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LentiCRISPRv2 and lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA CRISPR (C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R epeats) is a microbial nuclease system involved in defense against invading phages and plasmids. CRISPR loci in microbial hosts contain a combination of CRISPR-associated (Cas) genes as well as non-coding RNA elements capable of programming the specificity of the CRISPR-mediated nucleic acid cleavage. Lentiviral CRISPR/Cas can infect a broad variety of mammalian cells by co-expressing a mammalian codon-optimized Cas9 nuclease along with a single guide RNA (sgRNA) to facilitate genome editing (Shalem*, Sanjana*, et al., Science 2014). Protocols for cloning into the lentiviral transfer plasmid and general considerations for producing lentivirus are described below. Separate protocols are available for amplifying the genome-scale CRISPR knock-out (GeCKO) libraries. This protocol is for creating individual lentiviral CRISPR plasmids targeting a single genomic locus.lentiCRISPRv2 (one vector system): This plasmid contains two expression cassettes, hSpCas9 and the chimeric guide RNA. The vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page.lentiGuide-Puro (two vector system): This plasmid expressed only the chimeric guide RNA. It does not contain Cas9. Please use lentiCas9-Blast (a separate lentiviral construct that delivers hSpCas9 and blasticidin resistance) to first integrate Cas9 into your cell line. The lentiGuide-Puro vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page.Which vector to use: lentiCRISPRv2 is identical to the original lentiCRISPRv1 but produces nearly 10X higher titer virus. lentiGuide-Puro produces >100X higher titer virus over lentiCRISPRv1 and should be used in cell lines where Cas9 has already been integrated in (e.g. using the separate lentiCas9-Blast lentivirus). For applications where Cas9 cannot first be introduced (e.g. primary cells), lentiCRISPRv2 is recommended. After transduction, use puromycin to select for cells with lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro.Lentiviral production: Before starting any lentiviral work, please ensure compliance with your Environmental Health and Safety office and government/organization/university. Briefly, to make lentivirus, a transfer plasmid (e.g. lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro) must be co-transfected into HEK293(F)T cells with the packaging plasmids pVSVg (AddGene 8454) and psPAX2 (AddGene 12260). As a positive control for viral production, we often use a CMV-EGFP lentiviral transfer plasmid (eg. AddGene 19319).Target design notes and online resources: For application of Cas9 for site-specific genome editing in eukaryotic cells and organisms, we have computationally identified suitable target sites for the S. pyogenes Cas9 and calculated most likely off-targets within the genome. Please visit to access these Cas9 target design tools. Complete plasmid sequences, protocols, a discussion forum and additional information can be found at the Zhang Lab GeCKO website: /gecko/ . Citation: Please reference the following publications for the use of this material.Improved lentiviral vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Sanjana NE*, Shalem O*, Zhang F. Nature Methods (2014).Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Shalem O*, Sanjana NE*, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelsen T, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F (2014). Science, 343, 83-7. DOI: 10.1126/science.1247005Target Guide Sequence Cloning ProtocolIn order to clone the target sequence into the lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro backbone, synthesize two oligos of the following form. All plasmids have the same overhangs after BsmBI digestion and the same oligos can be used for cloning into lentiCRISPRv2, lentiGuide-Puro or lentiCRISPRv1.Example oligo design : Note that the NGG PAM is not included in the designed oligos. Oligonucleotide ordering tips : Standard de-salted oligos (usually the most inexpensive synthesis) are sufficient forcloning. If not already resuspended, dilute each oligo to 100 µM in sterile water or TE.* * * * *Lentiviral vector digestion, oligo annealing and cloning into digested vector:1. Digest and dephosphorylate 5ug of the lentiviral CRISPR plasmid with BsmB I for 30 min at 37C: 5 ug lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro 3 ul FastDigest BsmB I (Fermentas) 3 ul FastAP (Fermentas) 6 ul 10X FastDigest Buffer 0.6 ul 100 mM DTT (freshly prepared) X ul ddH 2O 60 ul total2. Gel purify digested plasmid using QIAquick Gel Extraction Kit and elute in EB. If BsmBI digested, a ~2kb filler piece should be present on the gel. Only gel purify the larger band . Leave the 2kb band.3. Phosphorylate and anneal each pair of oligos: 1 ul Oligo 1 (100 µM) 1 ul Oligo 2 (100 µM) 1 ul 10X T4 Ligation Buffer (NEB) 6.5 ul ddH 2O 0.5 ul T4 PNK (NEB M0201S) 10 ul total Please use the T4 Ligation Buffer since the buffer supplied with the T4 PNK enzyme does not include ATP (or supplement to 1mM ATP).Put the phosphorylation/annealing reaction in a thermocycler using the following parameters: 37o C 30 min 95o C 5 min and then ramp down to 25o C at 5o C/min4. Dilute annealed oligos from Step 3 at a 1:200 dilution into sterile water or EB.5. Set up ligation reaction and incubate at room temperature for 10 min:X ul BsmB I digested plasmidfrom Step 2 (50ng)1 ul diluted oligo duplex from Step 4 5 ul 2X Quick Ligase Buffer (NEB) X ul ddH 2O 10 ul subtotal1 ul Quick Ligase (NEB M2200S) 11 ul total Also perform a negative control ligation (vector-only with water in place of oligos) and transformation.6.Transformation into Stbl3 bacteria . Lentiviral transfer plasmids contain Long-Terminal Repeats (LTRs) and must be transformed into recombination-deficient bacteria. We use homemade Stbl3 (propagated from Invitrogen C7373-03) and get excellent plasmid yields. Although other RecA- strains may work, we have found the most consistent transformations and yields using Stbl3.。
