大黄素对小鼠动脉粥样硬化模型的干预研究

以大黄素为声敏剂介导声动力疗法对小鼠动脉粥样硬化治疗作用的研究

目的 探讨以大黄素为声敏剂介导声动力疗法对小鼠动脉粥样硬化治疗作用。方法 高脂饮食诱导ApoE-/-小鼠发生动脉粥样硬化。将50只ApoE-/-小鼠分为不做任何处理的模型对照组、以5-氨基酮戊酸介导的阳性对照组、大黄素高、中、低剂量介导SDT组，每组 10只。除模型组外，其余各组自高脂4周起，分别进行相应的声动力治疗，隔天1次，于12周处死小鼠。取心脏，制备切片，通过油红染色检测斑块大小。取主动脉，进行荧光定量PCR检测基质金属蛋白酶TMP-2、TMP-9和TIMP-1，分析对斑块稳定性的影响。同样检测细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-10和TGF-β，分析对炎症的影响。结果 大黄素介导声动力疗法能减轻动脉粥样硬化斑块大小；显著增加TIMP-1而降低TMP-2和TMP-9在主动脉的表达。显著降低促炎性细胞因子TNF-α和IFN-γ而增加抗炎性细胞因子IL-10和TGF-β在主动脉局部的表达。结论 大黄素介导声动力疗法可能通过降低炎症反应发挥抗动脉粥样硬化作用，该方法对于动脉粥样硬化的治疗具有积极意义。

Abstract：Objective To investigate the therapeutic effect of emodin as a

sonodynamic therapy on atherosclerosis in mice.Methods High fat diet induced

atherosclerosis in ApoE-/- mice.50 ApoE-/- mice were divided into a model control

group without any treatment，a 5- positive control group mediated by aminolevulinic

acid，a large emodin，a medium and low dose SDT group，10 rats in each group.In

益气活血化痰通络方干预Ａｐｏ－Ｅ基因敲除小鼠动脉粥样硬化的实验研究

摘要 目的：观察益气活血化痰通络方对Apo—E基因敲除小鼠动脉粥样硬化(AS)进展的影响。方法：24次6周龄Apo—E基因敲除小鼠普通饲料喂养4周后随机处死6只，取主动脉根部HE染色后普通光镜下观察，确定AS斑决形成。余下18只10周龄Apo—E基因敲除小鼠分为中药组及对照组各9只，分别以益气活血化痰通络方及生理盐水灌胃14周后处死。HE染色观察AS斑块的大小和血管狭窄度。酶法分析测定血脂，双抗体夹心ELISA法进行检测血白介素—6(IL—6)。结果：6周龄Apo—E基因敲除小鼠普通饲料喂养4周后主动脉根部即出现AS病变，实验结束后HE染色显示中药组较对照组斑块面积减少；前者血管狭窄度较后者显著降低(P<0.01)，中药组与对照组之间实验前后血脂水平均无差异，实验结束后中药组血IL—6水平较对照组明显降低。结论：用益气活血化痰通络方可抑制动脉粥样硬化，其机制可能与降低炎症因子水平有关。

关键词 炎症 动脉粥样硬化 益气活血化痰通络方 Apo—E基因 小鼠

动脉粥样硬化(AS)是不良心血管事件的主要原因之一，近来Ross在其提出的损伤反应学说的基础上明确提出：“动脉粥样硬化是一种炎症性疾病而不是单纯由于脂质沉积所致，炎症在动脉粥样硬化的各个时期都是突出的变化，而受累的动脉数量增多，可以导致全身性炎症活性增强，表现为血浆中的炎性标志物较多。”炎症是动脉粥样硬化发生、发展的中心环节，针对炎症机制有望寻找到控制动脉粥样硬化发生发展的更有效的治疗手段，有研究表明控制炎症可独立于局部的动脉粥样硬化负荷或缺血负荷之外而改善冠心病患者的预后。不稳定斑块富含炎症介质以及含剩余游离胆固醇巨噬细胞。游离胆固醇在巨噬细胞内的堆积可以导致炎症因子IL—6的分泌。本研究选用载脂蛋白E基因敲除小鼠为动脉粥样硬化模型，用益气活血化痰通络方对其进行干预，观察该方对动脉粥样硬化斑块的影响，并进一步探讨其机制，从而阐明其可能具有的临床效应，为指导合理的临床试验和可能的临床应用提供依据。

