rna提取原理

rna提取方法及原理

RNA是一种生物大分子，具有非常重要的生物学功能，在生物研究中有着广泛的应用。为了研究RNA的功能和结构，科学家们需要从细胞中提取出RNA。本文将介绍RNA提取的几种常用方法及其原理。

一、酚/氯仿法

酚/氯仿法是RNA提取的一种经典方法，它基于RNA和DNA的物理性质差异进行分离。该方法的步骤如下：

1. 细胞破碎：将待提取RNA的细胞或组织经过低温致裂，使细胞膜破裂释放出RNA。

2. 酚酸提取：加入酚酸溶液，与DNA形成两相体系。RNA主要溶于上层的酚酸相中，而DNA则主要溶于下层的酚氯仿相中。

3. 氯仿提取：将上层的酚酸相与下层的酚氯仿相分离，得到含有RNA的上层液体。

4. 沉淀：通过加入异丙醇或乙醇使RNA沉淀，然后用冷乙醇洗涤并干燥沉淀，最后用水溶解得到纯净的RNA。

酚/氯仿法的原理是利用RNA和DNA的溶解度差异以及RNA在酚酸上层相中的亲和力较大，从而实现RNA的提取。

二、硅胶膜柱法

硅胶膜柱法是一种常用的RNA提取方法，它使用硅胶膜柱与试剂盒结合，以实现RNA的高效提取。该方法的步骤如下： 1. 细胞破碎：将待提取RNA的细胞或组织破碎，并加入试剂使RNA不受降解酶的影响。

2. 结合：将破碎后的细胞溶液与硅胶膜柱结合，RNA结合到硅胶膜柱的表面。

3. 洗涤：通过洗涤剂洗去杂质和其他污染物，保留纯净的RNA在硅胶膜柱上。

4. 解吸：将洗涤后的硅胶膜柱加入含有RNase-free水的管中，使RNA从硅胶膜柱中解离。

5. 沉淀：通过加入异丙醇或乙醇使RNA沉淀，然后用冷乙醇洗涤并干燥沉淀，最后用水溶解得到纯净的RNA。

硅胶膜柱法的原理是利用硅胶膜柱的高亲和性和离心过滤来纯化RNA，同时通过试剂的作用保护RNA免受降解酶的影响。

三、磁珠法

磁珠法是一种高效且易于自动化的RNA提取方法，它利用磁珠表面的化学基团与RNA分子进行特异性结合。该方法的步骤如下：

总RNA提取的原理、步骤

1.原理及方法（异硫氰酸胍-酚-氯仿 一步法）

TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。

2.简易步骤

细胞或组织，加入0.4ml TRIZOL试剂后匀浆

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室温静置5分钟

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加入1/5 TRIZOL试剂体积量的氯仿，剧烈震荡混匀

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室温静置5分钟，12000g 4℃离心l5分钟

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将上清液转移至新的离心管中，加入与上清液等体积的异丙醇，颠倒混匀

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室温静置10分钟，12000g 4℃离心l0分钟，弃上清

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向沉淀中加入1ml的75%乙醇清洗沉淀，12000g 4℃离心5分钟

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弃上清保留沉淀，干燥

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沉淀物溶解于11μl的DEPC处理水中

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注意：以上操作应在生物安全柜内完成，以防止污染。

注意事项

①全程配戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。

②使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。 ③在TRIZOL中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。

④用TRIZOL抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。如无例外，所有的操作应该在15 -30°C的条件下完成，试剂亦在15 -30°C的条件下。

准备工作：（严格的去RNA酶条件）

器材：去RNA酶的15ml离心管、1.5mlEP管、PCR的EP管、蓝黄白枪头，专用移液枪，500ml试剂瓶*4，高压灭菌锅，4°离心机，振荡器。

试剂：苯酚，氯仿，异丙醇，无水乙醇，去RNA酶水、，DEPC, Trizol裂解液，双氧水， 50*TAE，RNA酶抑制剂，DNA酶，３mol/L乙酸钠（pＨ5.2），10*纯化buffer，终止buffer，琼脂糖凝胶粉末，Loading buffer（+EB的预染buffer）。

1、15ml离心管分装10ml的氯仿，异丙醇，无水乙醇，用去RNA酶水配制75%乙醇。分装1ml去RNA酶水。

2、500ml试剂瓶加500ml去离子水， 500ml试剂瓶加50*TAE10ml用去离子水定容到500ml，每瓶加DEPC（终浓度为0.01%,有毒，未高压灭菌前要小心），剧烈振荡混匀放置24小时后高压灭菌（降解DEPC）。

3、用DEPC处理过的水配制终浓度为3%的双氧水500ml（泡电泳槽，配胶板，锥心瓶用）。

RNA提取：

1、 准备去RNA酶的ep管，写好标签。

2、 洗净6孔板中的液体，用移液枪每孔加1mlPBS洗涤一次。

3、 用枪吸尽PBS，每孔加入1ml Trizol （有毒，最好通风橱里面加）裂解液（根据培养细胞孔的面积加入裂解液，6孔板加1ml即可），轻轻摇晃5min左右。

4、 用1ml的枪吹打细胞，使其充分脱离6孔板，将液体吸入准备好的ep管中（如果打算以后再做可放入-80°冰箱保存）。

5、 每管加入200ul氯仿（1ml加200ul），振荡使其充分混匀，冰上静置10min，这时可以预冷4°离心机。（如果是从-80°冰箱拿出的样品需待样品溶解后振荡混匀，室温平衡5min再进行该步骤）

6、 4°离心机14000g离心15min。此时准备新的ep管，每管加500ul异丙醇。

7、 将上清转移至准备的ep管中（不要吸到下层液体），混匀后放入-20°冰箱30min。

RNA研究相关的实验原理及操作介绍

1. ChIRP-Seq（Chromatin Isolation by RNA Purification）

ChIRP-Seq：培养的细胞在活细胞中交联，它们的染色质被提取并均匀化。利用磁性链霉亲和素珠，将感兴趣的RNA与目标RNA杂交并分离得到生物素化互补寡核苷酸。将纯化的染色质洗脱成蛋白质、RNA或DNA，然后进行下游检测以进行鉴定和定量，ChIRP-Seq能在全基因组水平上对lncRNA与染色质之间所有潜在的相互作用位点进行标记。

原理：戊二醛固定细胞后，利用声波降解法进行细胞裂解和染色质断裂，在裂解物中加入带生物素标记的oligo探针与lncRNA杂交，利用链霉素亲和磁珠分离纯化（与生物素亲和）。最后加RNaseA，从复合物中将lncRNA结合的蛋白和DNA片段洗脱下来，用于后续分析。 实验操作视频链接：/video/3912/chromatin-isolation-by-rna-purification-chirp 实验操作protocol：

二、RNA原位杂交（RNA in situ hybridization）

RNA原位杂交（RNA in situ hybridization）：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相杂交，经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA/lncRNA等分子，可检测该lncRNA是否位于核内或在细胞内的分布情况。

原理：将特定标记的已知序列核酸做为探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，从而对特定核酸进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。根据RNA序列设计cDNA探针，可结合RNA和DNA。 三、荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH)