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β-半乳糖苷酶固定化研究
江贤君;包建波
【期刊名称】《武汉工业学院学报》
【年(卷),期】2016(035)003
【摘要】用微孔陶瓷吸附和戊二醛交联复合法制备了固定化β-半乳糖苷酶。
试验结果表明：用3mm微孔陶瓷吸附，以2．0％戊二醛，时间1．5 h，温度25℃交联后，获得固定化酶活为146 U／g，固定化酶活力回收率为60．8％。
固定化酶最适温度为50℃，最适pH＝7。
固定化酶的k m ＝5．6 mmol／L。
半衰期为33 d。
【总页数】5页(P35-38,44)
【作者】江贤君;包建波
【作者单位】武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023;武汉博蓝科技发展有限公司，湖北武汉430014
【正文语种】中文
【中图分类】TS252
【相关文献】
1.α-半乳糖苷酶固定化的研究进展 [J], 解婉莹;董墨思;李苏红
2.固定化半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的研究 [J], 刘鑫龙;王立晖;汤卫华;潘志恒;程秀玮;孙勇民
3.产α-半乳糖苷酶菌株的筛选、酶学特性和固定化研究 [J], 赵晴潇;魏群
4.β-半乳糖苷酶固定化研究 [J], 江贤君;包建波;
5.以双醛氧化纤维素为载体的固定化β-半乳糖苷酶水解乳糖效果的研究 [J], 阎靳;郭庆启
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![一种基于固定化载体的β-半乳糖苷酶的固定化方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/521afb9da417866fb94a8e25.png)
专利名称：一种基于固定化载体的β-半乳糖苷酶的固定化方法专利类型：发明专利
发明人：江波,张涛,李美玲,沐万孟,缪铭
申请号：CN201510196113.8
申请日：20150423
公开号：CN104774831A
公开日：
20150715
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种基于固定化载体的β-半乳糖苷酶的固定化方法，属于生物工程技术领域。
本发明步骤是：（1）β-半乳糖苷酶的制备；（2）氨基功能化磁性FeO载体的制备；（3）氨基功能化磁性FeO材料固定β-半乳糖苷酶。
本发明具体制备方法包括：以FeCl·4HO和FeCl·6HO为铁源，氨水为碱，CHCOONa为阴离子表面活性剂，1,6-己二胺为氨基功能化试剂，利用化学共沉淀方法，一步合成表面带有氨基官能团的功能性磁性载体材料。
借助该材料表面修饰的氨基官能团及良好的磁性，将其应用于β-半乳糖苷酶的固定化。
申请人：江南大学
地址：214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学食品科学与技术国家重点实验室国籍：CN
代理机构：无锡市大为专利商标事务所(普通合伙)
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β-半乳糖苷酶的固定化及其应用摘要：β-半乳糖苷酶是一种来源广泛且具有多种用途的酶。
开发理想的载体是固定化研究的重要课题之一。
本文对乳糖酶为性质、应用及固定化方面的研究进行了综述。
