葫芦素的生态功能及其应用前景

葫芦素的生态功能及其应用前景

凌冰;张茂新;王玉赞

【摘 要】葫芦素是一类高度氧化的四环三萜类植物次生代谢物质,是葫芦科30多属100多种植物的特征化合物.葫芦素在植物体内作为异源化学信息素起到保护葫芦科植物免受众多植食性动物和病原菌的侵害.另一方面,在葫芦科植物上取食的一些昆虫则利用葫芦素作为其寄主识别的信号物质.由于葫芦素特殊的化学结构和生物学活性,葫芦科植物与植食性动物之间的这种复杂关系已被广泛研究.总结葫芦素的分布、生物合成途径、及其对高等动物、昆虫和病原体的防御作用的研究概况.并对这类植物次生物质在有害生物综合治理中的应用及前景作了介绍与展望.

【期刊名称】《生态学报》

【年(卷),期】2010(030)003

【总页数】14页(P780-793)

【关键词】葫芦素;植物防御;生态功能;应用前景

【作 者】凌冰;张茂新;王玉赞

【作者单位】华南农业大学昆虫生态研究室,广州,510642;华南农业大学昆虫生态研究室,广州,510642;华南农业大学昆虫生态研究室,广州,510642

【正文语种】中 文

葫芦素(cucurbitacins)是一类高度氧化的四环三萜类植物次生物质，是葫芦科30多属100多种植物的特征化合物[1]。葫芦素在生态系统中作为异源化学信息素(allomones)起到保护葫芦科植物免受众多植食性动物和病原菌的侵害[2- 4]。另一方面，在葫芦科植物上取食的一些昆虫则利用葫芦素作为其寄主识别的信号[5-

7]。葫芦素在植物-植食性昆虫、植物-植食性昆虫-天敌以及植物-病原菌之间相互作用和协同进化的化学生态学一直是科学家们的研究热点[8- 10]。随着对葫芦素药理学的深入研究，葫芦素的细胞毒性、抗癌活性、抗炎活性和保肝作用也备受关注[11- 12]。近年来，国内外学者对葫芦素的化学生态学活性、生物合成途径及其作用机制进行了大量的研究，期望搞清楚葫芦素在植物生命活动以及生态系统中可能扮演的角色，进而以分子生物学的手段明晰重要化合物产生的分子机理，或以葫芦素为主研制成植物保护剂，控制病虫害发生为害，减少化学农药的使用；或以葫芦素为标记选育和培育抗性品种。本文对葫芦素在植物与生物环境之间的生态活性的研究进展作一简要概述，并对其应用前景进行了初步探讨。

1 葫芦素类化合物结构的多样性和丰富性

1.1 葫芦素的生物合成

从生源来看，葫芦素是由氧化鲨烯演变为甾体的中间体，经葫芦素烷醇合成酶合成葫芦素烷醇，然后氧化形成葫芦素[13- 14](图1、图2)。因此大多数葫芦素的结构和甾醇很相似。

图1 葫芦素的生物合成[13]Fig.1 Biosynthesis of cucurbitacins[13]a: 环阿屯醇合成酶 Cycloartenol synthase; b: 葫芦素烷醇合成酶 Cucurbitadienol synthase

葫芦素类化合物分子结构的基本骨架可认为是由羊毛甾烯(lanostene)C8位双键碳质子化，在C8位产生正碳离子，然后C10—CH3转位到C9位，C9—H转位到C8位，C11被氧化成醛基[14](图2)。

图2 由羊毛甾烯形成葫芦素的示意图[14] Fig. 2 Formation of cucurbitacine

from lanostene [14]