慢病毒使用操作手册：1 慢病毒使用操作2 慢病毒安全使用规范3 悬浮细胞感染方法概要4 相关专业术语(详情可参考公司网站FAQ)5 细胞培养器皿的相关参数1、慢病毒使用操作手册1.1 慢病毒的储存与稀释:1.1.1 病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）A．病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。
1.1.2 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。
1.2 慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞1.2.1 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invabio提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。
如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）1.2.2 慢病毒感染目的细胞预实验1.2.2.1 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项A．测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。
B．在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
C． Invabio提供的病毒单位为TU/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。
慢病毒感染敲低流程
一、慢病毒包装
1．复苏293T细胞于10cm皿中，传至第3-4代。
2．转染病毒包装质粒（PEI转染）：
（1）转染前2小时换无血清培养基。
（2）质粒DNA稀释至1mlDMEM中，枪头吹匀（8μg shRNA 和各4μg pMDLg/pRRE, RSV-Rev, CMV-VSVG）。
（3）20μL PEI稀释至1mlDMEM中，用枪头缓慢吹匀，室温放置5min。
（4）DNA稀释液加到PEI稀释液中，缓慢吹匀,室温放置5min。
（5）DNA和PEI混合液加入到10cm皿293T细胞中，摇匀后于培养箱培养。
（6）4h后换有血清培养基。
3. 48h 和72h收集病毒液，保存于4度冰箱。
合并病毒液，3000rpm 离心10min取上清，0.45μm滤膜过滤，收集滤液。
二、病毒感染筛选
1．复苏HELA细胞于10cm皿中，传至2-3代。
2．细胞大约70%汇合度时，换8μg/ml polybrene的新鲜培养基，加2ml病毒液。
3．培养12h后继续感染（同2）。
4．感染后48h加puromycin至终浓度为3μg/ml。
5．感染后72h传代，继续使用puromycin筛选一代。
6．进行Western检验及其他试验。
傅锦林11.4。
慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mM Invitrogen2 慢病毒包装试剂PEG6000溶液50%Wako3 耗材●50 mL离心管●15 mL离心管●10 cm细胞培养皿●0.45μm过滤器● 2 mL EP管二、操作流程1细胞培养1.1293T/293FT细胞的复苏1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。
在超净台内，用吸管吸取6~7mL完全培养液至15 mL离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C 水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。
4)在室温条件下，250 g离心4分钟。
5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。
（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。
）6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。
1.2293T/293FT细胞传代1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。
将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。
在显微镜下观察，可看到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱离，此时应立即终止消化，若细胞仍然有大部分贴壁，可适当延长孵育时间；3)加入等体积完全培养液终止消化，并用吸管吹打培养瓶底2-3次使所有细胞彻底脱壁。
一、简介慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达.二、实验流程（大致的简单过程）慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体（自己构建）和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T 细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组,从而高水平的表达效应分子.大致的实验流程：1. 根据目的基因相关信息（序列,序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存）2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T 细胞[1]，进行病毒包装和生产，收集病毒液；4. 浓缩、纯化病毒液；5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞)；6。
通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果；7。
用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性.病毒液足够用于一般的动物活体实验。
三、重组质粒构建流程1.基因的获得：shRNA寡核苷酸序列的设计和合成（将正确序列克隆入载体中,退火形成双链，PCR扩增）2。
回收A．酶切产物的胶回收：一般做50-100ul 体系,然后跑电泳回收，回收量一般为30ul. B．PCR扩增产物的胶回收原理：首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。
慢病毒载体构建及包装操作手册目录慢病毒收到后的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、慢病毒包装和浓缩四、感染目的细胞附1. 汉恒生物慢病毒质粒列表附2. 慢病毒滴度测定方法简介附3. 慢病毒MOI感染参数附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较慢病毒安全使用和注意事项➢慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3)操作病毒时特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。
4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。
5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。
6)实验完毕用香皂清洗双手。
➢慢病毒收到后的注意事项1)慢病毒的储存用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。
注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。
b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。
2)慢病毒的稀释用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。
一、整体实验流程二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附表1）2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。
该细胞系为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗。
VSV-GVSV-G载体基本信息：载体名称: VSV-G质粒类型: 慢病毒包装系统载体高拷贝/低拷贝: --启动子: --克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: --5' 测序引物及序列: --3' 测序引物及序列: --载体标签: --载体抗性: --筛选标记: --备注: --稳定性: --组成型: --病毒/非病毒: --VSV-G载体质粒图谱和多克隆位点信息VSV-G载体序列VSV-G其他相关慢病毒载体：Tet-pLKO-neo Tet-pLKO-puro pPACKH1-GAGpMD2.G pCMV-dR8.2-dvpr pLKO.1-GFP-shRNA pLKO.1-TRC control pLKO.1-hygro pLKO.1-TRCpCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro FUW-tetO-hOKMSFUW-tetO-hOCT4 FUW-tetO-hSOX2 FUW-tetO-hKLF4FUW pLVX-AcGFP1-N1 pLVX-AcGFP1-C1pLVX-AmCyan1-N1 pLVX-DsRed-Express2-C1 pLVX-DsRed-Express2-N1 pLVX-DsRed-Monomer-N1 pLVX-PAmCherry-C1 pLVX-PAmCherry-N1 pLVX-ZsGreen1-N1 pLVX-IRES-ZsGreen1 pLVX-IRES-mCherry pLVX-mCherry-C1 pLVX-mCherry-N1 pLVX-tdTomato-C1 pLKO.1-puro pLentilox 3.7 pLVX-Tet-On-Advanced pLVX-IRES-Puro pLVX-IRES-Neo pLVX-IRES-HygpLVX-EF1α-DsRed-Monomer-C1 pLVX-EF1α-AcGFP1-N1 pLVX-EF1α-AcGFP1-C1 pLVX-EF1α-mCherry-C1 pLVX-EF1α-IRES-mCherry pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1 pLVX-MetLuc Control pLVX-MetLuc pLVX-Hom-Mem1pLVX-Het-2 pLVX-DD-AcGFP1-Actin pPRIME-TET-GFP-FF3pSIH1-H1-CopGFP pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro pCDF1-MCS2-EF1-copGFP pLOX-CWBmi1 pLOX-CW-CREpRSV-rev pMDLg-pRRE pLL3.7pLVX-DD-AmCyan1 Control pLVX-DD-AmCyan1 Reporter pLVX-DD-tdTomato Reporter pLVX-DD-tdTomato Control