狼疮伴动脉粥样硬化小鼠模型中TLR4介导的免疫应答及干预效应研究

研究背景动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种慢性炎症性疾病，目前认为其发生、发展可能与自身免疫性炎症相关。系统性红斑狼疮(systemic

lupuserythematosus， SLE)是典型的自身免疫性疾病，患者AS相关性心脑血管疾病的发生率和死亡率显著增高。

近年来，有不少研究认为高迁移率族蛋白（high-mobility group box

protein l, HMGB1）、Toll样受体（toll-likereceptors， TLRs）是促进AS及SLE发生、发展的关键分子。但有关HMGB1-TLRs轴在SLE伴发AS中的具体免疫发生机制，尚未明确。

研究目的本实验采用ApoE-/-小鼠腹腔注射降植烷，建立红斑狼疮伴发AS模型，分析主动脉斑块HMGB1、TLR4受体及下游主要信号分子表达差异，并用Toll样受体4（TLR4）基因特异性RNA干扰（RNAi），进一步探讨TLR4信号在SLE伴发AS小鼠模型中的免疫病理机制，以期为深入AS的自身免疫性炎症机制及其潜在治疗新靶点提供理论依据。方法1.有效封闭TLR4基因表达的RNA干扰慢病毒载体的构建及筛选：用筛选出的TLR4-shRNA，转染小鼠平滑肌细胞株，荧光显微镜观察GFP表达强度，实时定量PCR检测各转染细胞TLR4mRNA表达水平，筛选出有效阻断TLR4表达的小分子干扰RNA载体。

2．动物模型建立及实验方案apoE-/-小鼠和B6小鼠随机分为apoE-/-+降植烷组(AS)、apoE-/-+生理盐水对照组(A)、B6+降植烷组(S)，B6+生理盐水组(C),各组小鼠在高脂喂养12周后，再分为颈动脉置管亚组、TLR4干扰亚组和不处理亚组，继续高脂喂养12周。3.病理学观察：主动脉树整体染色、头臂干动脉斑块连续切片，左肾动脉石腊切片，进行HE、油红、免疫组化/荧光染色等染色，观察如下指标：（1）慢病毒转染效率:荧光显微镜观察斑块及肾组织GFP的表达，实时定量PCR分析TLR4mRNA的表达；（2）新生内膜形成：观察颈动脉置管后诱发的新生内膜形成情况；（3）免疫组化分析腹主动脉血管外膜BAFF的定位表达；腹腔巨噬细胞原代培养油红染色分析脂质吞噬功能；（4）斑块负荷：en face油红染色分析主动脉树斑块数目与大小、斑块的面积百分比；（5）斑块易损性：分析斑块脂质、巨噬细胞、胶原纤维、和平滑肌细胞含量，计算易损指数：易损指数=(巨噬细胞+脂质)阳性面积百分比／(平滑肌细胞+胶原)阳性面积百分比；（6）普鲁氏蓝染色染色观察斑块内出血等发生情况，TUNEL染色分析斑块内细胞凋亡程度。