Immobilization and Application of β-galactosidaseAbstract:β- galactosidase is a enzyme that source are abroad and was used in many filed. DeveloPing an ideal carrier one of the important topics of immobilization study. This paper reviewed the property, application and immobilization of lactase.关键字：β-半乳糖苷酶；应用；固定化乳糖酶(Lactase)的系统名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactoside galcagal-cato-hydrolase， EC.3.2.1.23)，或称β-半乳糖苷酶(β-galactosidaes)，乳糖酶为其商品名。
广泛存在于各种动物、植物及微生物中。
β-半乳糖苷酶能够催化β-半乳糖苷化合物中β-半乳糖苷键发生水解反应，将一分子乳糖水解成一分子葡萄糖和一分子半乳糖；另外乳糖酶还能还能通过转糖苷作用合成低聚半乳糖(简称GOS)。
GOS能有效促进双歧杆菌增殖、分解致癌物质、改善便秘、降低血糖、抗龋齿、促进钙吸收和维生素合成等，近年来备受关注[1]。
国外对β-半乳糖苷酶的研究较早，多集中在食品加工应用方面。
1889年，荷兰生物学家Beijerincek第一次报道了β-半乳糖苷酶可水解乳糖[2]。
β-半乳糖苷酶的最初应用也是利用其水解乳糖的性质来降低乳制品中的乳糖含量。
利用各种技术手段研究β-半乳糖苷酶对牛乳中乳糖的水解作用，对改善乳糖不耐症，充分发挥牛乳的保健作用和发展乳制品工业具有一定的现实意义。
探究提高米曲霉产β-半乳糖苷酶活力的方法摘要：不同来源的β-半乳糖苷酶性质各有不同，其中微生物所产的β-半乳糖苷酶由于其安全性以及性质稳定被广泛用于食品及工业应用。
因此，本文从β-半乳糖苷酶的固定化、基因组学研究以及培养条件的优化三方面对提高米曲霉产β-半乳糖苷酶量的方法进行综述，以期为提高该产物产量及扩大其应用领域提供方法和借鉴。
关键词：β-半乳糖苷酶；微生物；米曲霉；一、前言不同来源的β-半乳糖苷酶（β-gal），如：来源于微生物、植物或动物，其性质不同，其中微生物所产的β-gal，由于其安全性以及性质稳定被广泛用于食品及工业应用[1]。
在微生物中，细菌酵母菌及丝状真菌都可产β-gal，但只有丝状真菌产的此酶属于胞外酶，易于分离提取，且性质稳定。
米曲霉作为一种丝状真菌，具有较强的分泌各种酶的能力，如：蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶等[2]。
在米曲霉的代谢产物中，由于β-gal具有外切酶以及转糖基化的活性，而被广泛应用于乳制品行业，受到研究者的关注[3]。
因此，本文从β-gal的固定化、基因组学研究及培养条件的优化三方面来简要叙述提高米曲酶产β-gal的方法，以期扩大其应用领域。
二、β-半乳糖苷酶的固定化固定化酶比游离酶更适合工业应用，因为它们具有易于分离和重复使用及增强稳定性和储存寿命等的特性[4]。
大量的研究结果显示米曲霉产的β-gal可被固定在胶体阿弗兰、接枝尼龙膜、棉布上、卡拉胶和多利特A568树脂上，且固定化β-gal可有效改善固定化酶的性能，进而扩大了它在食品、能源和医药领域的应用[5]。
如：Sass [6]等人建立了两种简单易行的方法，将β-Gal以己二胺（HMDA）作为双功能接头共价固定在活化的明胶纳米纤维毡上，其次在静电纺丝过程中通过包埋到明胶纳米纤维中（悬浮静电纺丝），将米曲霉生产的β-gal 固化在静电纺明胶纳米纤维毡（GFM）上。