pLVX-PTuner-Green pLVX-CherryPicker2pLVX-TetOne-Puro-Luc pLVX-TetOne pLVX-TetOne-PuropLVX-TetOne-Luc pLVX-rHom-Nuc1 pLVX-rHom-Sec1pLVX-rHom-1 pLVX-Hom-Nuc1 pLVX-Het-Nuc1pLVX-PTuner pLVX-PTuner2 pLVX-DD-ZsGreen1 Reporter pLVX-Het-1 pLVX-CherryPicker Control pLVX-Tet3GpCDH-CMV-MCS-EF1-RFP-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-Hygro pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo pCDH-MCS-T2A-Puro-MSCV pCDH1-MCS2-EF1-copGFP pCDF1-MCS2-EF1-Puro pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP pWPXL pLVX-TRE3G-ZsGreen1 pLVX-TRE3G-mCherry pLenti6.3-EmGFP-BveI miR pLenti6/V5-GW/lacZpLenti6.3/V5-GW/EmGFP pLenti6.3-MCS pLenti6.3-DsRed2-BveI miR pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP pLVX-shRNA2 psPAX2VSV-G pSico PGK Puro pcDNA6.2-DsRed2-MCS1 miR pcDNA6.3-EmGFP-NC- II pcDNA6.2-EmGFP-NC- I pcDNA6.2-EmGFP-BsaI miR pLenti6.3-BveI miR pLenti6.3-MCS-IRES2-DsRed2 pLEX-MCSpGIPZ pLP2 pLP1FUGW pFUGW pLOX-Ttag-iresTKpMDLg/pRRE pLentG-KOSM pCMV-dR8.91pLVX-TRE3G-Luc Control pLVX-TRE3G-IRES pCgpvpSico pSicoR pLVTHMpGensil-1 pLVX-EF1α-IRES-Puro pCDF1-MCS2-EF1-copGFP pPACKH1-REV pLVX-Het-Mem1 pLVX-shRNA1pLKO.1-puro-GFP-siRNA pPRIME-TREX-GFP-FF3 pcDNA6.2-DsRed2-BsmBI miR pCDH-MSCV-MCS-EF1-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP pLVX-TRE3GFUW-tetO-hMYC pLOX-TERT-iresTK pLP/VSVGFUW-M2rtTA pCDH-EF1-MCS-(PGK-Puro) pcDNA6.2-EmGFP-MCS1 miR pLVX-AmCyan1-C1 pLVX-Hom-1 pcDNA6.2-BsaI miRpLVX-DsRed-Monomer-C1 pLVX-mCherry-Actin pTRIPZpLVX-ZsGreen1-C1 pLVX-CherryPicker1 LeGO-iC2pLVX-IRES-tdTomato pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro pLKO.3GpLVX-tdTomato-N1 pLVX-PTuner2-C pLVX-PuropLVX-Tight-Puro pLVX-DD-ZsGreen1 Control pSicoR PGK PuropLVX-EF1α-DsRed-Monomer-N1 pCDH-UbC-MCS-EF1-Hygro pLVTHpLVX-EF1α-mCherry-N1 pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP。
YRGene 慢病毒包装试剂盒说明书产品编号：LPK010 产品规格：10个10cm 皿 产品简介：赢润生物的慢病毒包装试剂盒包括如下成分：（1） 优化配比的慢病毒包装辅助质粒混合物，可兼容大多数慢病毒表达载体。
（2） 高效转染试剂（Invitrogen Lip2000原装产品分装，293T 细胞转染效率接近 100%）。
（3 ）高效率的慢病毒浓缩液，无需超速离心，也不需要价格昂贵的过滤柱，快速富集病毒粒子，其优 势在于操作安全简单，对设备要求低，产毒效率高，能够快速、高效地收获高滴度病毒。
产品组成：1. 转染前，传代 293FT 细胞于10cm 培养皿中（例如，接种 1 x 107细胞于10cm 培养皿中，使用完全 培养基DMEM+10%FBS培养），当细胞密度能够达到 90-95%即可进行转染。
Tips :培养基里面不要添加抗生素。
2. 转染前1-3小时，更换培养基，加入7ml 新鲜的完全培养基（DMEM+10%FBS ）,注意不要添加抗生素。
3. 准备转染。
在5ml 离心管中，分别配制 A 管与B 管试剂（Tube A and Tube B ）配好后，放置5min ，然后将A 管缓慢加入B 管，混合均匀。
室温放置20min ，使得脂质体-DNA 混合物形成。
Tips :混合后可能会出现淡淡的乳白状，不会影响转染。
然后将混合液逐滴均匀加入 10cm 培养皿，轻微混匀。
置于37C, 5% CO ?培养箱中培养过夜。
4. 第三天，更换培养基，加入 10ml 的完全培养基，同样注意不要加抗生素。
5. 转染后48-72h 后收取上清，转移至 15ml 离心管。
Tips :上清里面含有病毒，请小心操作。
6. 3000rpm 在4C 离心15min ，去除沉淀。
7. 上清液用0.45卩m 滤器过滤后转移到新的离心管中。
慢病毒浓缩：1. 每10ml 过滤后的病毒初始液，加入 Concen Solution 3ml ，每20-30min 混合一次，共进行 3-5次。
pLEX-MCS pLEX-MCS载体基本信息：载体名称:pLEXMCS, pLEX MCS, pLEX-MCS质粒类型: 哺乳动物细胞慢病毒表达载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝启动子: CMV克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 10682 bp5' 测序引物及序列: pLEX-MCS-FWD: CACCAAAATCAACGGGACTT3' 测序引物及序列: pLEX-MCS-REV: ATATAGACAAACGCACACCGGCCT 载体标签: --载体抗性: 氨苄/博来霉素(Zeocin)筛选标记: 嘌呤霉素(Puromycin)备注:稳定性: 稳定组成型: 诱导型病毒/非病毒: 慢病毒pLEX-MCS载体质粒图谱和多克隆位点信息：pLEX-MCS载体简介：pLEX-MCS载体是慢病毒载体，带有一个多克隆位点。
pLEXMCS载体骨架是设计用来瞬转或稳转表达目的慢病毒，进而感染目的细胞系，导致你的目的基因过表达的载体。
pLEX-MCS载体拥有多个载体特征(具体见上文),这些载体特征使得载体能够有效进行过表达基因研究。
1.具有使用复制的非竞争性慢病毒转染或者转导的能力。
2.在体内和体外使用时都比较容易控制。
3.在进构建稳转细胞系的时候，可以使用嘌呤霉素进行筛选。
4.可以方便将任何目的基因导入到载体的多克隆位点处。
pLEX-MCS载体序列pLEX-MCS其他相关慢病毒载体：Tet-pLKO-neo Tet-pLKO-puro pPACKH1-GAGpMD2.G pCMV-dR8.2-dvpr pLKO.1-GFP-shRNA pLKO.1-TRC control pLKO.1-hygro pLKO.1-TRCpCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro FUW-tetO-hOKMSFUW-tetO-hOCT4 FUW-tetO-hSOX2 FUW-tetO-hKLF4FUW pLVX-AcGFP1-N1 pLVX-AcGFP1-C1pLVX-AmCyan1-N1 pLVX-DsRed-Express2-C1 pLVX-DsRed-Express2-N1 pLVX-DsRed-Monomer-N1 pLVX-PAmCherry-C1 pLVX-PAmCherry-N1pLVX-ZsGreen1-N1 pLVX-IRES-ZsGreen1 pLVX-IRES-mCherrypLVX-mCherry-C1 pLVX-mCherry-N1 pLVX-tdTomato-C1 pLKO.1-puro pLentilox 3.7 pLVX-Tet-On-Advanced pLVX-IRES-Puro pLVX-IRES-Neo pLVX-IRES-HygpLVX-EF1α-DsRed-Monomer-C1 pLVX-EF1α-AcGFP1-N1 pLVX-EF1α-AcGFP1-C1 pLVX-EF1α-mCherry-C1 pLVX-EF1α-IRES-mCherry pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1 pLVX-MetLuc Control pLVX-MetLuc pLVX-Hom-Mem1pLVX-Het-2 pLVX-DD-AcGFP1-Actin pPRIME-TET-GFP-FF3pSIH1-H1-CopGFP pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro pCDF1-MCS2-EF1-copGFP pLOX-CWBmi1 pLOX-CW-CREpRSV-rev pMDLg-pRRE pLL3.7pLVX-DD-AmCyan1 Control pLVX-DD-AmCyan1 Reporter pLVX-DD-tdTomato Reporter pLVX-DD-tdTomato Control pLVX-PTuner-Green pLVX-CherryPicker2pLVX-TetOne-Puro-Luc pLVX-TetOne pLVX-TetOne-PuropLVX-TetOne-Luc pLVX-rHom-Nuc1 pLVX-rHom-Sec1pLVX-rHom-1 pLVX-Hom-Nuc1 pLVX-Het-Nuc1pLVX-PTuner pLVX-PTuner2 pLVX-DD-ZsGreen1 Reporter pLVX-Het-1 pLVX-CherryPicker Control pLVX-Tet3GpCDH-CMV-MCS-EF1-RFP-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-Hygro pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo pCDH-MCS-T2A-Puro-MSCV pCDH1-MCS2-EF1-copGFP pCDF1-MCS2-EF1-Puro pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP pWPXL pLVX-TRE3G-ZsGreen1 pLVX-TRE3G-mCherry pLenti6.3-EmGFP-BveI miR pLenti6/V5-GW/lacZpLenti6.3/V5-GW/EmGFP pLenti6.3-MCS pLenti6.3-DsRed2-BveI miR pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP pLVX-shRNA2 psPAX2VSV-G pSico PGK Puro pcDNA6.2-DsRed2-MCS1 miR pcDNA6.3-EmGFP-NC- II pcDNA6.2-EmGFP-NC- I pcDNA6.2-EmGFP-BsaI miR pLenti6.3-BveI miR pLenti6.3-MCS-IRES2-DsRed2 pLEX-MCSpGIPZ pLP2 pLP1FUGW pFUGW pLOX-Ttag-iresTKpMDLg/pRRE pLentG-KOSM pCMV-dR8.91pLVX-TRE3G-Luc Control pLVX-TRE3G-IRES pCgpvpSico pSicoR pLVTHMpGensil-1 pLVX-EF1α-IRES-Puro pCDF1-MCS2-EF1-copGFP pPACKH1-REV pLVX-Het-Mem1 pLVX-shRNA1pLKO.1-puro-GFP-siRNA pPRIME-TREX-GFP-FF3 pcDNA6.2-DsRed2-BsmBI miR pCDH-MSCV-MCS-EF1-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP pLVX-TRE3GFUW-tetO-hMYC pLOX-TERT-iresTK pLP/VSVGFUW-M2rtTA pCDH-EF1-MCS-(PGK-Puro) pcDNA6.2-EmGFP-MCS1 miR pLVX-AmCyan1-C1 pLVX-Hom-1 pcDNA6.2-BsaI miRpLVX-DsRed-Monomer-C1 pLVX-mCherry-Actin pTRIPZpLVX-ZsGreen1-C1 pLVX-CherryPicker1 LeGO-iC2pLVX-IRES-tdTomato pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro pLKO.3GpLVX-tdTomato-N1 pLVX-PTuner2-C pLVX-PuropLVX-Tight-Puro pLVX-DD-ZsGreen1 Control pSicoR PGK PuropLVX-EF1α-DsRed-Monomer-N1 pCDH-UbC-MCS-EF1-Hygro pLVTHpLVX-EF1α-mCherry-N1 pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP。
