微生物实验2

实验二微生物细胞计数与显微测量一、实验目的与要求1、了解血球计数板结构，掌握血球计数板计数微生物数量的技术。

2、了解目镜测微尺和物镜测微尺，掌握显微镜下测定微生物细胞大小的技术。

二、微生物细胞计数1、血球计数板的结构：4条竖槽和1条横槽；计数室（即正中间的大方格）大小为1mm×1mm×0.1mm；计数室共有400个小格，划分有两种可能：16中格×25小格或25中格×16小格。

菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，因血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。

2、血球计数板的使用（1）低倍镜下观察空白的血球计数板，找到计数室，注意应用调光旋钮、聚光镜和光圈调节视野亮度，建议将调光旋钮调到较亮的位置、聚光镜上升、光圈调到较小的位置。

（2）滴加稀释至适宜浓度的样品，盖上特制的盖玻片，静置5-10min. 也可以先盖上盖玻片，再沿槽滴加样品。

以酵母菌为例，以小格内含4-5个酵母菌为宜。

（3）在低倍镜下寻找大方格，将正中间的大方格（即计数室）移至视野正中央，再根据需要换上高倍镜计数。

3、血球计数板的计数方法（1）计数室含25个中格时，取4个角的中格及中间1个中格计数；计数室含16个中格时，取4个角的中格计数。

当样品中的细胞数较少时，应计算所有中格中的细胞。

每个样品须重复计数2-3次。

（实验室现有的血球计数板均为25中格的格式。

）（2）计数时需调节细准焦螺旋，以看到计数室内不同深度的微生物细胞（3）压线的细胞的计数方法：计压左线和上线的细胞或压右线和下线的细胞。

4、计算方法：样品细胞数（个/mL）=每小格的细胞数×400×10000×稀释倍数三、草履虫大小（长*宽）的显微测量1. 目尺和物尺的形态、安装及用途。

注意物尺每一小格代表的实际长度。

2. 标定：两尺平行--记录两尺重合线之间的刻度数--计算标定结果（即某一放大倍数下，目尺一小格代表的实际长度）。

实验二微生物的分离、纯化和接种微生物的分离、纯化1、目的要求1.1了解微生物分离和纯化的原理1.2掌握常用的纯化分离微生物的方法2、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。

其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、pH值、温度和溶解氧等要求，或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。

而纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。

本实验将在混合有几种微生物菌液中分离纯化出两种微生物来。

3、实验材料3.1培养基肉汤培养基（固体）。

3.2溶液或试剂盛4.5ml无菌水的试管，其中有一只盛有玻璃珠。

3.3仪器或其他用具无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，涂布器等。

4流程倒平板制备梯度稀释液涂布（或划线法）培养挑单菌落保存。

5、步骤5.1平板划线分离法5.1.1倒平板倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后置于桌面上，待凝固后即成平板(教材p367图13-14)。

并用记号笔标明培养基名称、菌液编号和试验日期。

5.1.2划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取菌悬液一环在平板上划线(教材p367图13-15)。

划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。

实验二微生物的分离、纯化和接种微生物的分离、纯化1、目的要求1.1了解微生物分离和纯化的原理1.2掌握常用的纯化分离微生物的方法2、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。

其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、pH值、温度和溶解氧等要求，或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。

而纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。

本实验将在混合有几种微生物菌液中分离纯化出两种微生物来。

3、实验材料3.1培养基肉汤培养基（固体）。

3.2溶液或试剂盛4.5ml无菌水的试管，其中有一只盛有玻璃珠。

3.3仪器或其他用具无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，涂布器等。

4流程倒平板制备梯度稀释液涂布（或划线法）培养挑单菌落保存。

5、步骤5.1平板划线分离法5.1.1倒平板倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后置于桌面上，待凝固后即成平板(教材p367图13-14)。

并用记号笔标明培养基名称、菌液编号和试验日期。

5.1.2划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取菌悬液一环在平板上划线(教材p367图13-15)。

划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。

实训二微生物实验常用灭菌和消毒方法一、实验目的1、学习微生物实验常用灭菌消毒方法；2、掌握高压蒸汽灭菌法、干热灭菌法等常用灭菌方法；3、熟悉灭菌消毒过程中的注意事项。

二、实验原理消毒是指杀灭或清除传播媒介上病原微生物，但不一定杀灭芽孢，使其达到无害化的处理。

灭菌是指杀灭或清除传播媒介上所有微生物，包括芽孢。

灭菌方法通常分为：（1）加热灭菌；（2）过滤除菌；（3）射线灭菌和消毒；（4）化学药剂灭菌和消毒。

以下介绍几种微生物实验常用灭菌消毒方法。

（一）干热灭菌干热灭菌是指利用干热空气杀灭微生物，一般在电烘箱中进行。

由于蛋白质在干燥无水的情况下不容易凝固，干热灭菌所需温度较湿热灭菌高，时间也较湿热灭菌长。

一般须在140℃左右保持恒温3-4h，方能达到灭菌的目的。

干热灭菌适用于空玻璃器皿的灭菌，凡带有橡胶的物品和培养基，都不能进行干热灭菌。

烘箱内装入物品应留有空隙，以利于空气流动，否则箱内受热不均，部分物品灭菌不彻底。

（二）高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌是一种湿热灭菌方法，是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。