结果显示：与游离酶相比，固定化β-gal的Michaelis常数降低了50%，且低聚半乳糖产量提升了4%。
实验二β一半乳糖苷酶菌体细胞的固定化采用物理或化学的方法固定化微生物细胞，是利用酶或酶系的一条捷径。
对于固定化细胞，以微生物细胞在固定化后的生长状态可分为：固定化死细胞、固定化活细胞和固定化增殖细胞三类。
固定化死细胞是在固定化前或固定化后对微生物细胞进行加热、冷冻、干燥、表面活性剂、化学试剂等处理，使细胞处于死亡状态；固定化活细胞是在固定化后细胞仍存活但并不增殖；固定化增殖细胞是固定化后细胞不仅存活，而且在使用过程中还能增殖。
这三类固定化细胞中最令人感兴趣的是固定化增殖细胞。
因为多数微生物代谢的产物与其生长相关。
完整细胞的固定化对于细胞内酶的利用有明显的优点，它保持了酶在细胞内环境中的稳定性，成本低，可以利用细胞内的复合酶系进行反应。
当反应需要辅助因子时，固定化细胞的优点更加突出，因为活细胞能再生辅助因子。
微生物细胞的固定化方法与固定化酶的方法类似，有吸附法、包埋法和不用载体法。
固定化细胞的活力及其它性质与游离细胞有所不同。
细胞经固定化后，一般细胞的稳定性增加。
固定化细胞的最适反应温度、最适pH值、最大反应速度大多与游离细胞相同；饱和常数与游离细胞相比有的不变，有的变化很大，这可能是由于载体与底物间静电相互作用以及存在扩散效应的缘故。
一、实验目的学习细胞固定化的原理，通过用海藻酸钠包埋法固定含β一半乳糖苷酶的芽孢杆菌，掌握菌体细胞包埋固定的基本方法，了解固定化细胞在实际中的应用。
二、实验原理固定化的方法是把细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，滴进氯化钙溶液中，形成海藻酸钙凝胶小球。
细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。
三、实验步骤及方法1、试剂（1）芽孢杆菌细胞：将对数生长期的芽孢杆菌离心(3200r/min，20min)，收集细胞。
（2）海藻酸钠溶液：用蒸馏水配制2％的海藻酸钠溶液，灭菌后备用。
（3）2％氯化钙溶液。
（4）2mmol／L ONPG溶液。
（5）0.1mol／L pH7.O磷酸缓冲液。
（6）lmol／L Na2C03。
一、实验目的1. 了解乳糖酶的性质和作用。
2. 掌握乳糖酶固定化的基本原理和方法。
3. 研究不同固定化方法对乳糖酶活性的影响。
4. 探讨固定化乳糖酶在乳糖水解中的应用。
二、实验原理乳糖酶（β-半乳糖苷酶）是一种能够催化乳糖水解为葡萄糖和半乳糖的酶。
乳糖不耐受症患者由于体内缺乏乳糖酶，无法消化乳糖，导致食用乳制品后出现腹胀、腹泻等症状。
固定化乳糖酶可以克服传统酶制剂的缺点，如酶活性不稳定、易失活等，从而提高乳糖水解效率。
本实验采用化学结合法将乳糖酶固定化在载体上，通过比较不同固定化方法对酶活性的影响，筛选出最佳的固定化方法。
三、实验材料与仪器材料：1. 乳糖酶2. 载体：壳聚糖、明胶、海藻酸钠3. 乳糖4. 磷酸盐缓冲液5. pH计6. 离心机7. 酶标仪仪器：1. 烧杯2. 移液器3. 恒温水浴锅4. 电子天平5. 显微镜四、实验步骤1. 乳糖酶溶液的制备：将乳糖酶用磷酸盐缓冲液溶解，配制成一定浓度的酶溶液。
2. 载体的制备：a. 壳聚糖：将壳聚糖用磷酸盐缓冲液溶解，配制成一定浓度的溶液。
b. 明胶：将明胶用磷酸盐缓冲液溶解，配制成一定浓度的溶液。
c. 海藻酸钠：将海藻酸钠用磷酸盐缓冲液溶解，配制成一定浓度的溶液。
3. 乳糖酶固定化：a. 壳聚糖固定化：将壳聚糖溶液与乳糖酶溶液混合，搅拌均匀，加入一定量的交联剂戊二醛，反应一定时间后，用离心机分离固定化酶。