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
基本概述慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
慢病毒的应用目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。
当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。
U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。
在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。
是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃第二天2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。
慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。
二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。
3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。
计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。
计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心，1000rpm，5min。
慢病毒使用操作指南1. 引言1.1 目的本文档旨在提供关于慢病毒使用的详细操作指南，以确保实验室人员能够正确、安全地处理和利用该种类病毒。
2. 概述2.1 定义与特点- 慢病毒是一类具有复制缓激活机制并且感染后可长期存在于寄主体内的RNA或DNA 症候群相关性（SAR）等多个领域中发挥重要作用。
3. 实验前准备工作在进行任何涉及到潜在危险生物材料如此类型之前, 快速评估风险，并采取适当措施来最小化这些风险。
4 . 材料清单：下面列出了完成所需任务时可能需要的基本设备和试剂: - 生物安全柜级别II (BSL-2) 或更高级别环境下进行所有步骤；- 防护手套、防护眼镜/面罩和实验服;...5 . 实验流程：进行以下步骤以成功执行您对操纵蠕虫样品库存的需求:5.1 准备工作- 确保实验室环境符合慢病毒操作所需要的生物安全级别；- 检查所有设备和试剂是否齐全并处于良好状态。
5.2 培养基准备：...6 . 安全注意事项与风险评估7 . 应急措施及处理方法8 . 相关法律名词及注释：在本文档中，以下是一些常见使用到的法律名词以及其相应解释说明。
a) 生物安全柜 (Biosafety Cabinet, BSC):是用来提供对人员、产品和环境进行防护，并且在其中进行微生物学或细胞培养等活动时，提供无菌条件下能够有效地限制有害因素扩散传播而又不影响正常运行过程。
9. 结束语本文档涵盖了详尽的慢病毒使用操作指南，旨在确保实验室人员正确理解并遵循相关规定以最大程度上降低任何可能存在的危险性。
10. 文档涉及附件：请参考随信发送之文件列表。
YRGene 慢病毒包装试剂盒说明书产品编号：LPK010 产品规格：10个10cm 皿 产品简介：赢润生物的慢病毒包装试剂盒包括如下成分：（1） 优化配比的慢病毒包装辅助质粒混合物，可兼容大多数慢病毒表达载体。
（2） 高效转染试剂（Invitrogen Lip2000原装产品分装，293T 细胞转染效率接近 100%）。
（3 ）高效率的慢病毒浓缩液，无需超速离心，也不需要价格昂贵的过滤柱，快速富集病毒粒子，其优 势在于操作安全简单，对设备要求低，产毒效率高，能够快速、高效地收获高滴度病毒。
产品组成：1. 转染前，传代 293FT 细胞于10cm 培养皿中（例如，接种 1 x 107细胞于10cm 培养皿中，使用完全 培养基DMEM+10%FBS培养），当细胞密度能够达到 90-95%即可进行转染。
Tips :培养基里面不要添加抗生素。
2. 转染前1-3小时，更换培养基，加入7ml 新鲜的完全培养基（DMEM+10%FBS ）,注意不要添加抗生素。
3. 准备转染。
在5ml 离心管中，分别配制 A 管与B 管试剂（Tube A and Tube B ）配好后，放置5min ，然后将A 管缓慢加入B 管，混合均匀。
室温放置20min ，使得脂质体-DNA 混合物形成。
Tips :混合后可能会出现淡淡的乳白状，不会影响转染。
然后将混合液逐滴均匀加入 10cm 培养皿，轻微混匀。
置于37C, 5% CO ?培养箱中培养过夜。
4. 第三天，更换培养基，加入 10ml 的完全培养基，同样注意不要加抗生素。
5. 转染后48-72h 后收取上清，转移至 15ml 离心管。
Tips :上清里面含有病毒，请小心操作。
6. 3000rpm 在4C 离心15min ，去除沉淀。
7. 上清液用0.45卩m 滤器过滤后转移到新的离心管中。
慢病毒浓缩：1. 每10ml 过滤后的病毒初始液，加入 Concen Solution 3ml ，每20-30min 混合一次，共进行 3-5次。
pEF1α-DsRed-Monomer-N1编号 载体名称北京华越洋生物VECT6014 pEF1α-‐DsRed-‐Monomer-‐N1pEF1α-DsRed-Monomer-N1载体基本信息载体名称: pEF1α-DsRed-Monomer-N1质粒类型: 哺乳动物表达载体；双顺反子载体；荧光报告载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶启动子: EF1α载体大小: 5448 bp5' 测序引物及序列: EF1-F: TCAAGCCTCAGACAGTGGTTC3' 测序引物及序列: IRES-R载体标签: 红色荧光蛋白DsRed-Monomer（C-term）载体抗性: 卡那霉素筛选标记: 新霉素（Neomycin）克隆菌株: DH5alpha宿主细胞（系）: 大部分细胞类型，包括原代细胞、分化细胞、干细胞。
备注: pEF1α-DsRed-Monomer-N1载体是哺乳动物表达载体；目的基因与报告基因在EF1启动子驱动下转录为双顺反子；二者之间的IRES元件，使得目的基因与报告基因独立翻译；DsRed-Monomer是DsRed的单体突变体，与DsRed相比，编码序列经过了人工优化，适用于在哺乳动物细胞中的高水平表达。
稳定性: 瞬表达或稳表达组成型/诱导型: 组成型病毒/非病毒: 非病毒pEF1α-DsRed-Monomer-N1载体质粒图谱和多克隆位点信息pEF1α-DsRed-Monomer-N载体简介pEF1α-DsRed-Monomer-N1 is designed to express a protein of interest fused to the N-terminus of DsRed-Monomer, a monomeric mutant of the Discosoma sp. red fluorescent protein DsRed (1). The DsRed-Monomer coding sequence has been human-codon-optimized for high expression in mammalian cells (2). The excitation and emission maxima of native DsRed-Monomer are 557 nm and 585 nm, respectively. Expression of fusion proteins that retain the fluorescence properties of unmodified DsRed-Monomer can be monitored by flow cytometry and localized by fluorescence microscopy.The multiple cloning site (MCS) in pEF1α-DsRed-Monomer-N1 is positioned between the EF1 promoter (PEF1α) and the DsRed-Monomer coding sequence. Expression of the fusion protein is driven by the EF1α promoter, which remains constitutively active even after stable integration of the vector into the host cell genome (3). A Kozak consensus sequence, located immediately upstream of the DsRed-Monomer gene, enhances the translational efficiency of DsRed-Monomer in eukaryotic systems (4), and SV40 polyadenylation signals direct proper processing of the 3' end of the DsRed-Monomer mRNA.The vector backbone contains an SV40 origin for replication in mammalian cells expressing the SV40 large T antigen, a pUC origin of replication for propagation in E. coli, and an f1 origin for single-stranded DNA production. A neomycinresistance cassette (Neor) allows stably transfected eukaryotic cells to be selected using G418 (5). This cassette consists of the SV40 early promoter (PSV40 e), the Tn5 neomycin/kanamycin resistance gene, and polyadenylation signals from the herpes simplex virus thymidine kinase (HSV TK) gene. A bacterial promoter upstream of the cassette drives expression of the kanamycin resistance gene in E. coli.Location of FeaturesPEF1α (human elongation factor 1 alpha promoter): 12–1346MCS (multiple cloning site): 1348–1422Kozak consensus sequence: 1429–1439DsRed-Monomer (human-codon-optimized): 1436–2110SV40 polyA signal: 2267–2301f1 origin of replication: 2364–2819 (complementary)PSV40 e (SV40 early promoter and enhancer sequences): 2993–3261SV40 origin of replication: 3160–3295Kanr/Neor (kanamycin/neomycin resistance gene): 3344–4138HSV TK polyA signals: 4374–4392pUC origin of replication: 4723–5366Additional InformationThe gene of interest must be cloned into pEF1α-DsRed-Monomer-N1 so that it isin-frame with the DsRed-Monomer coding sequence. The gene must contain a start codon (ATG), and lack in-frame stop codons. Cells expressing DsRed-Monomer fusions can be detected by flow cytometry or fluorescence microscopy 12–16 hr after transfection. If required, stable transfectants can be selected using G418 (5). pEF1α-DsRed-Monomer-N1 can also be used as a cotransfection marker, as the unmodified vector will express DsRed-Monomer in mammalian cells.Propagation in E. coliSuitable host strains: DH5α, HB101 and other general purpose strains. Single-stranded DNA production requires a host containing an F plasmid, such as theJM109 or XL1-Blue strains.Selectable marker: plasmid confers resistance to kanamycin (50 μg/ml) in E. coli hosts.E. coli replication origin: pUCCopy number: highExcitation and Emission Maxima of DsRed-MonomerExcitation: 557 nmEmission: 585 nm其他哺乳动物表达载体：pCHO1.0 pBApo-CMV-Pur pOPRSVIpcDNA3.1/His C pcDNA5/FRT/V5-His-TOPO pREP4pcDNA3.1/His B pcDNA5/FRT/TO-TOPO pDual-GCpcDNA3.1/His A pcDNA5/TO pBK-RSVpIRESpuro3 pcDNA5/FRT/TO pBK-CMVpIRES2-EGFP pcDNA5/FRT pBI-CMV4pTT5 pFLAG-CMV2 pcDNA4/TO/Myc-His/LacZ pNFkB-DD-tdTomato pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO pOPI3CATpBI-CMV5 pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO pGene/V5-His B pSEAP2-Basic pOptiVEC-TOPO pSwitchpSEAP2-Control pCMV-MEKK1 pCMVLacIpBI-CMV3 pCMV-MEK1 pVgRxRpBI-CMV2 pCMV-PKA pINDpBI-CMV1 pcDNA6.2/nTC-Tag-DEST pTRE3G-LucpNFκB-MetLuc2-Reporter pcDNA6.2/cTC-Tag-DEST pTRE3GpCRE-MetLuc2-Reporter pcDNA3.2/V5/GW/D-TOPO pTRE2-hygropAcGFP1-Actin pcDNA6.2/V5/GW/D-TOPO pTRE-TightpAcGFP1-N In-Fusion Ready pcDNA6.2/nGeneBLAzer-GW/D-TOPO pTK-hygpAcGFP1-C3 pcDNA6.2/C-YFP-DEST pTet-OnpAcGFP1-C pcDNA6.2/cGeneBLAzer-DEST pTet-OffpAcGFP1-p53 pcDNA6/V5-His A pTet on advanced pAcGFP1-Mito pcDNA6/V5-His B pRevTREpAcGFP1-Mem pcDNA6/V5-His C pRevTet-On pAcGFP1-Lam pcDNA6/myc-His C pRevTet-Off pAcGFP1-Golgi pcDNA6/myc-His A pCMV-Tet3G pAcGFP1-F pcDNA6/myc-His B pTRE2pAcGFP1-Hyg-C1 pcDNA6.2/nGeneBLAzer-DEST pBD-NF-κB pAsRed2-N1 pcDNA4/HisMax-TOPO pCMV-AD ptdTomato-N1 pcDNA6.2/nLumio-DEST pCMV-BDpCMV-tdTomato pcDNA6.2/cLumio-DEST pBIND-Id Control pCRE-DD-tdTomato pcDNA4/myc-His C pBINDpCMV-DsRed-Express2 pcDNA4/HisMax C pG5 luciferasepEF1α-tdTomato pcDNA4/HisMax A pACT-MyoDpCRE-hrGFP c-Flag pcDNA3 pACTptdTomato-C1 pcDNA4/HisMax B pCMV-SPORT6 pAsRed2-C1 pcDNA4/myc-His B pGL4.13pGL3-Promoter pcDNA4/myc-His A pGL4.19pGL3 basic pcDNA4/His C pGL4.26pAcGFP1-C2 pcDNA4/His B pGL4.20pAcGFP1-C1 pcDNA4/His A pGL4.29pAcGFP1-N3 pcDNA6/TR pGL4.30pAcGFP1-N2 pcDNA4/TO/Myc-His A pGL4.27pAcGFP1-N1 pcDNA4/TO pGL4.75pAcGFP1-C In-Fusion Ready pcDNA4/TO/Myc-His B pGL4.10pCRE-DD-AmCyan1 pcDNA4/TO/Myc-His C pGRN145pNFkB-DD-AmCyan1 pcDNA3.3-TOPO pSecTag2 A pDsRed2-Bid pBudCE4.1 pEBVHis B pDsRED2-Mito pFLAG-CMV-4 pEBVHis ApDD-AmCyan1 Reporter pFLAG-CMV-3 pCMV-Tag 3C pAmCyan1-N1 pFLAG-CMV-2 pCMV-Tag 3A pAmCyan1-C1 pFLAG-CMV-5a pCMV-Tag 3BpEF1α-IRES-DsRed-Express2 p3XFLAG-CMV-9 pCMV-Tag 5CpEF1α-DsRed-Monomer-N1 p3xFLAG-CMV-10 pCMV-Tag 5A pDsRED-Monomer-N1 p3XFLAG-CMV-8 pCMV-Tag 4A pDsRed-Express-N1 p3XFLAG-CMV-7.1 pCMV-Tag 5Bp3XFLAG-CMV-7 pDsRed-Monomer-N In-Fusion Ready pCMV-Tag 4B pDsRed-Express-C1 p3XFLAG-CMV-13 pCMV-Tag 2C pIRES2-ZsGreen1 p3XFLAG-CMV-14 pCMV-Tag 2B pDsRed-Express2-C1 plRES2-ZsGreen1 pCMV-Tag 2A pDsRed-Express2-N1 pBApo-EF1α-pur pCMV-LacZpEF1α-DsRed-Express2 pBApo-EF1α-neo pCMV-MycpIRES2-DsRed-Express pBApo-CMV pEF1α-IRES-AcGFP1 pIRES2-DsRed-Express2 pBApo-CMV-neo pEF1α-IRES-ZsGreen1 pIRES-hrGFP-1a pIRES-EGFP pEF1α-AcGFP1-N1pIRESneo2 pIRESneo3 pIRES2-DsRed2 pIRESneo pDsRed-Monomer pIRES2-AcGFP1 pIREShyg3 pIRES。
慢病毒操作资料说明慢病毒操作资料说明1、Hexadimethrine bromide.pdf：这是Hexadimethrine bromide（别名Polybrene）的说明书，该试剂用于提高慢病毒的感染效率，在病毒滴度测定和病毒感染实验中均需使用；2、Lenti-X™ Concentrator.pdf：这是Lenti-X Concentrator的说明书，该试剂用于病毒粒子的浓缩纯化；3、Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf：这是过表达慢病毒（用于基因过表达）的操作说明书4、Lenti-X™ shRNA Expression Systems User Manual.pdf：这是干扰慢病毒（用于基因干扰）的操作说明书5、pLVX-shRNA1 Vector Information.pdf：pLVX-shRNA1慢病毒干扰载体说明书6、pLVX-IRES-Neo Vector Information.pdf：pLVX-IRES-Neo 慢病毒过表达载体说明书7、慢病毒（Lentivirus）载体.pdf：慢病毒载体介绍8、Lenti-X™ Lentiviral Packaging Systems FAQs.pdf：慢病包装系统常见问题介绍9、病毒纯化-PEG6000.doc：病毒纯化方法10、病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc：病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒；11、病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc：病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒；12、Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.pdf：慢病毒包装、纯化、滴度测定操作指南，供理论学习；13、C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf：磷酸钙转染方法；14、慢病毒实验方法.doc：慢病毒包装报告单；15、慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染.doc：慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染操作指南；。
慢病毒用户使用手册1.慢病毒概述慢病毒（Lentivirus）是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它可以感染分裂细胞和非分裂细胞，可有效地感染包括几乎所有的哺乳动物细胞、干细胞和原代细胞。
此外，慢病毒具有嗜核性，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而可以在体内较长期表达。
慢病毒的多种优点，使它成为基因传递的强大而有效的工具，获得了广泛的应用。
2.慢病毒安全操作规范锐赛生物提供的是第三代的慢病毒载体系统，包括1个慢病毒表达载体和3个包装辅助质粒，大大降低了发生同源重组的概率，降低了产生复制能力病毒的可能性。
同时，本系统的慢病毒颗粒是自身失活型（SIV）病毒，即病毒感染靶细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒，从而提高了安全性。
尽管如此，该病毒仍然具有潜在的生物学危险，因此建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假病毒进行生物学实验。
此外，建议将本系统生产的慢病毒视为二级生物安全水平的生物，使用时请参照如下基础规范进行实验：1.在进入实验室工作时，穿着实验服或隔离服，戴上手套和口罩。