医学研夯：大黄素对肿宣昀抑制作用　皖南医学院　潘翔珍柴琳康繁华　【摘要］大黄素（１，３，８一三羟基一６一甲基蒽醌，ｅｍｏ￣ｎ）属蒽醌类衍生物，是从大黄属，蓼属，鼠李属植物和番泻叶中分离出来的主要成　分，有多种生物活性，如抗病毒，抗菌，免疫抑制和保肝及肿瘤抑制作用，尤以其肿瘤抑制作用明显且毒副作用低而备受关注。　［关键词］大黄素　肿瘤细胞抑制作用　１．大黄素的抗肿瘤作用　大量的国内外研究表明，大黄素对多种人和动物肿瘤有明显的抑　制作用，如乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌、肝癌、ＶＩ腔鳞癌、白血病等。　１．１体外研究　’　大黄素通过激活Ｃａｃｐａｓｅ一３通路能有效抑制人肺腺癌Ａ５４９细胞的　增殖”　。大黄素既能有效的抑制人胰腺癌ＰＣ一３的生长，又可以诱导细　胞凋亡，使其细胞周期被阻滞在Ｇ。期　。杜田锴等Ｐｌ发现大黄素对人胃　癌ＢＧＣ一８２３细胞的增殖和迁移具有明显的抑制作用，并可抑制肿瘤细　胞的分裂。Ｍａ　Ｙ　等研究表明大黄素能引起人结肠癌细胞株ＬＳ１０３４　的凋亡，并有明显的浓度依赖性。　Ｌｕ　Ｙ等　采用流式细胞仪法检测大黄素对人结肠癌细胞ＨＣＴ一１　１６　的抑制作用发现大黄素阻断ＨＣＴ一１１６细胞周期于Ｇ２／Ｍ期，并可引起　ＨＣＴ一１　１６细胞凋亡。　Ｈｓｕ　ＣＭ等１６］采用西方免疫印迹技术研究发现大黄素对肝癌细胞　Ｈｕｈ７，Ｈｅｐ３Ｂ，ＨｅｐＧ２细胞株有明显的抑制作用，使细胞阻滞在Ｇ２／Ｍ　期。在大黄素作用６ｈ后，细胞中ＧＤＦ１５，ＣＹＰ１Ａ１，ＣＹＰ１Ｂ１，ＣＹＲ６２２的　表达明显增高，而这些基因很可能作为治疗肝癌的生物标记物。　Ｃｈｅｒｔ等　１使用ＰＣＲ等技术检测大黄素能诱导人舌癌ＳＣＣ一４细胞株　的凋亡，大黄素能够显著抑制ＳＣＣ一４细胞ＤＮＡ损伤与修复相关基因的　表达，包括ＡＴＭ、ＡＴＲ、１４—３—３ｓｉｇｍａ、ＢＲＣＡ１、ＤＮＡ、ＰＫ和ＭＧＭＴ。　１．２体内研究　王春光等　选用３０只ＢＡＬＢ￣裸鼠建立荷瘤鼠模型，结果发现低、　中、高剂量组大黄素作用后肿瘤相对体积（ｖ厂ｖ。）与Ｏ．９％氯化钠溶液对　照组相比，大黄素处理组的肿瘤体积明显缩小，差异具有明显的统计学　意义（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１），可见大黄素对白血病细胞Ｋ５６２有明显的抑制作用。　徐贤绸等　将３０只胰腺癌原位移植瘤模型裸鼠分为对照组，实验　Ｉ组和实验Ⅱ组，对实验组给予不同浓度大黄素，免疫组织化学法检测　显示实验Ｉ、Ⅱ组肿瘤组织中ＰＩ，ＭＶＤ及ＭＭＰ一９的表达均明显降低，结　果表明大黄素具有抑制胰腺癌裸鼠原位移植瘤生长和转移的作用，其　可能是通过抑制肿瘤ＭＭＰ一９的表达而实现。　Ｃｈａ等［１０１研究表明，在模拟的两种前列腺癌小鼠模型中，腹腔注　射一定浓度大黄素的ＰＣ３一ＡＲ荷瘤裸鼠中小鼠肿瘤体积明显减小，在　Ｃ　／ＳＶ　。转基因小鼠中，治疗组小鼠的生存时间明显长于对照组，可见　大黄素对前列腺癌的生长有明显的抑制作用。　刘瑛等”ｕ将建立的人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型分为六组，空白对照　组、溶媒组、大黄素组、单纯放射治疗组、大黄素联合放射治疗组和单纯　照射对照组，高低剂量大黄素联合放疗组较其他实验组肿瘤生长明显　受到抑制，可见大黄素对人鼻咽癌裸鼠移植瘤具有放射增敏作用。　