提取rna的原理

rna提取方法及原理

RNA是一种生物大分子，具有非常重要的生物学功能，在生物研究中有着广泛的应用。为了研究RNA的功能和结构，科学家们需要从细胞中提取出RNA。本文将介绍RNA提取的几种常用方法及其原理。

一、酚/氯仿法

酚/氯仿法是RNA提取的一种经典方法，它基于RNA和DNA的物理性质差异进行分离。该方法的步骤如下：

1. 细胞破碎：将待提取RNA的细胞或组织经过低温致裂，使细胞膜破裂释放出RNA。

2. 酚酸提取：加入酚酸溶液，与DNA形成两相体系。RNA主要溶于上层的酚酸相中，而DNA则主要溶于下层的酚氯仿相中。

3. 氯仿提取：将上层的酚酸相与下层的酚氯仿相分离，得到含有RNA的上层液体。

4. 沉淀：通过加入异丙醇或乙醇使RNA沉淀，然后用冷乙醇洗涤并干燥沉淀，最后用水溶解得到纯净的RNA。

酚/氯仿法的原理是利用RNA和DNA的溶解度差异以及RNA在酚酸上层相中的亲和力较大，从而实现RNA的提取。

二、硅胶膜柱法

硅胶膜柱法是一种常用的RNA提取方法，它使用硅胶膜柱与试剂盒结合，以实现RNA的高效提取。该方法的步骤如下： 1. 细胞破碎：将待提取RNA的细胞或组织破碎，并加入试剂使RNA不受降解酶的影响。

2. 结合：将破碎后的细胞溶液与硅胶膜柱结合，RNA结合到硅胶膜柱的表面。

3. 洗涤：通过洗涤剂洗去杂质和其他污染物，保留纯净的RNA在硅胶膜柱上。

4. 解吸：将洗涤后的硅胶膜柱加入含有RNase-free水的管中，使RNA从硅胶膜柱中解离。

5. 沉淀：通过加入异丙醇或乙醇使RNA沉淀，然后用冷乙醇洗涤并干燥沉淀，最后用水溶解得到纯净的RNA。

硅胶膜柱法的原理是利用硅胶膜柱的高亲和性和离心过滤来纯化RNA，同时通过试剂的作用保护RNA免受降解酶的影响。

三、磁珠法

磁珠法是一种高效且易于自动化的RNA提取方法，它利用磁珠表面的化学基团与RNA分子进行特异性结合。该方法的步骤如下：

实验内容：鲫总RNA的提取与热休克蛋白基因的克隆

热休克蛋白( heat shock protein , HSP) 又称为应激蛋白,是生物细胞（包括原核细胞及真核细胞）在受热、生物应激、理化因素等应激原刺激后，发生热休克反应时所产生的一类在生物进化中最保守并由热休克基因所编码的伴随细胞蛋白。

热休克蛋白 是细胞在生理状态下必需而在应激状态时表达增多的一类保护性蛋白质，热休克蛋白对生体的意义是，可提高机体对不良环境的耐受性，保护机体或细胞在随后的致死性应激中不受或少受伤害，同时还具有保护、修复蛋白质，参与机体免疫、交叉保护等特性。。热休克蛋白根据其同源性及分子质量大小可分为3 个主要家族: HSP90 (85-90 ku) 、HSP70 (68-73 ku) 和小分子质量热休克蛋白。其中以HSP70 最为保守,研究的也最广泛，常被作为应激反应的分子指标。

一. 主要酶和试剂

Trizol Reagent、禽源反转录酶（AMV）、DEPC、Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、DNA Marker（DL2000）。

二．所需试剂的配制：

DEPC处理水（0.1‰）：1000 mL双蒸水中加入0.1 mL DEPC，过夜温育后高压灭菌。

1.5％琼脂糖：向100 mL的1×TAE中加入1.5g的琼脂糖。

50×TAE：750 mL双蒸水中溶解242 g Tris碱，加入57.1 mL乙酸，100 mL的0.5 mol/L 的EDTA（pH8.0），用双蒸水定容至1000 mL。使用时用双蒸水稀释为1×TAE。

三. 仪器与设备

PCR扩增仪；微量核酸蛋白检测仪；紫外凝胶成像仪；电热恒温水浴锅；制冰机；稳压稳流电泳仪；微型水平电泳槽

四. 实验方法

实验开始前，要将枪头、匀浆器等用0.1％DEPC水浸泡12h以上，然后高压灭菌、烘干机烘干（需提前准备）

1． 总RNA的提取

用TRIzoL Reagent试剂盒并按其说明书提取总RNA，其具体操作步骤如下：

María Isidoro-García (ed.), Molecular Genetics of Asthma, Methods in Molecular Biology, vol. 1434,

DOI 10.1007/978-1-4939-3652-6_11, © Springer Science+Business Media New York 2016 Chapter 11

Protocols for Exosome Isolation and RNA Profi ling

FernandoMarqués-GarcíaandMaríaIsidoro-García

Abstract

Exosomes are small extracellular vesicles of multivesicular bodies derived from the cell endosome. Molecules have a characteristic composition both in the membrane and in the carried load. These particles are located in the culture medium of cells in vitro and in vivo body fl uids, being synthesized by almost all kind of cells. The most characteristic molecule transported within is the RNA with a large clinical potential. In this chapter, the methodology for isolation of exosomes and subsequent purifi cation of the RNA is reviewed.

小麦总RNA提取试剂

1）RNA 提取采用试剂Trizol Reagent (购自invitrogen公司)

2）氯仿；异丙醇；70 % 乙醇；0.1 % DEPC；DEPC处理的超纯水

小麦幼苗总RNA的提取

实验用品的处理：离心管、枪头等塑料制品用0.1 % DEPC于 37 ℃浸泡2h，和0.1 %的DEPC水高压灭菌30min，研体、剪刀、镊子、容量瓶等180℃烘烤6h。

1） 称取100 mg小麦叶片，液氮研磨至粉末状，迅速转入含1mL Trizol的1.5 ml离心管中，混匀，室温下静置5 min。

2）加0.2 ml氯仿，剧烈振摇15 sec，20 ℃静置3 min。

3）然后在4℃，12000 rmp 离心10 min，吸取上清，加入等体积的异丙醇，混匀，置于-20℃放置30 min。

4）在4℃，12000 rmp 离心10 min，弃去上清液，沉淀中加1mL 75% 乙醇洗涤2次。

5）4℃，12000 rmp 离心5 min，弃去上层乙醇，放置几分钟，等乙醇挥发完加入50uL DEPC 水溶解RNA，并迅速置于-70℃存放。

6）取上述RNA提取溶液，1 %琼脂糖电泳检测。

双灭：30min 121℃ 不开盖，气压降到O℃。枪头（蓝白黄）、1.5ml 离心管、PCR管、剪刀、镊子(2-3)、研钵（2-3)

液氮提前检测

灭一次：先DEPC（1:10）乙醇，然后上述混合液与ddH2O 1:100混溶，100ml。

PCR 体系：模板1μL cDNA、 UpperPrimer（10μM ）1.0μL，Lower Primer（10μM ）1.0μL，

mix 8μL，加 H2O 9 μL。PCR反应参数为：94℃ 预变性5min ；94℃变性 1min ，57℃退火 1min ，72℃延伸1min，循环35次 ；72℃延伸 10 min ；4 ℃保存。