b. 明胶固定化：将明胶溶液与乳糖酶溶液混合，搅拌均匀，加入一定量的交联剂戊二醛，反应一定时间后，用离心机分离固定化酶。
c. 海藻酸钠固定化：将海藻酸钠溶液与乳糖酶溶液混合，搅拌均匀，加入一定量的交联剂戊二醛，反应一定时间后，用离心机分离固定化酶。
4. 固定化酶的活性测定：将固定化酶分别与乳糖溶液混合，在一定条件下进行水解反应，通过测定水解产物的浓度来计算酶的活性。
5. 结果分析：比较不同固定化方法对乳糖酶活性的影响，筛选出最佳的固定化方法。
五、实验结果与分析1. 固定化酶的活性：通过实验发现，壳聚糖固定化酶的活性最高，明胶固定化酶的活性次之，海藻酸钠固定化酶的活性最低。
酵母菌液体发酵生产β半乳糖苷酶的研究正文β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23 β-galactosidase)，又称乳糖酶(Lactose)，普遍存在于各种植物、植物及微生物中，是一种白色粉末，无味，溶解后是一种浅棕色液体。
乳糖酶位于小肠空肠段黏膜上皮细胞的刷状缘，催化β-半乳糖苷类化合物中β-半乳糖苷键，使其发作水解断裂，乳汁中的乳糖只要经乳糖酶的催化水解为葡萄糖和半乳糖后，才干被小肠吸收。
除能使乳糖分解生成半乳糖和葡萄糖外，还具有转半乳糖苷的作用。
少量研讨说明哺乳植物的乳糖酶活性随年龄的增长，具有典型的生理性降低，成人乳糖酶下降的不可逆受基因控制。
全世界乳糖酶缺乏的发作率在50%以上，而我国有90%左右成人缺乏乳糖酶。
假定乳糖酶缺乏者一次摄入较多乳糖，乳糖未能及时被消化吸收，惹起医学上的乳糖不耐受症(lactose intolerance)，其处置途径之一是采用外源性乳糖酶替补疗法[1，2]。
我国人口属乳糖酶缺乏的高发群体，由于乳糖酶的缺乏，对应用乳品作为廉价的植物蛋白及钙的来源以改善人群的营养状况形成困难。
为补偿肠道乳糖酶的缺乏，可采用微生物来源的乳糖酶预处置乳品消费低乳糖食品[3-5]。
应用乳糖酶水解乳糖的性质降低乳制品的乳糖含量，开发更易于被人体吸收、被更多的消费群体所适用的低乳糖系列奶制品已成为乳品行业的新亮点。
但是众多要素诸如制备酶的进程中酶生机的损失、消费工艺复杂、产量高等制约了乳糖酶在消费中的运用，其中很重要一点是本钱太高。
因此很多学者在构建高效消费乳糖酶的菌株，挑选酶学性质更为优秀的乳糖酶，培育基的优化等方面做了少量研讨。
随着迷信技术的开展，乳糖酶的作用被研讨得愈加透彻，现已在许多方面被运用：(1)在乳品工业中的运用。
乳糖酶除了可以减轻乳糖不耐症症状外，还可以改善乳制品的外观和口感，防止乳糖在炼乳中结晶，并能添加炼乳的甜度；还可以催化乳糖水解进程中发生的半乳糖基转移至乳糖等受体上，构成低聚半乳糖。
β-半乳糖苷酶固定化及低乳糖奶制备技术的研究乳糖是乳制品、坚果及水果等食品中最常见的糖类，乳糖酶(β-D-Galactosidase，简称β-gal)可以有效的催化乳糖的水解，从而节约添加剂的使用，改善产品的质量和口感以及延长保质期等优点。
目前，β-gal的制备情况仍然存在这么几个缺陷：（1）不能保证存在较高水平的稳定性和表达；（2）可能被其他木糖水解酶和淀粉水解酶干扰；（3）有可能因为酶活性的数量或质量上的下降而干扰产品质量。
为了解决上述问题，研究人员尝试了加强β-gal酶活性的不同方法，其中比较有效的有酶固定化技术和低乳糖奶制备技术。
首先是酶固定化技术。
该技术利用固定的β-gal酶从乳糖分离出低聚糖，甘露聚糖和双糖类化合物等葡萄糖链，从而改善它的性质和抗酵剂的能力。
这个技术的特点在于可以有效的抑制除乳糖外的其他木糖水解酶和淀粉水解酶，同时还可以稳定β-gal酶，有效地提高它的活性，从而有效地提高乳糖水解反应的效率。
其次是低乳糖奶制备技术。
