； 无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫 （VR）、内部转移（IR）、系间窜跃（IX）及外部转移（EC） 等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构 及激发时的物理和化学环境等因素有关。
下面结合荧光和磷光的产生过程，进一步说明各种能量传递 方式在其中所起的作用。
设处于基态单重态中的电子吸收波长为λ1和λ2的辐射光之后， 分别激发至第二单重态S2及第一单重态S1。
4

内部能量转换
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
.
6
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
.
8
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
.
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三、影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 酸度 散射光
学习目的: 提高荧光分析的灵敏度和选择性
.
25
1 溶剂对荧光的影响
萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？ A 1－氯丙烷 B 1－溴丙烷 C 1－碘丙烷 D 1，2－二氯丙烷
1. 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移， 荧光强度也增强。
OH N
C H2
芴φf 1.0
O N Mg1/2
.
21
（三）分子的刚性和共平面性
CH3
SO3Na
N
CH3 CH3
SO3NaN CH3
H CCH
H CC H
结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移
（四）取代基效应
给电子基团 －NH2、 －OH、－OCH3、－NHR、－NR2荧 光效率提高、荧光波长长移
•
• • • •
cx
cs
.
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二、定量分析方法
2、比例法（对照法）
Fs F0 KCs
FxF0KCx
Cx
Fx Fs

菲
线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 多环芳烃是重要的环境污染物， 法测定 • 3，4 - 苯并芘是强致癌物 ， 苯并芘是强致癌物
λ ex = 386 nm λem = 430 nm
（二）荧光与有机化合物结构的关系
物质只有吸收了紫外可见光，产生π 物质只有吸收了紫外可见光，产生π → π*，n → π* 跃迁， 跃迁，产生荧光 跃迁相比，摩尔吸收系数大10 π → π*与n → π*跃迁相比，摩尔吸收系数大102~103， 寿命短 跃迁常产生较强的荧光， π → π*跃迁常产生较强的荧光， n → π*跃迁产生的 荧光弱
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道 大多数分子含有偶数电子， 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ ，处于基态单 重态。 当物质受光照射时， 重态。用 “S0” 表示 ；当物质受光照射时，基态 分子吸收光能产生电子能级跃迁， 分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至 更高的单重态，电子自旋方向没有改变， 更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 .这种跃迁是符合光谱选律的 第一激发单重态 S1
VR S2 IC VR S1 ISC
VR：振动驰豫 ： IC：内部转换 ： ISC：系间窜跃 ：
T1
S0 吸光 吸光
S0
3. 荧光光谱的产生—辐射去激 荧光光谱的产生—
处于S 处于S1或T1态的电子返回S0态时，伴随有发光现 态的电子返回S 态时， 象，这种过程叫辐射去激 发光 S0 S1或T1 荧光： （1）荧光： 当电子从第一激发单重态S 当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基 态S0各振动能级所产生的光辐射叫荧光 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停 又叫快速荧光或瞬时荧光， 止照射， 止照射，荧光马上熄灭 无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐 无论开始电子被激发至什么高能级， 射去激消耗能量后到S 的最低振动能级，发射荧光， 射去激消耗能量后到S1的最低振动能级，发射荧光， 荧光波长比激发光波长长。 荧光波长比激发光波长长。 λ 荧>λ激

减弱或消失，称为荧光熄灭（或猝灭）。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
3.激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的
波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量
浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 I0 l c = Kc
（2）定量方法
标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲
线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线 上求出浓度； 比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；
5.荧光分析法的应用
(1)无机化合物的分析
（1）电子跃迁类型 发射 π*→π跃迁比π*→n跃迁更常见
（2）共轭效应 芳香族化合物的荧光最常见且最强，大多 数未取代芳烃在溶液中发荧光，随着环的数目和稠合程 度增加，荧光峰红移，Φ↑。简单杂环化合物不发荧光， 但具有稠环结构的杂环化合物都发荧光。
（3）平面刚性结构效应 有刚性结构的分子容易发荧光， 刚性和共平面性的增加有利于荧光发射。
分子荧光光谱法
光致发光（Photoluminescence）: 荧光和磷光是分子吸光
成为激发态分子，在返回基态时的发光现象，称为光致发光。 特点： ★灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1~3个数量级； ★线性范围宽； ★选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外可见吸收的分子不 一定发射荧光或磷光； ★应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发荧光。 基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法称为分子荧光光 谱法。

（1）荧光与结构的关系
电子跃迁类型 * → 的荧光效率高，系间窜跃至三重态的 的速率常数较小，有利于荧光的产生。 共轭效应 含有* → 跃迁能级的芳香族化合物的荧光最 常见且最强。具有较大共轭体系或脂环羰基结构的 脂肪族化合物也可能产生荧光 取代基效应： 苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光的产生；而 给电子基会使荧光增强。
（2）环境因素 ①温度 温度对荧光的影响很大。 温度降低会减少碰撞和非辐射失活的概率， 因此会增加荧光强度。例如：荧光素的乙醇溶 液在0℃以下每降低10℃，荧光产率增加3%， 当温度降低至-80 ℃时，荧光产率为100%。 ②pH值 含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧 光与pH有关。pH的变化影响了荧光基团的电荷 状态，从而使其荧光发生变化。
7.影响荧光强度的因素
（1）内部因素 自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射 转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。
自吸收——荧光化合物的发射光谱的波长与其吸收光 谱的波长重叠，溶液内部激发态分子所发射的荧光在 通过外部溶液时被同类分子吸收，从而使荧光被减弱。 荧光强度F与光源的辐射强度I0有关，因此增大光源辐 射功率I0可提高荧光测定的灵敏度。紫外-可见分光光 度法无法通过改变入射光强度来提高灵敏度。
6. 荧光强度与浓度的关系
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度 （F）与
①荧光物质的吸光程度及其②发射荧光的能力有关：
F = K′（I0—I） I0 —入射光辐射强度； I —透射光辐射强度； K′—取决于荧光量子产率（Ф）。
Lambert-Beer 定律：
I I0 e
2.303bc
（3）跃迁的方式：
①无辐射跃迁： 振动弛豫、内转换、系间窜越、外转换 ②辐射跃迁： 荧光、磷光

产生荧光 基态分子 光照激发 价电子跃迁到激发态
去激发光 * * n
基态
在光致激发和去激发光的过程中，分子中 的价电子（ 、n电子）处于不同的自旋状 态，通常用电子自旋状态的多重性来描述
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道 中两个电子自旋方向总是相反的 ，处于基态单 重态。用 “S0” 表示 ；当物质受光照射时，基态 分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至 更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 .这种跃迁是符合光谱选律的 第一激发单重态 S1
应用最广泛的一种光 源，可发射250~800nm
很强的连续光源
2、单色器
荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量 分析，不能获得光谱
大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有
较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱， 又可获得荧光光谱
第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择
最佳激发波长 光物质 ex
f
ex /nm
em /nm
苯
0.11
205
278
萘
0.29
286
310
蒽
0.46
365
400
线状环结构比非线状
菲
结构的荧光波长长
350
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 法测定 • 3，4 - 苯并芘是强致癌物
ex = 386 nm em = 430 nm
浓度高时， If与C不呈线形关系，有时C增大， If 反而降低因为有时发生荧光猝灭效应
荧光猝灭
——荧光物质与溶剂或其它物质之间 发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度 下降或荧光效率f 下降称为荧光猝灭。 使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂

第二节 荧光分析的原理
（一）荧光发生机理 物质的基态分子受一激发光源的照射， 被激发至激发态，在返回基态时，产生 波长与入射光相同或较长的荧光。 通过测定物质分子产生的荧光强度进行
分 析 的 方 法 称 为 荧 光 分 析 (fluorescence analysis)。
1、分子的激发态

荧光和磷光这两种光致发光过程的机理不同， 可从实验观察激发态分子寿命的长短来加以区 别： 对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光 过程几乎立即停止（在10-9～10-6秒，荧光寿 命fluorescence life time ）。 磷光则将持续一段时间（在10-3～10秒）。
荧光分析法发展简史
2、分子荧光和磷光的产生


分子在室温时基本上处于电子能级的基态。当吸 收了紫外—可见光后，基态分子中的电子只能跃 迁到激发单线态的各个不同振动—转动能级，根 据自旋禁阻规律，不能直接跃迁到激发三重态的 各个振--转能级。 处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射 跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程释放多 余的能量而返回至基态，发射荧光是其中的一条 途径。


世界上第一次记录荧光现象是16世纪 西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes。 1575年他提出在含有一种木头切片的 水溶液中，可观察到极可爱的天蓝色。
1852年，stokes在考察奎宁和叶绿素的 荧光时，用分光光度计观察到其荧光的 波长比入射光的波长稍微长些，从而导 入了荧光是光发射的概念。 18工作。应用铝—桑色素配 合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行 的，直到1928年，才由Jette和West完成 了第一台荧光计。
激发单重态与激发三重态的性质不同