２．大黄素的抗肿瘤作用机制　２．１大黄素对肿瘤细胞周期的影响　廖子君等［１２１应用流式细胞检测技术发现大黄素作用后的肺癌Ａ５４９　细胞，ｓ和Ｇ　Ｍ期细胞比例显著降低，ＧＪＧ。期细胞比例相对增加，可见　大黄素有阻滞细胞周期的作用，同时可诱导肺癌细胞的凋亡。　ＣｈａｎｇＹｃ等　发现大黄素对白血病细胞ＷＥＨＩ一３有明显的抑制作　用，使细胞生长周期延长，在体内研究中还发现大黄素能增加Ｂ细胞，　单核细胞的数量，增强吞噬细胞的活性。　２．２抑制癌基因表达，诱导肿瘤细胞的凋亡　体内肿瘤的发生是一个多阶段多基因变化的过程，是由于机体在　各种致癌因素作用下局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正　常调控，从而导致其克隆异常而形成的新生物。大量的实验研究表明，　大黄素可以促进多种肿瘤细胞的凋亡，可通过以下几个方面来介导。　Ｌｉｕ　ＤＬ等ｎ　研究认为大黄素联合吉西他滨作用于胰腺癌后能迅速　激活ｃａｓｐａｓｅ一３，ｃａｓｐａｓｅ一３与细胞凋亡密切相关，同时ｃａｓｐａｓｅ一３又可以　激活ｃａｓｐａｓｅ一９，ｃａｓｐａｓｅ一９可直接诱导胰腺癌细胞的凋亡，又能正反馈作　用于ｃａｓｐａｓｅ一３，以此两条通路共同作用从而引起胰腺癌细胞凋亡。　ＮＦ—ｋＢ是体内重要的核转录因子，它可通过多种途径抗凋亡，使肿　瘤细胞得以免疫逃逸　。ＮＦ—ｋＢ抗凋亡，促进细胞增殖是导致正常细　胞恶变的潜在因素，它可促进抗凋亡蛋白的转录，如促进转录活化蛋　白一１（ＡｃｔｉｖａｔｏｒＰｒｏｔｅｉｎ一１，ＡＰ一１）的作用，Ｋｉｍ等”　研究证明大黄素通过　ＡＰ一１和ＮＦ—ｋＢ的活性来抑制神经胶质瘤透明质酸酶诱导的新型基质　金属蛋白酶一２（Ｍａｔｒｉｘ　Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ一２，ＭＭＰ一２）和ＭＭＰ一９的分泌。　Ｈｕａｎｇ　Ｑ等　研究表明，大黄素能体外抑制ＴＰＡ诱导的ＨＳＣ５　ＭＤＡ—ＭＢ一２３ｌ细胞侵袭，这主要是通过阻断ＡＰ一１　ＮＦ—ｋＢ信号通路而　抑制ＭＭＰ一９的表达。　何旭春等ｕ　等研究发现，大黄素作用于白血病ＨＥＬ细胞株后，可使　其凋亡同时检测到Ｐ—Ａｋｔ、Ｐ—ＧＳＫ３　Ｂ和ＨＳＰ７０的表达下调，可推测大　黄素可能通过抑制Ａｋｔ信号通路，解除其对Ｐ—ＧＳＫ３　Ｂ的抑制作用，使　其激活而诱导细胞凋亡，同时，激活的Ｐ—ＧＳＫ３　Ｂ使热休克蛋白因子磷　酸化，下调ＨＳＰ７０的表达而诱导细胞凋亡。　ｓｕ　ＹＪ等　从研究中发现，大黄素能抑制人类非小细胞肺癌Ａ５４９　和Ｈ１７０３的增殖，并检测到大黄素明显降低Ｒａｄ５１的磷酸化水平，下调　Ｒａｄ５１　ｍＲＮＡ和蛋白水平，从而实现其对肿瘤细胞的抑制作用。　２．３抑制肿瘤血管形成　肿瘤的血管生成是一个复杂的过程，阻断或抑制肿瘤血管生成的　任何一个环节，都可以抑制肿瘤血管的形成。Ｋａｎｅｓｓｈｉｒｏ等　研究表　明，大黄素在体内外可以通过抑制ＲＥＫ１和ＲＥＫ２的磷酸化，从而抑制　ＭＭＰ一９的生成和降低明胶酶的活性，起到了抑制肿瘤血管生成的作　用。