1.2 葫芦素的多样性和丰富性 葫芦素类化合物的结构多种多样，已鉴定的葫芦素及其衍生物有50多种[15]，但自然界中最普遍存在的是葫芦素B[16- 17]，并认为葫芦素B和葫芦素E是原始的葫芦素类型，其他结构的葫芦素是植物生长发育到成熟的过程中由葫芦素B或E在酶促反应下形成的[1,8,18]。葫芦素B能被代谢生成葫芦素A、C、D、F、G和H，它是狸红瓜属(Coccinia)、黄瓜属(Cucumis)、葫芦属(Lagenaria)和Trichomeria属植物的特征化合物[19]；同样地，葫芦素E能被代谢生成葫芦素I、J、K和L，它是西瓜属(Citrullus)的特征化合物；西葫芦属(Cucurbita)含有葫芦素B和E两种特征化合物[16]。葫芦素B在葫芦素△1还原酶作用下C1—C2被还原为C1C2，生成葫芦素E。葫芦素B和E的C23C24在葫芦素△23还原酶作用下双键打开分别生成二氢葫芦素B和二氢葫芦素E。葫芦素B和E在葫芦素乙酰酯酶作用下分别转化为葫芦素D和I(图2)[20- 21] 。在完整的植物组织中β-葡萄糖苷酶被隐藏，葫芦素一般以糖苷形式存在。当植物组织切碎后，它会立即释放，所以在植物提取物中葫芦素糖苷常常被水解成糖配基[19- 22]。

自然界中葫芦素的资源十分丰富。除了葫芦科植物以外，葫芦素也存在于十字花科、大戟科、秋海棠科、四数木科、杜英科、花荵科、报春科、蔷薇科、茜草科、玄参科、梧桐科和Desfontainaceae等植物中[23- 24]。葫芦素分布于植物的叶片、茎、根、果实和种子中，不同植物种类所含有的葫芦素种类和含量不同，同一种植物不同部位组织中葫芦素的种类和含量也不同。多年生的Citrullus naudinianus根含葫芦素可达1.4%，Citrullus ecirrhosa的根、叶片和果实中分别含有0.9%、0.01%和0.1%的葫芦素。在Citrullus colocynthis的茎、叶和果实中都含有葫芦素B、I和L(以游离和糖苷形式存在)。其中，果浆中含量最高，为0.22%，根中含量最低，为0.049%[25]。在Tropaeolum majus未成熟的果实中含有葫芦素B、D、E，但在成熟果实中葫芦素D消失。而且，未成熟的果实比成熟的果实中的葫芦素含量高[26]。在Citrullu equadorensis与笋瓜Cucurbita maxima、西葫芦C. pepo与C. texana的杂交F1代、C. equadorensis和C. texana的胚胎、果肉和果皮中葫芦素的含量有很大的差异。胚胎中葫芦素的含量明显高于果实的其他部分，而且随着植物的生长发育而迅速增加，但果肉不苦。在培育抗病毒的西葫芦品种时，常把C. equadorensis作为抗病毒源[27]。在南瓜属Cucurbita的18种植物中有7种植物的叶、果实和根都含有葫芦素B和D，同种植物葫芦素B的含量明显高于葫芦素D。葫芦素B含量较高的2种植物是C.ecuadorensis和C.andreana，根、叶和果实中葫芦素B的总含量分别为3.54mg/g(鲜重)和3.51mg/g(鲜重)。前者根中含量最高，可达2.89mg/g(鲜重)，后者果实中含量最高，达2.78mg/g(鲜重)。有6种植物的叶、果实和根中检测到葫芦素E和I，其中C. foetidissima的根和果实含有丰富的葫芦素I，分别为1.72mg/g(鲜重)和1.59mg/g(鲜重)。在C. palmata的根中含有葫芦素E和I，叶片只含有E，另外5种植物中的葫芦素含量﹤0.02mg/g(鲜重)[16]。南瓜属植物所含的葫芦素主要是葫芦素苷元，而不是糖苷。而葫芦科其他属植物含有的葫芦素主要以糖苷形式存在。因此，认为南瓜属是最原始的种类[16]。

许多研究证明，植物在受到昆虫和自然伤害或胁迫时，会被诱导产生防御性化合物，特别是植物次生物质种类和含量会发生明显的改变，这些变化会影响到昆虫取食、产卵行为，从而影响昆虫的种群动态。在葫芦科作物上，机械损伤或虫害能诱导植物体内葫芦素含量增加。二斑叶螨Tetranychus urticae取食黄瓜叶片后，黄瓜叶片中葫芦素C含量明显增加，使叶螨的种群数量明显下降[28]。机械损伤或南瓜瓢虫Epilachna borealis取食能诱导寄主叶片中葫芦素B和D的含量上升, 从而导致寄主植物对南瓜瓢虫的适宜性下降[29]。黄足黄守瓜Aulacophora femoralis

chinensis取食黄瓜后，黄瓜子叶中葫芦素C的含量在60min内增加10倍以上，15min后子叶中可以新合成葫芦素I，并在60min内达到75μg/g(鲜重)的水平，而葫芦素I和葫芦素C联合对黄足黄守瓜取食的抑制作用显著增加[10]。黄瓜通过增加葫芦素种类和浓度以避免黄足黄守瓜进一步侵食。

