《层析分析法》PPT课件

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蛋白质化学中的层析技术PPT 课件
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• 层析技术简介 • 层析技术在蛋白质分离纯化中的应
用 • 层析技术原理 • 层析技术的应用实例 • 层析技术的优缺点及展望
01
层析技术简介
层析技术的定义
层析技术
是一种分离和纯化混合物中各组分的方法，基于各 组分在固定相和流动相之间的分配差异进行分离。
05
层析技术的优缺点及展望
层析技术的优点
分离效果好
层析技术能够根据分子间的吸附、分配等作用力 的差异，将混合物中的组分进行有效的分离，得 到高纯度的产物。
适用范围广
层析技术可以应用于不同性质的混合物分离，如 有机物、无机物、离子、蛋白质等，具有广泛的 适用范围。
分离过程可重复
层析技术是一种物理分离方法，不涉及化学反应 ，因此分离过程可以重复进行，适用于大规模分 离和制备。
凝胶过滤层析原理
原理概述
凝胶过滤层析是一种基于分子 大小差异的分离技术。通过不 同孔径的凝胶介质，不同大小 的分子会以不同的速度通过凝 胶，从而实现分离。
应用范围
凝胶过滤层析常用于蛋白质、 多糖等大分子物质的分离和纯 化。
技术特点
操作简便、分离效果好、分辨 率高。
离子交换层析原理
01 02
原理概述
1950年代
随着凝胶技术的发展，凝胶层 析、电泳等新型层析技术逐渐 兴起。
1970年代至今
层析技术不断改进和创新，应 用范围越来越广泛，成为生物 化学领域中重要的分离分析方 法。
层析技术的分类
根据固定相和流动相的物理状态
可分为液相层析和气相层析。液相层析又可分为液-固层析和液液层析，是生物分子分离纯化中最常用的技术。

迄今对岳麓山风景区景观资源综合评价的研究还未见报道。 景观资源评价对进一步认识和开发景观资源的价值, 深层 次的保护、 开发和利用景观资源具有极大的现实意义。 当人们从多个景点中选择出一个自己满意的地方时要考虑 的因素可能有很多，比如景色、费用、住宿、饮食、路途 的远近等等，并且这些因素都是很难用数字来量化的，但 是有一点很清楚那就是不同的人对这些因素的要求不同。 如果经济状况比较好的话，可能会更看中景色而不太在乎 费用的多少；如果是中老年旅行者则会对旅途、居住、饮 食等条件给予较大的关注。而层次分析法就是针对个人的 不同需求，给出选择理想景点的一种很贴切的方法。
标度 1 3 5 7 9
含义 表示两个元素相比，具有同样的重要性 表示两个元素相比，前者比后者稍重要 表示两个元素相比，前者比后者明显重要 表示两个元素相比，前者比后者极其重要 表示两个元素相比，前者比后者强烈重要
2，4，6，8 表示上述相邻判断的中间值 倒数：若元素i和元素j的重要性之比为aij,那么元素j与元素i的 重要性之比为aji=1/aij
表 3岳麓山风景名胜区五大景区的景观资源质量综 合评价得分 景区评 麓山景 天马山 石佳岭 桃花岭 橘洲景 价 区 景区 景区 景区 区 资源评价 7.321 6.281 4.609 4.948 6.137
总分( 十分 计) 景观质量 评分( 十分 计)
5.412
4.344
2.661
3.187
4.622
使得景区的生态环境质量明显变劣, 景区的整体景 观资源综合价值还略逊于天马山景区。 天山景区为登高眺望岳麓山、湘江、橘洲及沿 江景观的最佳处,交通便利,风景宜人,又有肖劲光 纪念园等人文景观,使景观资源总体评分仅次于麓 山区。 桃花岭景区与石佳岭景区处于岳麓山西部, 自然 景观宜人, 但由于缺乏人文景观, 交通不便, 总 体评分较低。