它主要是通过中和乳糖分离出聚乳糖，然后发酵制备低聚乳糖奶。
此技术通过分离出多种乳糖块蛋白质，改善了乳糖的水解特性，同时使用低聚乳糖奶可以改善乳制品的口感，减少乳制品的黏度，而且还具有较好的耐受性和长期抗菌能力。
总之，β - gal固定化技术及低乳糖奶制备技术是当前乳制品加工技术领域中最有效的方法，为高质量乳制品制备提供了可行性，并可有效降低产品成本，保证产品质量。
这种技术的发展和应用可以改善乳制品的品质，增强乳制品的持久性，促进低乳糖产品的发展，并促进乳制品行业的清洁生产。
此外，它也可以解决乳糖的水解过程中产生的种类繁多的添加剂的分散混合问题，有助于增强乳制品的有机物质、膳食纤维和矿物质的吸收率。
β-D-半乳糖苷酶壳聚糖固定方法、特性及应用研究摘要“乳糖不耐症”是影响我国乳业发展的瓶颈技术之一，而利用固定化β-D-半乳糖苷酶水解奶中的乳糖是解决“乳糖不耐症”的有效方法。
本研究以壳聚糖为载体和戊二醛为交联剂，采用共价交联和吸附交联的方法，优选出不同形态壳聚糖固定化乳糖酶的方法，并进一步研究了固定化乳糖酶的特性和应用的效果。
另外，还比较研究了测定乳糖水解率的方法，优选出了简便、准确和快捷的测定方法。
主要得出以下结论：1. 对碘量法、蒽酮法、费林法、旋光法和酶催法测定乳糖的准确性和精密性进行了比较研究，结果表明酶催法测定乳糖水解率的标准偏差为0.0102，变异系数为2.7935%，其准确性和精密度好，操作简单快速，是一种准确、经济和快捷的乳糖水解率测定方法。
2. 对壳聚糖薄膜、壳聚糖凝胶和壳聚糖珠3种形态固定化乳糖酶的优化方法及其活力回收率进行了比较研究，结果表明壳聚糖珠与戊二醛吸附交联固定化乳糖酶的活力回收率最高达到52.9%，壳聚糖凝胶与戊二醛共价交联固定化乳糖酶的活力回收率最高达到71.1%，壳聚糖薄膜与戊二醛共价交联固定化乳糖酶的活力回收率达到77.8%。
3. 壳聚糖膜与戊二醛共价交联固定化乳糖酶的最佳工艺条件为：戊二醛浓度为2.5%，pH值为6.5，乳糖酶浓度为0.4 mg/mL，交联时间12h，4℃下固定12h。
4. 壳聚糖膜与戊二醛共价交联法固定乳糖酶的特性发生了变化。
与游离酶相比，固定化后酶最适pH由6.8移至6.5，固定化酶的最适温度由40℃升至45℃, 60℃保温1h后仍保留初始活力的50%，而游离酶则几乎完全失活；固定化乳糖酶米氏常数Km与游离酶相比差异不大，说明在对底物的亲和性上，在乳糖酶固定化后能够基本上按游离酶一样进行。
固定化酶重复使用8次后其活力仅损失10%；4～12℃下储存25d后固定化酶活力仍保留50%以上。
5. 研究了壳聚糖膜固定化乳糖酶在不同条件下水解乳糖的特性，结果表明：①随着固定化酶用量的增加，单位时间内对牛奶中的乳糖水解率升高，即在4℃下，达到70%以上水解率所需的酶量和时间为：酶添加量10.0g/25mL，水解18h；酶添加量14.0g/25mL，水解18h。
双醛氧化纤维素固定化β-半乳糖苷酶
郭庆启;张娜;方桂珍
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2011(037)001
【摘要】以双醛氧化纤维素为载体固定化β-半乳糖苷酶,研究了固定化酶的制备条件、微观结构及酶学性质,结果表明:固定化时间为4 h,[酶]/[载体]=1∶15(g∶g)时,固定化酶的活力最高为0.517 U/g.红外光谱和扫描电镜对固定化酶的微观结构研究表明,双醛氧化纤维素的醛基与β-半乳糖苷酶的氨基发生共价反应形成固定化酶.与游离酶相比,β-半乳糖苷酶经过固定化后热稳定性和耐酸碱性增强,米武方程分析表明,β-半乳糖苷酶经固定化后与底物的亲和力降低,固定化酶重复使用5次后,相对酶活力为63%.