2.操作病毒时请尽量使用生物安全柜，小心不要产生气雾或液体飞溅。
3.如果使用普通超净工作台操作病毒，请在打开含有病毒的容器盖子前关闭超净台的风机（由于超净台风向外排，有可能将病毒吹向操作者），并尽快操作；尽量缩短开盖后的病毒在关闭了排风机的超净台中停留的时间，封闭所有含有病毒的容器、耗材、废液后，再打开超净台风机。
4.如果操作时台面有病毒污染，请立即用75%酒精加1%的SDS 溶液擦拭。
接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请用75%酒精加1%的SDS 溶液或于84 消毒液浸泡过夜后弃去。
5.如需离心，应使用密封性好的离心管，或用封口膜封口后离心。
6.实验结束，脱掉手套前先消毒再摘除手套，随后用肥皂洗手。
pLVX-DsRed-Monomer-N1pLVX-DsRed-Monomer-N1载体基本信息：pLVX-DsRed-Monomer-N1载体质粒图谱和多克隆位点信息：载体名称: pLVX-DsRed-Monomer-N1质粒类型: 慢病毒表达载体；荧光报告载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝启动子: CMV克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 8751 bp5' 测序引物及序列: CMV-F: CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG (Invitrogen)3' 测序引物及序列: --载体标签: DsRed-Monomer（C-端）载体抗性: 氨苄青霉素筛选标记: 嘌呤霉素(Puromycin)克隆菌株: Stbl3宿主细胞（系）: 常规细胞系，293、CV-1、CHO等备注:pLVX-DsRed-Monomer-N1载体表达C端DsRed-Monomer融合蛋白；DsRed-Monomer是DsRed的单体突变体，与DsRed相比，编码序列经过了人工优化，适用于在哺乳动物细胞中的高水平表达；CMV启动子是过表达启动子。
稳定性: 稳表达组成型: 组成型病毒/非病毒: 慢病毒pLVX-DsRed-Monomer-N1载体简介：DescriptionpLVX-DsRed-Monomer-N1 is an HIV-1-based, lentiviral expression vector that allows you to express your gene of interest fused to DsRed-Monomer, a monomeric mutant of the Discosoma sp. red fluorescent protein. Genes cloned into the multiple cloning site (MCS),located upstream of the DsRed-Monomer coding sequence, are expressed as N-terminal fusions of the DsRed-Monomer protein. Expression of the fusion protein is driven by the constitutively active human cytomegalovirus immediate early promoter (PCMV IE) located just upstream of the MCS. Lentiviral particles derived from the vector allow the expression of DsRed-Monomer fusion proteins in virtually any cell type, including primary cells. The unmodified vector expressesDsRed-Monomer, and may be used to produce marker virus tooptimize infection protocols.pLVX-DsRed-Monomer-N1 contains all of the viral processing elements necessary for the production of replication-incompetent lentivirus, as well as elements to improve viral titer, transgene expression, and overall vector function. The woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE) promotes RNA processing events and nhances nuclear export of viral and transgene RNA (1), leading to increased viral titers from packaging cells, and enhanced expression of your gene of interest in target cells. In addition, the vector includes a Rev-response element (RRE), which further increases viral titers by enhancing the transport of unspliced viral RNA out of the nucleus (2). Finally, pLVX-DsRed-Monomer-N1 also contains a central polypurine tract (cPPT) element that increases nuclear importation of the viral genome during target cell infection, resulting in improved vector integration andmore efficient transduction (3).In addition to lentiviral elements, pLVX-DsRed-Monomer-N1 contains a puromycin resistance gene (Puror) under the control of the murine phosphoglycerate kinase (PGK) promoter (PPGK) for the selection of stable transductants. The vector also contains a pUC origin of replication and an E. coli ampicillin resistance gene (Ampr) for propagation and selection in bacteria.UsepLVX-DsRed-Monomer-N1 constitutively expresses your gene of interest from PCMV IE when transduced into target cells. Before the vector can be transduced into cells, however, it must be transfected into 293T packaging cells with our Lenti-X™ HTX Packaging System (Cat. Nos. 631247 and 631249). This packaging system allows you to safely produce high titer, infectious, replication-incompetent, VSV-G pseudotyped lentiviral particles that can infect a wide range of cell types, including non-dividing and primary cells (4).pLVX-DsRed-Monomer-N1载体序列：ORIGIN1 TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAAAGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA61 CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC AGATATCCAC121 TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA181 ATAAAGGAGA GAACACCAGC TTGTTACACC CTGTGAGCCT GCATGGGATG GATGACCCGG241 AGAGAGAAGT GTTAGAGTGG AGGTTTGACA GCCGCCTAGC ATTTCATCAC GTGGCCCGAG301 AGCTGCATCC GGAGTACTTC AAGAACTGCT GATATCGAGC TTGCTACAAG GGACTTTCCG361 CTGGGGACTT TCCAGGGAGG CGTGGCCTGG GCGGGACTGG GGAGTGGCGA GCCCTCAGAT421 CCTGCATATA AGCAGCTGCT TTTTGCCTGT ACTGGGTCTC TCTGGTTAGA CCAGATCTGA481 GCCTGGGAGC TCTCTGGCTA ACTAGGGAAC CCACTGCTTA AGCCTCAATA AAGCTTGCCT541 TGAGTGCTTC AAGTAGTGTG TGCCCGTCTG TTGTGTGACT CTGGTAACTA GAGATCCCTC601 AGACCCTTTT AGTCAGTGTG GAAAATCTCT AGCAGTGGCG CCCGAACAGG GACTTGAAAG661 CGAAAGGGAA ACCAGAGGAG CTCTCTCGAC GCAGGACTCG GCTTGCTGAA GCGCGCACGG721 CAAGAGGCGA GGGGCGGCGA CTGGTGAGTA CGCCAAAAAT TTTGACTAGC GGAGGCTAGA781 AGGAGAGAGA TGGGTGCGAG AGCGTCAGTA TTAAGCGGGG GAGAATTAGA TCGCGATGGG841 AAAAAATTCG GTTAAGGCCA GGGGGAAAGA AAAAATATAA ATTAAAACAT ATAGTATGGG901 CAAGCAGGGA GCTAGAACGA TTCGCAGTTA ATCCTGGCCT GTTAGAAACA TCAGAAGGCT961 GTAGACAAAT ACTGGGACAG CTACAACCAT CCCTTCAGAC AGGATCAGAA GAACTTAGAT1021 CATTATATAA TACAGTAGCA ACCCTCTATT GTGTGCATCA AAGGATAGAG ATAAAAGACA1081 CCAAGGAAGC TTTAGACAAG ATAGAGGAAG AGCAAAACAA AAGTAAGACC ACCGCACAGC1141 AAGCGGCCGG CCGCTGATCT TCAGACCTGG AGGAGGAGAT ATGAGGGACA ATTGGAGAAG1201 TGAATTATAT AAATATAAAG TAGTAAAAAT TGAACCATTA GGAGTAGCAC CCACCAAGGC1261 AAAGAGAAGA GTGGTGCAGA GAGAAAAAAG AGCAGTGGGA ATAGGAGCTT TGTTCCTTGG1321 GTTCTTGGGA GCAGCAGGAA GCACTATGGG CGCAGCGTCA ATGACGCTGA CGGTACAGGC1381 CAGACAATTA TTGTCTGGTA TAGTGCAGCA GCAGAACAAT TTGCTGAGGG CTATTGAGGC1441 GCAACAGCAT CTGTTGCAAC TCACAGTCTG GGGCATCAAG CAGCTCCAGG CAAGAATCCT1501 GGCTGTGGAA AGATACCTAA AGGATCAACA GCTCCTGGGG ATTTGGGGTT GCTCTGGAAA1561 ACTCATTTGC ACCACTGCTG TGCCTTGGAA TGCTAGTTGG AGTAATAAAT CTCTGGAACA1621 GATTTGGAAT CACACGACCT GGATGGAGTG GGACAGAGAA ATTAACAATT ACACAAGCTT 1681 