待锅内冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热。

由于此时水蒸气无法排出，增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。

高压蒸汽是最有效的灭菌法，能迅速地达到完全彻底灭菌的效果。

一般在121℃灭菌15-30min，所有微生物包括芽孢在内都可杀死。

在同一温度下，湿热杀菌效果比干热好，因为微生物细胞蛋白质在湿热情况下更易凝固。

高压蒸汽灭菌锅有立式和卧式两种。

各种微生物的营养体在100℃温度下半小时即可被杀死，而其芽孢和孢子在这种条件下却不会失去生活力。

间歇灭菌就是根据这一原理进行的。

间歇灭菌是保持100℃，30min杀死培养基内杂菌的营养体，然后将含有芽胞和孢子的培养基在温箱内或室温放置24h，使芽孢和孢子萌发为营养体，再用100℃处理30min，再放置24h。

细菌一般形态染色观察一、实验目的学习了解微生物染色的基本原理与方法学习掌握细菌的简单染色和革兰氏鉴别染色技术巩固显微镜油镜的使用方法。

二、实验原理细菌的个体极微小，无色透明，必须借助于染色法，使细菌（或背景）着色，与背景（或菌体）形成明显的对比便于在显微镜下观察细菌的形态构造。

染色方法主要有：见下图简单染色法简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。

适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。

常用染料有：碱性染料：结晶紫、碱性复红、龙胆紫、番红、中性红、孔雀绿等。

酸性染料：酸性复红、刚果红、曙红等简单染色一般常用碱性染料进行染色原因：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，带正电荷，因此碱性染料很容易与细菌结合使细菌着色细菌细胞壁含有蛋白质或多肽，也就有等电点已知细菌的等电点pH为2～5。

革兰氏阳性菌为2～3，革兰氏阴性菌为4～5。

当细菌的培养液pH值大于等电点时，细菌带有负电荷；反之，带有正电荷。

一般，细菌的培养、染色、试验过程均在偏碱性（7～7.5）、中性、偏酸性（6～7）条件下，都高于细菌的等电点，故均带有负电荷革兰氏染色革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法，根据细菌对这种染色反应的不同，可分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两大类，其机理是由于细菌细胞壁的化学组成及结构不同和通透性不同的缘故。

革兰氏染色对于细菌的分类、鉴定及食品卫生检测都有重要意义。

革兰氏染色原理影响革兰氏染色结果的因素菌龄培养基pH值染色技术：涂片质量、染色时间、脱色时间、染色脱色均匀度等三、实验器材1. 器材：显微镜，擦镜纸，二甲苯，香柏油，载玻片，接种环，酒精灯,火柴，吸水纸，无菌牙签。

2. 染色液及试剂：石碳酸复红染液、碱性美蓝染液、结晶紫染色液，路戈氏碘液，95％的酒精，蕃红染色液，黑色素水溶液，蒸馏水。

3. 菌种：白葡萄球菌、大肠杆菌的新鲜斜面菌种各1支。

四、操作步骤（一）简单染色涂片火焰固定染色水洗干燥镜检（二）革兰氏染色涂片→干燥→火焰固定结晶紫染色→水洗碘液媒染95%酒精脱色→水洗蕃红复染→水洗干燥镜检（三）口腔中微生物观察负染色五、实验报告1、实验结果绘图2、思考题（1）细菌制片过程应注意哪些？（2）试分析菌龄、培养pH、染色技术对革兰氏染色结果的影响。

微生物实验教案实验一显微镜油镜的使用和细菌形态的观察一、实验目的以染色玻片为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。

二、实验原理圈、:镜座、a：镜口角（即入射角）。

3油镜使用的原理油镜，即油浸接物镜。

当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。

若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。

三、实验材料1显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。

2枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的玻片染色标本。

四、实验方法与步骤（1）用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。

（2）调节光亮度。

油镜使用的原理绘制细菌形态六、思考题1油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？2使用油镜时，为什么必须用镜头油？七、实验注意事项1不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。

2镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。

3观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。

当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以带正电荷的碱性染料。

染料适用于热固定的涂片，染料与菌体细胞质黏附使菌体着色。

经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比。

三、实验材料1显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。

2、培养12-18h的枯草芽孢杆菌和大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌。

3、简单染色液（美蓝染色液、黑色素液或炭素墨水）四、实验方法与步骤1、活菌制片观察取一张干净的载玻片，在其中央滴上一滴干净的蒸馏水，取培养六、思考题1镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？2根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？七、教学反馈实验三细菌的革兰氏染色一、实验目的1掌握革兰氏染色。