【总页数】5页(P89-93)
【作者】郭庆启;张娜;方桂珍
【作者单位】东北林业大学林学院,黑龙江,哈尔滨,150040;哈尔滨商业大学食品科学与工程黑龙江省高校重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150076;东北林业大学,生物质材料科学与技术教育部重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150040
【正文语种】中文
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β-半乳糖苷酶活性检测nifH-lacZ表达的β-半乳糖苷酶活性测定：（1）液体活化待测菌株，将待测菌株接种于5ml含适当抗生素的液体L3基本培养基中，37℃摇床，250rpm振荡，过夜培养；（2）收集菌体，并用无氮的L3基本培养基洗2次；（3）将菌液用不含氮的L3培养基稀释至OD600=0.2~0.4；（4）将4ml菌液注射至事先配气的血清瓶中（空气+氩气，调整合适的氧气浓度，微好氧3%），37℃，200rpm诱导3.5~4hr（每个样品3个重复）；（5）取出2ml样品于离心管中，100μl用于测定β-半乳糖苷酶活性，其余用于测定OD600；（6）100μl样品加到2ml离心管中，加入900μl Z-Buffer混匀，加入20μl 0.1%SDS，40 μl 氯仿，振荡20~30sec，同时设两个空白对照，加入100μl不含菌体的培养基作为样品，其余与测试样品的处理完全一致；（7）样品和ONPG (4mg/ml)置于28℃水浴平衡5~10min，依顺序加入200μl ONPG并准确计时，直至样品变黄，加500μl 1M Na2CO3溶液终止反应，准确记录反应时间；（8）离心12000rpm，15min，取上清测定OD420和OD550。
按以下公式计算β-半乳糖苷酶的活性：（T：反应时间，V：反应中菌体体积）β-半乳糖苷酶活性分析试剂:（1）Z-buffer：16.1g/L Na2HPO4·7H2O；5.5g/L NaH2PO4·H2O；0.75g/L KCl；0.246g/L MgSO4·7H2O；调pH至7.0，121℃灭菌30min，室温可保存一年。
（2）Z-buffer/β-ME ：100ml Z-buffer中加入0.27ml β-巯基乙醇。
（3）ONPG(邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷): 提前两小时将ONPG溶于Z-buffer/β-ME中，浓度为4mg/ml，-20°C保存。
β半乳糖苷酶的调节机制β半乳糖苷酶，这个名字听起来是不是有点复杂呢？别担心，我来给你讲讲这位“明星”的调节机制，简单易懂又不失乐趣。
β半乳糖苷酶是一种重要的酶，主要负责分解乳糖，也就是我们喝牛奶时遇到的那个糖。
想象一下，如果没有它，很多人就会变成“奶糖地雷”，喝了牛奶就肚子疼，那场面可真让人捧腹啊！这位酶的工作原理就像一位高效的清洁工，专门扫荡乳糖，让我们的小肚子保持舒畅。
不过，这位清洁工并不是随心所欲工作的，它有自己的“上班时间”和“工作规则”。
说到调节机制，这就像是一个大老板在管理一家公司，决定什么时候开门，什么时候关门，确保一切有序进行。
举个例子，β半乳糖苷酶在肠道中的活性会受到多种因素的影响，比如饮食、环境，甚至是你的情绪。