1.3 葫芦素的提取与定性定量分析

葫芦素由于其特殊的结构特征和在植物生长、生态系统以及治疗人类疾病中的重要意义而受到广泛关注，如何科学合理地确定植物及其制剂中葫芦素的种类和含量，对研究葫芦素的生态学功能及其开发利用都有重要的意义。从植物中提取葫芦素常用甲醇或乙醇浸提法，从动物血液中提取葫芦素可先在血浆中加入0.04mg/mL雌酚酮甲醇液混合，再用氯仿和乙腈(1∶1)提取[30]。葫芦素苷元难溶于水，易溶于氯仿，因此可以用这两个溶剂将葫芦素从甲醇或乙醇的粗提物中分离出来得到氯仿萃取物。氯仿萃取物经过硅胶、氧化铝或硅酸镁柱层析或薄层色谱层析(TLC)进一步分离获得纯化的葫芦素类化合物。对植物中常见的葫芦素B、C、D、E、I、J、K和L等化合物的分离纯化可用薄层色谱层析法和高效液相色谱法(HPLC)，选用普通的硅胶(硅胶F254)薄层色谱板，用甲苯-乙酸乙酯系统(甲苯∶乙酸乙酯=25∶75)作展开剂。高效液相色谱法选用C18反相柱，用甲醇-水系统(甲醇∶水=70∶30)洗脱。由于大多数葫芦素在分子中的A-环或侧链上都有α、β-不饱和酮结构，因此，在紫外吸收波长228—230nm范围有最大的吸收峰。对于植物活体内葫芦素的定性定量分析常用HPLC内标法[10,30- 31]，该方法用样量少、灵敏度高、重现性好，且操作简便、快速。孔垂华等[10]报道了液相色谱与质谱联用分析法(LC-MS)。样品首先用LC-MS进行定性测定，依据质谱分子量值及特征离子判断葫芦素的种类及相应色谱峰位置[10]。用HPLC检测植物活体组织中的葫芦素，可用氯仿直接匀化浸提，浸提液浓缩后加入反相C18 SepPak微固相萃取柱进行纯化，去掉干扰物质后再进行HPLC检测[10]。这种提取检测方法避免了传统方法在样品干燥、提取和化学测定中的误差，能比较精确地反映植物在不同环境条件下葫芦素种类及含量的变化规律。

2 葫芦素的生态功能 2.1 葫芦素对哺乳动物的防御作用

葫芦素是植物合成的、用以抵御植食性动物侵袭的一类化学防御武器，有抑制取食和毒害两方面的作用。葫芦素是至今分离得到的最苦的植物次生物质，即使稀释到1ppb浓度人类也能尝出来[5]。痕量的葫芦素就能引起舌和嘴唇几乎麻痹的反应。而且，葫芦素对哺乳动物也是有毒的。用葫芦素A、B和C分别注射到小鼠腹膜内，对小鼠的致死中量(LD50)分别为1.2mg/kg、1.1mg/kg和6.8mg/kg [32]。小鼠口服葫芦素I的LD50为5mg/kg，口服葫芦素E糖苷的LD50为40mg/kg。将自然晾干的Cucurbita texana果实以10%—20%的浓度加到饲料中饲喂小鼠3—6d后就出现死亡。当小鼠取食含有这种植物果实1%的饲料10周后，小鼠的死亡率达40%，存活下来的小鼠存在严重的腹泻和贫血[33]。在南非干旱地区，羊和牛取食了野生Cucumis leptodermus、C. africanus和C. myricapus的果实后严重中毒[1]。在澳大利亚昆士兰，有人吃了含有葫芦素E糖甙1.1mg/g的美洲南瓜Cucurbita pepo果实引起中毒[16,34- 35]。因此，含有大量葫芦素的葫芦科植物的叶片和果实不适合人类和其他植食性动物食用。