质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用

质粒测序的原理及步骤⒈质粒抽提基本原理在其中采用几种水溶液及其硅酸化学纤维膜（超滤膜柱）。

水溶液Ⅰ：50 mM果糖 / 25 mMTris-HCl/ 10 mMEDTA，pH 8.0；水溶液Ⅱ：0.2 N NaOH / 1%SDS；水溶液Ⅲ：3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸/75%乙醇。

水溶液Ⅰ果糖是使飘浮后的大肠埃希菌不容易迅速堆积到水管的底端；EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属材料正离子的螯合剂，其关键目地是以便鳌合二价金属材料正离子进而达到抑制DNase的特异性；可加上RNase A消化吸收RNA。

水溶液Ⅱ此步为碱解决。

在其中NaOH关键是以便融解体细胞，释放出来DNA，由于在强偏碱的状况下，细胞质产生了从两层膜结构工程向微囊构造的转变。

SDS与NaOH联用，其目地是以便提高NaOH 的强偏碱，一起SDS做为阳离子表活剂毁坏脂两层膜。

那步要记牢二点：首位，时间不可以太长，由于在那样的偏碱标准下基因组DNA片段也会渐渐地破裂；其次，务必温柔混和，要不然基因组DNA会破裂。

水溶液Ⅲ水溶液III的功效是沉定蛋白质和中和反应。

在其中醋酸钾是以便使钾离子换置SDS中的钾离子而产生了PDS，由于十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）碰到钾离子后变为了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS不是溶水的，一起1个SDS分子结构均值融合2个碳水化合物，钾钠正离子换置所造成的很多沉定大自然就将绝大多数蛋白沉定了。

2 M的醋酸是以便中合NaOH。

基因组DNA如果产生破裂，要是是50－100 kb尺寸的片段，就没有方法再被 PDS共沉淀了，因此碱解决的时间要短，并且不可猛烈震荡，要不然蕞终获得的质粒上都会有很多的基因组DNA渗入，琼脂糖电泳能够观查到这条浓浓总DNA条带。

75%乙醇关键是以便清理盐分和抑止Dnase；一起水溶液III的强酸碱性都是以便使DNA尽快融合在硅酸化学纤维膜上⒉质粒抽提流程⑴应用质粒提取试剂盒获取质粒时请参照实际试剂盒的操作指南。

质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。

各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。

目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。

例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。

对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。

1M Tris-HCl (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。

在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。

任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。

50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。

质粒提取试剂盒原理
质粒提取试剂盒是一种用于提取质粒DNA的试剂盒，其原理是利用离心、溶解、吸附、洗脱等步骤将目标DNA从细胞裂解液中分离出来。

下面将详细介绍质
粒提取试剂盒的原理及各个步骤的作用。

首先，细菌裂解液中的细胞膜和细胞壁会被破坏，使得细胞内的质粒DNA暴
露出来。

接着，加入试剂盒中的一种缓冲液，能够使DNA和其他细胞成分分离开来，使得DNA能够在后续步骤中被提取出来。

然后，通过离心将细胞碎片和其他
杂质沉淀到管底，上清液中的DNA得以分离。

接下来，将上清液加入试剂盒提供
的柱子中，DNA会在柱子上被特定的材料吸附住，而其他杂质则会被洗脱掉。

最后，用洗脱缓冲液将DNA从柱子上洗脱下来，得到纯净的质粒DNA。

质粒提取试剂盒的原理是基于DNA的物理性质和化学性质，通过不同步骤的
组合实现对质粒DNA的高效提取。

在整个提取过程中，试剂盒提供的各种缓冲液
和柱子起着至关重要的作用，能够使DNA得以分离和纯化。

这种原理简单而高效，适用于从各种细菌中提取质粒DNA，为后续的分子生物学实验提供了可靠的DNA
样本。

总的来说，质粒提取试剂盒的原理是通过细胞裂解、DNA分离、DNA吸附、
洗脱等步骤，将目标DNA从细胞裂解液中提取出来。

这种原理简单易行，操作方便，适用于实验室中的质粒DNA提取工作。

希望通过本文的介绍，能够让大家对
质粒提取试剂盒的原理有一个更加清晰的认识，为实验工作的顺利开展提供帮助。

碱裂解法提取质粒一、基本概念1．质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸（DNA）分子。

现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。

在基因工程中质粒常被用做基因的载体。

许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒（plasmid)。

质粒上常有抗生素的抗性基因,例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。

有些质粒称为附加体(episome）,这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子.目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子（简称cccDNA）。