第九章 分析测定中的 分离方法
第四节 层析分离法
9.4.1 柱层析法
9.4.2 平面层析法
2019/1/11
9.4.1 柱层析法
1. 吸附柱层析法
以吸附剂为固定相(硅胶、氧化铝和活性炭等)。 根据试样的性质、吸附剂的活性和流动相的极性这 三种因素来选择适宜的条件。 被分离的组分极性较强，应选择吸附性能较弱的吸 附剂，同时选择极性较强的洗脱剂；或反之。 吸附柱层析法可用于芳香族化合物的分离、倍半萜 类烯物的分离等。
装置简单、操作简便。
常作为一种不挥发高沸点有机物、生物大分子混合物 的有效、快速、简便的分离分析手段而被应用。
平面层析法与其他色谱分离有着相同或相似的分离机 理。
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平面层析法
纸层析和薄层层析流 动相的移动是依靠毛细作 用。 将试样点在色谱滤纸 或层析板的一端，并将该 端浸在作为流动相的溶剂 （常称之为展开剂）中， 随着溶剂向上的移动，经 过试样点时，带动试样向 上运动。
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凝胶柱层析法
应用 生化领域，如蛋白质、氨基酸、核酸、肽类等生物物 质的分离和制备； 抗菌素的分离、纯化，肝炎病毒的分离等； 高聚物的相对分子质量和分子质量分布测定。
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9.4.2 平面层析法
平面层析法(planar chromatography)主要包括薄层层 析法和纸层析法两大类。 薄层层析：将固定相涂布于平面载板上。 纸层析：直接以滤纸作为固定相。
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缺点:
• 缺点： 分离效率较低，不适用于挥发性试 样分离。定性定量不便。 • 应用：平板色谱法在染料、农药、医药、 有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基酸、 蛋白质及中草药中有效成分的分离分析中经 常被使用。也可以用于无机离子的分离。还

n 1
为衡量CI 的大小，引入随机一致性指标 RI——随机模
拟得到aij , 形成A，计算CI 即得RI。 Saaty的结果如下
n 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 RI 0 0 0.58 0.90 1.12 1.24 1.32 1.41 1.45 1.49 1.51
定义一致性比率 CR = CI/RI
P1,P2只作教学, P4只作科研, P3兼作教学、科研。
w(3）的方法
C1,C2支配元素的数目不等
考察一个特例： 若C1,C2重要性相同, w(2)=(1/2,1/2)T, P1~P4能力相同, w1(3)=(1/3,1/3,1/3,0)T,w2(3)=(0,0,1/2,1/2)T 公正的评价应为： P1:P2:P3:P4=1:1:2:1
• 应用领域：经济计划和管理，能源政策和分配， 人才选拔和评价，生产决策，交通运输，科研选题， 产业结构，教育，医疗，环境，军事等。
• 处理问题类型：决策、评价、分析、预测等。 • 建立层次分析结构模型是关键一步，要有主要决 策层参与。
• 构造成对比较阵是数量依据，应由经验丰富、判 断力强的专家给出。
组合 权向量
第2层对第1层的权向量
w( 2 )
(w1(2) ,
, w ) (2) T n
第1层O 第2层C1,…Cn
第3层对第2层各元素的权向量 第3层P1, …Pm
w(3) k

(w(3) k1
,
,
w(3) km
)T
,
k
1,2,
,n
构造矩阵
W (3)