AATACACTCC TTAATTGAAG AATCGCAAAA CCAGCAAGAA AAGAATGAAC AAGAATTATT 1741 GGAATTAGAT AAATGGGCAA GTTTGTGGAA TTGGTTTAAC ATAACAAATT GGCTGTGGTA 1801 TATAAAATTA TTCATAATGA TAGTAGGAGG CTTGGTAGGT TTAAGAATAG TTTTTGCTGT 1861 ACTTTCTATA GTGAATAGAG TTAGGCAGGG ATATTCACCA TTATCGTTTC AGACCCACCT 1921 CCCAACCCCG AGGGGACCCG ACAGGCCCGA AGGAATAGAA GAAGAAGGTG GAGAGAGAGA 1981 CAGAGACAGA TCCATTCGAT TAGTGAACGG ATCTCGACGG TATCGCCTTT AAAAGAAAAG 2041 GGGGGATTGG GGGGTACAGT GCAGGGGAAA GAATAGTAGA CATAATAGCA ACAGACATAC 2101 AAACTAAAGA ATTACAAAAA CAAATTACAA AAATTCAAAA TTTTCGGGTT TATTACAGGG 2161 ACAGCAGAGA TCCAGTTTAT CGATAAGCTT GGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA 2221 ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG 2281 TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA ATGGGTGGAG TATTTACGGT 2341 AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG 2401 TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC 2461 CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC 2521 AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA 2581 TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA 2641 ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG GTAGGCGTGT ACGGTGGGAG GTCTATATAA 2701 GCAGAGCTCG TTTAGTGAAC CGTCAGATCG CCTGGAGACG CCATCCACGC TGTTTTGACC 2761 TCCATAGAAG ACACCGACTC TACTAGAGGA TCGCTAGCGC TACCGGACTC AGATCTCGAG 2821 CTCAAGCTTC GAATTCTGCA GTCGACGGTA CCGCGGGCCC GGGATCCACC GGTCGCCACC 2881 ATGGACAACA CCGAGGACGT CATCAAGGAG TTCATGCAGT TCAAGGTGCG CATGGAGGGC 2941 TCCGTGAACG GCCACTACTT CGAGATCGAG GGCGAGGGCG AGGGCAAGCC CTACGAGGGC 3001 ACCCAGACCG CCAAGCTGCA GGTGACCAAG GGCGGCCCCC TGCCCTTCGC CTGGGACATC 3061 CTGTCCCCCC AGTTCCAGTA CGGCTCCAAG GCCTACGTGA AGCACCCCGC CGACATCCCC 3121 GACTACATGA AGCTGTCCTT CCCCGAGGGC TTCACCTGGG AGCGCTCCAT GAACTTCGAG 3181 GACGGCGGCG TGGTGGAGGT GCAGCAGGAC TCCTCCCTGC AGGACGGCAC CTTCATCTAC 3241 AAGGTGAAGT TCAAGGGCGT GAACTTCCCC GCCGACGGCC CCGTAATGCA GAAGAAGACT 3301 GCCGGCTGGG AGCCCTCCAC CGAGAAGCTG TACCCCCAGG ACGGCGTGCT GAAGGGCGAG 3361 ATCTCCCACG CCCTGAAGCT GAAGGACGGC GGCCACTACA CCTGCGACTT CAAGACCGTG 3421 TACAAGGCCA AGAAGCCCGT GCAGCTGCCC GGCAACCACT ACGTGGACTC CAAGCTGGAC 3481 ATCACCAACC ACAACGAGGA CTACACCGTG GTGGAGCAGT ACGAGCACGC CGAGGCCCGC 3541 CACTCCGGCT CCCAGTAGAG CGGCCGCGAC TCTAGATAAT TCTACCGGGT AGGGGAGGCG 3601 CTTTTCCCAA GGCAGTCTGG AGCATGCGCT TTAGCAGCCC CGCTGGGCAC TTGGCGCTAC 3661 ACAAGTGGCC TCTGGCCTCG CACACATTCC ACATCCACCG GTAGGCGCCA ACCGGCTCCG 3721 TTCTTTGGTG GCCCCTTCGC GCCACCTTCT ACTCCTCCCC TAGTCAGGAA GTTCCCCCCC 3781 GCCCCGCAGC TCGCGTCGTG CAGGACGTGA CAAATGGAAG TAGCACGTCT CACTAGTCTC 3841 GTGCAGATGG ACAGCACCGC TGAGCAATGG AAGCGGGTAG GCCTTTGGGG CAGCGGCCAA 3901 TAGCAGCTTT GCTCCTTCGC TTTCTGGGCT CAGAGGCTGG GAAGGGGTGG GTCCGGGGGC 3961 GGGCTCAGGG GCGGGCTCAG GGGCGGGGCG GGCGCCCGAA GGTCCTCCGG AGGCCCGGCA 4021 TTCTGCACGC TTCAAAAGCG CACGTCTGCC GCGCTGTTCT CCTCTTCCTC ATCTCCGGGC 4081 CTTTCGACCT GCAGCCCAAG CTTACCATGA CCGAGTACAA GCCCACGGTG CGCCTCGCCA 4141 CCCGCGACGA CGTCCCCAGG GCCGTACGCA CCCTCGCCGC CGCGTTCGCC GACTACCCCG 4201 CCACGCGCCA CACCGTCGAT CCGGACCGCC ACATCGAGCG GGTCACCGAG CTGCAAGAAC4261 TCTTCCTCAC GCGCGTCGGG CTCGACATCG GCAAGGTGTG GGTCGCGGAC GACGGCGCCG 4321 CGGTGGCGGT CTGGACCACG CCGGAGAGCG TCGAAGCGGG GGCGGTGTTC GCCGAGATCG 4381 GCCCGCGCAT GGCCGAGTTG AGCGGTTCCC GGCTGGCCGC GCAGCAACAG ATGGAAGGCC 4441 TCCTGGCGCC GCACCGGCCC AAGGAGCCCG CGTGGTTCCT GGCCACCGTC GGCGTCTCGC 4501 CCGACCACCA GGGCAAGGGT CTGGGCAGCG CCGTCGTGCT CCCCGGAGTG GAGGCGGCCG 4561 AGCGCGCCGG GGTGCCCGCC TTCCTGGAGA CCTCCGCGCC CCGCAACCTC CCCTTCTACG 4621 AGCGGCTCGG CTTCACCGTC ACCGCCGACG TCGAGGTGCC CGAAGGACCG CGCACCTGGT 4681 GCATGACCCG CAAGCCCGGT GCCTGACCGC GTCTGGAACA ATCAACCTCT GGATTACAAA 4741 ATTTGTGAAA GATTGACTGG TATTCTTAAC TATGTTGCTC CTTTTACGCT ATGTGGATAC 4801 GCTGCTTTAA TGCCTTTGTA TCATGCTATT GCTTCCCGTA TGGCTTTCAT TTTCTCCTCC 4861 TTGTATAAAT CCTGGTTGCT GTCTCTTTAT GAGGAGTTGT GGCCCGTTGT CAGGCAACGT 4921 GGCGTGGTGT GCACTGTGTT TGCTGACGCA ACCCCCACTG GTTGGGGCAT TGCCACCACC 4981 TGTCAGCTCC TTTCCGGGAC TTTCGCTTTC CCCCTCCCTA TTGCCACGGC GGAACTCATC 5041 GCCGCCTGCC TTGCCCGCTG CTGGACAGGG GCTCGGCTGT TGGGCACTGA CAATTCCGTG 5101 GTGTTGTCGG GGAAGCTGAC GTCCTTTCCA TGGCTGCTCG CCTGTGTTGC CACCTGGATT 5161 CTGCGCGGGA CGTCCTTCTG CTACGTCCCT TCGGCCCTCA ATCCAGCGGA CCTTCCTTCC 5221 CGCGGCCTGC TGCCGGCTCT GCGGCCTCTT CCGCGTCTTC GCCTTCGCCC TCAGACGAGT 5281 CGGATCTCCC TTTGGGCCGC CTCCCCGCCT GGAATTAATT CTGCAGTCGA GACCTAGAAA 5341 AACATGGAGC AATCACAAGT AGCAATACAG CAGCTACCAA TGCTGATTGT GCCTGGCTAG 5401 AAGCACAAGA GGAGGAGGAG GTGGGTTTTC CAGTCACACC TCAGGTACCT TTAAGACCAA 5461 TGACTTACAA GGCAGCTGTA GATCTTAGCC ACTTTTTAAA AGAAAAGAGG GGACTGGAAG 5521 GGCTAATTCA CTCCCAACGA AGACAAGATA TCCTTGATCT GTGGATCTAC CACACACAAG 5581 GCTACTTCCC TGATTAGCAG AACTACACAC CAGGGCCAGG GGTCAGATAT CCACTGACCT 5641 TTGGATGGTG CTACAAGCTA GTACCAGTTG AGCCAGATAA GGTAGAAGAG GCCAATAAAG 5701 GAGAGAACAC CAGCTTGTTA CACCCTGTGA GCCTGCATGG GATGGATGAC CCGGAGAGAG 5761 AAGTGTTAGA GTGGAGGTTT GACAGCCGCC TAGCATTTCA TCACGTGGCC CGAGAGCTGC 5821 ATCCGGAGTA CTTCAAGAAC TGCTGATATC GAGCTTGCTA CAAGGGACTT TCCGCTGGGG 5881 ACTTTCCAGG GAGGCGTGGC CTGGGCGGGA CTGGGGAGTG GCGAGCCCTC AGATCCTGCA 5941 TATAAGCAGC TGCTTTTTGC CTGTACTGGG TCTCTCTGGT TAGACCAGAT CTGAGCCTGG 6001 GAGCTCTCTG GCTAACTAGG GAACCCACTG CTTAAGCCTC AATAAAGCTT GCCTTGAGTG 6061 CTTCAAGTAG TGTGTGCCCG TCTGTTGTGT GACTCTGGTA ACTAGAGATC CCTCAGACCC 6121 TTTTAGTCAG TGTGGAAAAT CTCTAGCAGT AGTAGTTCAT GTCATCTTAT TATTCAGTAT 6181 TTATAACTTG CAAAGAAATG AATATCAGAG AGTGAGAGGC CTTGACATTG CTAGCGTTTA 6241 CCGTCGACCT CTAGCTAGAG CTTGGCGTAA TCATGGTCAT AGCTGTTTCC TGTGTGAAAT 6301 TGTTATCCGC TCACAATTCC ACACAACATA CGAGCCGGAA GCATAAAGTG TAAAGCCTGG 6361 GGTGCCTAAT GAGTGAGCTA ACTCACATTA ATTGCGTTGC GCTCACTGCC CGCTTTCCAG 6421 TCGGGAAACC TGTCGTGCCA GCTGCATTAA TGAATCGGCC AACGCGCGGG