这就像是在和你说：“今天的工作安排我来定，你爱吃什么，我就给你准备什么！”再说说这个调节机制吧，它可真是个复杂的大家伙。
有一种叫“诱导作用”的机制。
就好比你平时不爱吃辣的，突然有一天被朋友拉去吃火锅，辣味一上来，你的味蕾就开启了新的篇章，哇，那种感觉简直妙不可言。
β半乳糖苷酶也是一样，当你摄入乳糖时，它就像是“哇，这下有工作要做了！”于是立刻加速工作，让你消化得舒舒服服。
这种诱导机制可真是让人赞叹，它用一种自然的方式，告诉你的身体“该行动了”。
然后，还有一个调节机制叫“抑制作用”，简单来说，就是在某些情况下，β半乳糖苷酶需要暂时放个假。
比如说，如果你这段时间不吃乳糖了，身体就会告诉这位酶：“嘿，停一下吧，休息一下吧！”这种机制就像是老板说：“今天不需要加班，大家放松一下。
”这样做的好处是，避免酶的浪费，让身体资源得到最有效的利用。
想想看，这种节省可不止是为经济着想，也是为你的健康考虑呢！β半乳糖苷酶还受到其他因素的调控，比如一些激素和营养物质。
就好比你在家里，有时候得听老婆大人的话，有时候又得照顾小孩。
这种调节机制就是让酶在不同的环境和需求下，保持灵活性。
你想想，这种适应性多么重要！就像是生活中，我们常常需要根据实际情况调整计划，有时候得当个乖宝宝，有时候又要勇敢尝试新事物。
β-半乳糖苷酶供体片段定点突变、表达、纯化与活性分析李黄金;陈伟;赵林;黄志健【摘要】目的构建含ε-NH2标记位点的克隆酶供体免疫分析(CEDIA)系统供体片段.方法从大肠杆菌基因组克隆β-半乳糖苷酶(β-gal)的α片段基因,通过定点突变在原精氨酸位点处引入赖氨酸突变,与硫氧环蛋白(Trx)融合表达后与Δα片段进行酶学互补活性分析.结果克隆的α片段为β-gal N端1-56多肽片段,定点突变得R14K、R53K和R14K/R53K等3种突变体.融合表达产物经亲和层析后纯度达到90%以上,且4种α片段的纯度基本一致.各纯化产物显示了不同的酶学互补活性,其中R53K突变体的活性远高于R14K和R14K/R53K的,且与野生型α片段的基本一致.结论α片段R53K突变体具有作为CEDIA系统含内部标记位点供体的潜力.【期刊名称】《广东药学院学报》【年(卷),期】2010(026)004【总页数】4页(P412-415)【关键词】β-半乳糖苷酶;供体;标记位点;互补【作者】李黄金;陈伟;赵林;黄志健【作者单位】广东药学院,生命科学与生物制药学院,广东,广州,510006;广东药学院,生命科学与生物制药学院,广东,广州,510006;广东药学院,生命科学与生物制药学院,广东,广州,510006;广东药学院,生命科学与生物制药学院,广东,广州,510006【正文语种】中文【中图分类】Q814.9;Q785克隆酶供体免疫分析(cloned enzyme donor immunoassay,CEDIA)技术是一种基于β-半乳糖苷酶(β-gal)α互补的均相酶免疫分析技术[1]，由于特异性强、灵敏度高、且操作简单而快速，目前已广泛应用于临床检验、药物滥用筛查、食品有害残留检测与环境污染监控等方面[2，6]。
CEDIA系统由β-gal酶供体(α片段)、受体(Δα片段)、标记抗原(待测物)和抗体组成，抗体与标记抗原的结合可导致β-gal 互补活性的下降，而当样品中含有待测抗原时，待测抗原与标记抗原竞争结合抗体，并最终表现为样品中的抗原浓度与酶活性呈正相关。