[w(3) 1
,
,
w(3) n
2

1

方法：
(1) oligo(dT)-纤维素层 析柱法
(2) oligo(dT)-纤维素液 相结合离心法
(3)磁珠分离法
oligo(dT)-纤维素层析柱法
磁 珠 分 离 法
配体与载体结合
(固相化)
亲和层析
装柱
的基本过程
(亲和层析柱)
解吸附 洗柱
亲和吸附
(生物高分子与配体专一结合)
配体与载体的联接方法
固定相——滤纸上的吸附水 流动相——溶剂(乙醇、丙醇、丙酮及与水不相溶
的溶剂)
分离示意图
层 析 纸
层析缸
溶剂前沿
y x2
x1 起始线
(原点)
展开剂
Rf > 0.02 ，A 、B可分离. 与标样比较可定性鉴定
. 如果两种氨基酸的迁移速率相近，
或者氨基酸的Rf值相同，如何来分
离？
氨基酸的Rf值
展开剂 正丁醇+吡啶+水
名称
分离原理
固定相只能与一种待分离
亲和层析法 组份专一结合，以此和无 亲和力的其它组份分离
层析法的分类
• 按操作形式不同分类
名称
操作形式
柱层析法 固定相装于柱内，使样品沿着 一个方向前移而达分离
纸层析法 用滤纸作液体的载体，点样后 用流动相展开，使各组份分离
将适当的高分子有机吸附剂制成 薄膜层析法 薄膜，以类似纸层析方法进行物
加入样品 层析后
实验：胡萝卜的 柱层析分离法
柱层析示意图
薄层吸附层析
( Thin layer absorption chromatography)
薄层吸附层析是将吸附剂 均匀地在玻璃板上铺成薄层， 再把样品点在薄层板上，点样 的位置靠近板的一端。然后将 板的这端浸入适当的溶剂(流 动相)中，使溶剂在薄层板上 扩散，并在此过程中通过吸附 →解吸→再吸附→再解吸的反 复进行，而将样品各个组分分 离出来。

气相色谱仪
高效液相色谱仪
离子色谱仪
广泛应用于石油、ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ工、
医药卫生、生物科学、环境科 学、农业科学等领域。
三聚氰胺分析仪(色谱法)
作业：
1、认真完成实验报告及分析
2、可继续尝试： 用粉笔对菠菜中的色素 进行柱层析分离（选择几片新鲜菠菜叶，放在乙醇溶
液中，轻轻研磨获得提取液，在提取液中竖直放置一根白粉笔。 经一段时间之后观察现象）；
空白演示
在此输入您的封面副标题
叶黄素
（Michael Tswett）
分离过程示意图
混合物
各组分同时进入 各组分开始分离 各组分基本分离 各组分完全分离
实验1： 纸上分离甲基橙和酚酞混合溶液
小贴士
分工合作 规范操作 准确记录 认真分析
操作过程中，如有疑问，可以进行记 录并互相讨论试着解决。
层析法的优点：
仪器简单，操作容易 微量物质的分离和鉴别 化学性质相近的混和物的分离
实验2：做个小化验员 纸上层析分离Cu2+和Fe3+混合溶液
小贴士
（1）不要倾斜层析瓶，不要让层 析液沾到容器内壁上； （2）滤纸插入层析瓶中要挺直； （3）不能使点好的混合物碰到层 析液（已经装好丙酮和盐酸混合溶液）， 否则会溶解到层析液中而导致实验 失败。

图14-1 直接启动接线图
14.2.2 降压启动
时由U于12 T∝ ，降压启动的同时会使电动机的启动转矩 减小，因此，这种方法只适用于轻载或空载情况下启动。 常用的降压启动方法有下列几种：
1. 定子电路中串电阻(或电抗器)启动 这种启动方法是在电动机定子绕组的电路中串入一 个三相对称变阻器，其启动线路如图14-2所示。启动时， 先合上S1，流过变阻器上的电流在变阻器上产生压降， 此时加在电动机定子绕组上的电压Ust低于电网电压U1N， 这样电动机进入降压启动过程。调节变阻器的大小，可
直接接入电网使其在额定电压下启动，如图 14-1电路所 示。这种启动方法最简单，无需专用启动设备，投资小， 操作方便，启动时间短。但启动电流大，启动转矩小， 直接启动时对电网造成冲击，引起电压波动，一般只适 用于小容量电动机(7.5 kW以下)的启动。对较大容量的 电 式动确机定， 能在 否电 直源 接IIsN容 启t 量 动43较： 供大4电的变电情压动况器机下容容，量量可((kk参VW)考A)以下经验公
(14-1)
较大的启动电流是十分有害的，对频繁启动的电动 机来说，会引起电动机过热而温升较高，使电动机绝缘 材料老化，使用寿命减少。对供电变压器来说，当变压 器容量有限，输电距离较长时，大的启动电流将造成变 压器输出电压下降，并且会影响到同一供电线路上的其 他设备的正常工作。例如，在电动机启动瞬间，照明灯 会变暗，数控机床会失控等。
示，且直令接启动时的启U动1电N 流K和(K启动1转) 矩分别用Ist和Tst表
Ust
则降压后的启动电流为
Ist1
Ist K
(14-4)
U12
因为T∝
则降压后的Ist启1 动KI转s2t 矩为
(14-5)