GAGAGGCGGT 6481 TTGCGTATTG GGCGCTCTTC CGCTTCCTCG CTCACTGACT CGCTGCGCTC GGTCGTTCGG 6541 CTGCGGCGAG CGGTATCAGC TCACTCAAAG GCGGTAATAC GGTTATCCAC AGAATCAGGG 6601 GATAACGCAG GAAAGAACAT GTGAGCAAAA GGCCAGCAAA AGGCCAGGAA CCGTAAAAAG 6661 GCCGCGTTGC TGGCGTTTTT CCATAGGCTC CGCCCCCCTG ACGAGCATCA CAAAAATCGA 6721 CGCTCAAGTC AGAGGTGGCG AAACCCGACA GGACTATAAA GATACCAGGC GTTTCCCCCT 6781 GGAAGCTCCC TCGTGCGCTC TCCTGTTCCG ACCCTGCCGC TTACCGGATA CCTGTCCGCC 6841 TTTCTCCCTT CGGGAAGCGT GGCGCTTTCT CATAGCTCAC GCTGTAGGTA TCTCAGTTCG6901 GTGTAGGTCG TTCGCTCCAA GCTGGGCTGT GTGCACGAAC CCCCCGTTCA GCCCGACCGC6961 TGCGCCTTAT CCGGTAACTA TCGTCTTGAG TCCAACCCGG TAAGACACGA CTTATCGCCA7021 CTGGCAGCAG CCACTGGTAA CAGGATTAGC AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG7081 TTCTTGAAGT GGTGGCCTAA CTACGGCTAC ACTAGAAGAA CAGTATTTGG TATCTGCGCT7141 CTGCTGAAGC CAGTTACCTT CGGAAAAAGA GTTGGTAGCT CTTGATCCGG CAAACAAACC7201 ACCGCTGGTA GCGGTGGTTT TTTTGTTTGC AAGCAGCAGA TTACGCGCAG AAAAAAAGGA7261 TCTCAAGAAG ATCCTTTGAT CTTTTCTACG GGGTCTGACG CTCAGTGGAA CGAAAACTCA7321 CGTTAAGGGA TTTTGGTCAT GAGATTATCA AAAAGGATCT TCACCTAGAT CCTTTTAAAT7381 TAAAAATGAA GTTTTAAATC AATCTAAAGT ATATATGAGT AAACTTGGTC TGACAGTTAC7441 CAATGCTTAA TCAGTGAGGC ACCTATCTCA GCGATCTGTC TATTTCGTTC ATCCATAGTT7501 GCCTGACTCC CCGTCGTGTA GATAACTACG ATACGGGAGG GCTTACCATC TGGCCCCAGT7561 GCTGCAATGA TACCGCGAGA CCCACGCTCA CCGGCTCCAG ATTTATCAGC AATAAACCAG7621 CCAGCCGGAA GGGCCGAGCG CAGAAGTGGT CCTGCAACTT TATCCGCCTC CATCCAGTCT7681 ATTAATTGTT GCCGGGAAGC TAGAGTAAGT AGTTCGCCAG TTAATAGTTT GCGCAACGTT7741 GTTGCCATTG CTACAGGCAT CGTGGTGTCA CGCTCGTCGT TTGGTATGGC TTCATTCAGC7801 TCCGGTTCCC AACGATCAAG GCGAGTTACA TGATCCCCCA TGTTGTGCAA AAAAGCGGTT7861 AGCTCCTTCG GTCCTCCGAT CGTTGTCAGA AGTAAGTTGG CCGCAGTGTT ATCACTCATG7921 GTTATGGCAG CACTGCATAA TTCTCTTACT GTCATGCCAT CCGTAAGATG CTTTTCTGTG7981 ACTGGTGAGT ACTCAACCAA GTCATTCTGA GAATAGTGTA TGCGGCGACC GAGTTGCTCT8041 TGCCCGGCGT CAATACGGGA TAATACCGCG CCACATAGCA GAACTTTAAA AGTGCTCATC8101 ATTGGAAAAC GTTCTTCGGG GCGAAAACTC TCAAGGATCT TACCGCTGTT GAGATCCAGT8161 TCGATGTAAC CCACTCGTGC ACCCAACTGA TCTTCAGCAT CTTTTACTTT CACCAGCGTT8221 TCTGGGTGAG CAAAAACAGG AAGGCAAAAT GCCGCAAAAA AGGGAATAAG GGCGACACGG8281 AAATGTTGAA TACTCATACT CTTCCTTTTT CAATATTATT GAAGCATTTA TCAGGGTTAT8341 TGTCTCATGA GCGGATACAT ATTTGAATGT ATTTAGAAAA ATAAACAAAT AGGGGTTCCG8401 CGCACATTTC CCCGAAAAGT GCCACCTGAC GTCGACGGAT CGGGAGATCA ACTTGTTTAT8461 TGCAGCTTAT AATGGTTACA AATAAAGCAA TAGCATCACA AATTTCACAA ATAAAGCATT8521 TTTTTCACTG CATTCTAGTT GTGGTTTGTC CAAACTCATC AATGTATCTT ATCATGTCTG8581 GATCAACTGG ATAACTCAAG CTAACCAAAA TCATCCCAAA CTTCCCACCC CATACCCTAT8641 TACCACTGCC AATTACCTGT GGTTTCATTT ACTCTAAACC TGTGATTCCT CTGAATTATT8701 TTCATTTTAA AGAAATTGTA TTTGTTAAAT ATGTACTACA AACTTAGTAG T//pLVX-DsRed-Monomer-N1其他相关慢病毒载体：Tet-pLKO-neo Tet-pLKO-puro pPACKH1-GAGpMD2.G pCMV-dR8.2-dvpr pLKO.1-GFP-shRNA pLKO.1-TRC control pLKO.1-hygro pLKO.1-TRCpCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro FUW-tetO-hOKMS FUW-tetO-hOCT4 FUW-tetO-hSOX2 FUW-tetO-hKLF4FUW pLVX-AcGFP1-N1 pLVX-AcGFP1-C1pLVX-AmCyan1-N1 pLVX-DsRed-Express2-C1 pLVX-DsRed-Express2-N1 pLVX-DsRed-Monomer-N1 pLVX-PAmCherry-C1 pLVX-PAmCherry-N1 pLVX-ZsGreen1-N1 pLVX-IRES-ZsGreen1 pLVX-IRES-mCherry pLVX-mCherry-C1 pLVX-mCherry-N1 pLVX-tdTomato-C1 pLKO.1-puro pLentilox 3.7 pLVX-Tet-On-AdvancedpLVX-IRES-Puro pLVX-IRES-Neo pLVX-IRES-HygpLVX-EF1α-DsRed-Monomer-C1 pLVX-EF1α-AcGFP1-N1 pLVX-EF1α-AcGFP1-C1 pLVX-EF1α-mCherry-C1 pLVX-EF1α-IRES-mCherry pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1 pLVX-MetLuc Control pLVX-MetLuc pLVX-Hom-Mem1pLVX-Het-2 pLVX-DD-AcGFP1-Actin pPRIME-TET-GFP-FF3pSIH1-H1-CopGFP pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro pCDF1-MCS2-EF1-copGFP pLOX-CWBmi1 pLOX-CW-CREpRSV-rev pMDLg-pRRE pLL3.7pLVX-DD-AmCyan1 Control pLVX-DD-AmCyan1 Reporter pLVX-DD-tdTomato Reporter pLVX-DD-tdTomato Control pLVX-PTuner-Green pLVX-CherryPicker2pLVX-TetOne-Puro-Luc pLVX-TetOne pLVX-TetOne-PuropLVX-TetOne-Luc pLVX-rHom-Nuc1 pLVX-rHom-Sec1pLVX-rHom-1 pLVX-Hom-Nuc1 pLVX-Het-Nuc1pLVX-PTuner pLVX-PTuner2 pLVX-DD-ZsGreen1 Reporter pLVX-Het-1 pLVX-CherryPicker Control pLVX-Tet3GpCDH-CMV-MCS-EF1-RFP-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-Hygro pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo pCDH-MCS-T2A-Puro-MSCV pCDH1-MCS2-EF1-copGFP pCDF1-MCS2-EF1-Puro pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP pWPXL pLVX-TRE3G-ZsGreen1 pLVX-TRE3G-mCherry pLenti6.3-EmGFP-BveI miR pLenti6/V5-GW/lacZpLenti6.3/V5-GW/EmGFP pLenti6.3-MCS pLenti6.3-DsRed2-BveI miR pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP pLVX-shRNA2 psPAX2VSV-G pSico PGK Puro pcDNA6.2-DsRed2-MCS1 miR pcDNA6.3-EmGFP-NC- II pcDNA6.2-EmGFP-NC- I pcDNA6.2-EmGFP-BsaI miR pLenti6.3-BveI miR pLenti6.3-MCS-IRES2-DsRed2 pLEX-MCSpGIPZ pLP2 pLP1FUGW pFUGW pLOX-Ttag-iresTKpMDLg/pRRE pLentG-KOSM pCMV-dR8.91pLVX-TRE3G-Luc Control pLVX-TRE3G-IRES pCgpvpSico pSicoR pLVTHMpGensil-1 pLVX-EF1α-IRES-Puro pCDF1-MCS2-EF1-copGFP pPACKH1-REV pLVX-Het-Mem1 pLVX-shRNA1pLKO.1-puro-GFP-siRNA pPRIME-TREX-GFP-FF3 pcDNA6.2-DsRed2-BsmBI miR pCDH-MSCV-MCS-EF1-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP pLVX-TRE3GFUW-tetO-hMYC pLOX-TERT-iresTK pLP/VSVGFUW-M2rtTA pCDH-EF1-MCS-(PGK-Puro) pcDNA6.2-EmGFP-MCS1 miR pLVX-AmCyan1-C1 pLVX-Hom-1 pcDNA6.2-BsaI miRpLVX-DsRed-Monomer-C1 pLVX-mCherry-Actin pTRIPZpLVX-ZsGreen1-C1 pLVX-CherryPicker1 LeGO-iC2pLVX-IRES-tdTomato pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro pLKO.3GpLVX-tdTomato-N1 pLVX-PTuner2-C pLVX-PuropLVX-Tight-Puro pLVX-DD-ZsGreen1 Control pSicoR PGK PuropLVX-EF1α-DsRed-Monomer-N1 pCDH-UbC-MCS-EF1-Hygro pLVTHpLVX-EF1α-mCherry-N1 pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP。