吕盈盈等［２２１采用琼脂集落实验法，流式细胞术，酪氨酸激酶活性分　析，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测大黄素对结肠癌ＨＣＴ１１６细胞增殖和凋亡的影　响及对血管内皮生长因子（ＶＧＥＦ）的抑制作用，研究表明大黄素能抑制　结肠癌细胞生长，诱导细胞凋亡可能与通过抑制血管内皮生长因子有　一定的关系。　２．４抑制肿瘤细胞转移　肿瘤细胞的粘附力降低导致细胞从母体脱离和肿瘤细胞的扩散是　肿瘤转移的一个关键步骤，因此干预这一步骤被认为是预防和治疗肿　瘤转移的一个可行的方法。　曾雄义等　’Ｉ发现大黄素具有抗肿瘤一血管内皮细胞粘附能力的作　用，从而抑制肿瘤血管的生成而发生抗肿瘤转移的作用。刘岸等　研　究发现大黄素可抑制体外人胰腺癌ＳＷ１９９０细胞迁移和侵袭，呈浓度依　赖性，可使ＳＷ１９９０细胞中的ＮＦ—ｋＢ和ＭＭＰ一９的表达水平下降，同时，　大黄素还可明显抑制瘤荷裸鼠中胰腺癌的转移，并下调ＣＤ３４，ＮＦ—ｋＢ　和ＭＭＰ一９在胰腺癌组织中的阳性表达。Ｈｕａｎｇ　Ｑ等　证实，ＰＩ３Ｋ是大　黄素作用的靶点，大黄素可显著抑制ＥＧＦ诱导的Ｃｄｃ４２和Ｒａｃ１激活和　相应细胞骨架改变，通过干扰Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１与Ｐ２１激活酶复合物的形成，　阻断ＰＩ３Ｋ—Ｃｄｅ４２／Ｒａｃ１信号通路而抑制肿瘤细胞的迁移。　３．逆转肿瘤细胞的多药耐药性　肿瘤细胞多药耐药性的产生是导致肿瘤化疗失败的主要原因，因　此逆转肿瘤多药耐药性在控制肿瘤的复发和转移中扮演者重要的角　色。秦春明等　Ｉ通过噻唑蓝法，ＰＣＲ技术等检测到大黄素能逆转人卵　巢癌多药耐药细胞株ＳＫＯＶ３／ＤＤＰ的耐药性，并推测其可能是通过下调　ＨＩＦ一１　、ＳＴＡＴ１、ＧＳＴＰ１、ＣＫ２ｄ的表达起作用。ＨｕａｎｇＸＺ等　研究表　明，大黄素与顺铂等化疗药物联合用于多药耐药的前列腺癌细胞系　Ｄｕ一１４５细胞后，显著提升了肿瘤细胞对化疗的敏感性。欧冰凝等　用　ＭＴＦ法、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法和免疫组化法等检测大黄素有逆转人口腔鳞癌　细胞ＫＢＶ２００多药耐药性的作用，其机制可能与提高肿瘤内细胞内药物　累积量，促进肿瘤细胞的凋亡有关。　４．大黄素其他药物的协调作用　Ｃｈｅｎ　Ｈ等　发现大黄素能增强胰腺癌细胞ＳＷ１９９０对吉他西滨的　敏感性，诱导细胞的凋亡，且能减少吉他西滨的用量，减轻其毒副作　用。ｗａｎｇ　ｗ等［３Ｏｌ发现大黄素增强人胆管癌细胞对顺铂的敏感性，它们　联合应用能抑制凋亡激酶Ａｋｔ的活性，从而提高了细胞生长抑制率和　凋亡率。　５．结语　大黄素是传统中药的有效成分之一，具有多种生物活性，尤其以抗　肿瘤作用而逐渐成为近来年研究的热点，随着基础应用研究的不断深　入，其抗肿瘤作用和机制已逐渐被阐明，为ｌ临床治疗寻找抗肿瘤新药和　辅助化疗药物提供了可靠的理论依据，其抗癌谱广，毒副作用小，是一　种具有广泛应用前景的抗癌新药。　参考文献　作者简介：潘翔珍（１９８６一），女，汉族，辽宁省东港市人，硕士研究生，肿瘤分子病理方向；审校者：柴琳，女，副教授，皖南医学院硕士研究生导师。