17
分配系数K值大,说明物质在层析中被 固定相吸附得比较牢固,随流动相迁移的速 度较慢,留在固定相中的时间较长,在洗脱液 中后出峰。若分配系数K值小，则该物质在 洗脱液中较早出峰。
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从一个混合物中分离和纯化一种生物 物质的纯度如何，取决于混合物中各组分K 值的差异程度。
混合物中各组分若 K值相差较大, 则能 较易地把混合物中的生物物质分离。反 之,K值相差较小,不易把混合物中的生物物 质分离。
42
四.凝胶的结构与性能
1.葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex） 结构： 葡聚糖用交联剂1-氯代-2 ,3-环丙烷使葡聚糖
之间通过醚键(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交联
OH
聚合而成的三维空间网状结构。
43
特点：
Sephadex 的三维空间网状结构的网孔大小取决于交 联度,交联度的大小可在合成Sephadex 时控制加入 交联剂的百分比决定.交联剂的百分比高,交联度大, 网状结构愈紧密,孔隙愈小,吸水后膨胀也愈小,机械 强度高,分离物质的分子量也小。反之,交联剂的百 分比低,分离物质的分子量大。G类Sephadex的型号 表示每克干凝胶吸水量x10,如G-50表示每克干凝胶 吸水量为5ml。
（最好有颜色以便于观察如Hb、印度黑墨水） 通过实际测量求出.Vi可由g·Wr求得（g为干 凝胶重,单位为克,Wr为凝胶的吸水量以ml/g 表示）。
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Ve - Vo Kd = ————
Vi （1）Kd = 0时,Ve = Vo,意味着该分子完全被排阻 于凝胶颗粒之外,全部分布于流动相里,在固定相 分布为0,而最先流出。 （2）当Kd = 1时,Ve = Vo + Vi,意味着该分子完全 不被排阻,可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部,它 能均等地分布在流动相和固定相里,在两相分配的 比值为1,而最后流出. （3）当0 <Kd <1, Ve = Vo + ViKd为处于两种极 端行为之间的分子。

❖ 缺点：刚性差，不耐压，分离时间长
层析介质的性能
❖ 层析介质的形状：球形，不定形 ❖ 技术指标
粒度大小：粒度小，分离效果好，但流速慢 均匀度：均匀，流速快，峰值集中 机械强度：强度高，流速快，保留值小，柱效高 理化性质：稳定，非特异性吸附少，亲水性好，耐酸碱和有机溶剂 吸附容量：单位质量或体积的层析介质吸附流动相中溶质的质量。
❖ 纸上层析是用滤纸作为支持剂（载体）的一种色层 分析法，这种方法的基本原理一般认为主要是利用混和 物中各组分在流动相和固定相间的分配比的不同而使之 分离。
❖ 纸上层析可用于化学性质相近的混和物的分离，特 别适宜于微量物质的分离和鉴别。而且使用的仪器简单， 操作比较容易，重现性好。
三、层析前蛋白质处理
层析技术是一种分离技术，是混合物 最有效的分离、分析方法。
经典色谱（offline)
Tswett把植物绿叶的色素混合液加在一根装有干燥固体碳 酸钙颗粒（称固定相）的玻璃长管（称为填充色谱柱）上 端;
洗脱剂（亦称流动相）石油醚自上而下流过；
在石油醚不断冲洗下，原来在柱子上端的色素混合液向下 移动。由于色素中各组分的性质的差异，最后分离成不同 颜色的清晰色带；
检测器
固定相
❖ 固定相是不溶于溶剂和水的固定化颗粒，又 称为层析介质、层析填料、填充剂等。
❖ 包括：
无机材料：硅胶，氧化铝 有机材料：聚苯乙烯等 多糖类材料：葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺
层析介质与生物大分子的关系
❖ 大孔径的，亲水性好的球形材料。 ❖ 多糖类凝胶层析介质最常用
Sephadex Sepharose Bio-Gel
2、等电点沉淀
❖ 在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白 质的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉 淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子 散开，溶入水中。