细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0。

5％～3%。

根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。

每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。

按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时,质粒也复制一次，每个细胞内只有1~2个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。

一般分子量较大的质粒属严紧型。

分子量较小的质粒属松弛型。

质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。

在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。

人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。

常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101.pBR322含有抗四环素基因（Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr),并含有5种内切酶的单一切点。

如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。

质粒提取原理和方法质粒提取是从细菌基因组中提取出质粒DNA的一种方法。

它是分子生物学和遗传工程中常用的技术，可用于质粒的纯化和制备。

质粒提取的原理主要基于以下几个步骤：1.细菌培养：首先，我们需要将含有目标质粒的细菌培养在适当的培养基上，通过高速离心将细菌收集起来。

2.细菌溶解：将培养物进行离心，分离菌落。

然后采用一定的细胞破碎方法，如超声波震荡、冻融等，将细菌细胞壁破坏，使质粒DNA释放到溶液中。

3.质粒分离：通过离心将细菌碎片、蛋白质等杂质与质粒DNA分离。

一般是通过两次离心来完成，第一次较低速离心用于去除细菌碎片和细胞蛋白质，第二次较高速离心用于沉淀质粒DNA。

4.DNA纯化：将质粒DNA从上一步得到的沉淀物中提取出来。

可以使用酚/氯仿法、硅胶柱法、商用试剂盒等方法进行纯化。

其中酚/氯仿法是较为常用的方法，它可以将DNA溶于水相，而蛋白质和其他的污染物则溶于有机相。

5.DNA沉淀：将纯化得到的DNA溶液加入适量的酒精沉淀剂（如乙醇或异丙醇），再次进行高速离心，使DNA沉淀到离心管底部。

6.DNA洗涤：将离心管底部形成的DNA沉淀用70%乙醇洗涤，去除酒精沉淀剂和其他杂质。

然后用空气吹干，最后用一定体积的纯水或缓冲液溶解。

质粒提取的方法根据实验需求不同和实验室条件的不同可以有所差异，常用的方法有以下几种：1.酚/氯仿法：这是一种经典的DNA提取方法，它将质粒DNA溶于三氯甲烷和酚的混合物中，蛋白质和其他污染物则溶于酚相。

离心去除酚相，再用异丙醇沉淀DNA，最后用70%乙醇洗涤。

2.硅胶柱法：这是一种基于硅胶柱的离心柱技术，可用于高通量的质粒提取。

DNA样品在硅胶柱中被结合，杂质被洗掉，最后用纯水或缓冲液洗提质粒DNA。

3.磁珠法：这是一种基于磁性珠子的质粒提取方法，通过在磁性珠子表面修饰DNA结合物，使质粒DNA与磁性珠子结合。

通过外加磁场将磁性珠子与DNA一起沉淀，然后去除上清液，最后用纯水洗提DNA。

质粒提取溶液123的作用引言：质粒提取溶液123是一种用于提取质粒的溶液，它在分子生物学研究中扮演着重要的角色。

本文将详细介绍质粒提取溶液123的作用，包括提取质粒的原理、使用方法以及在实验中的应用。

一、质粒提取溶液123的原理质粒提取溶液123是由一系列化学试剂组成的混合物，通过特定的化学反应来提取质粒。

其主要原理是在溶液中加入一种离子试剂，使得质粒DNA与其他细胞组分发生相互作用，从而实现质粒的提取。

二、质粒提取溶液123的使用方法1. 准备工作：将质粒提取溶液123从冰箱取出，放置于室温下回温。

同时准备待提取的样品，如细菌培养物等。

2. 加入质粒提取溶液：将样品与质粒提取溶液123按照一定比例混合，通常为1:3的体积比例。

3. 混匀：轻轻颠倒试管或离心管，使质粒提取溶液和样品充分混合。

4. 孵育：将混合液在37摄氏度的恒温培养箱中孵育一段时间，通常为30分钟至1小时。

5. 离心：将孵育后的混合液进行离心，以分离质粒DNA和其他细胞组分。

6. 取上清：使用吸管或移液器，小心地取出上清液，即质粒提取溶液中的质粒DNA。

三、质粒提取溶液123在实验中的应用1. DNA克隆：质粒提取溶液123可用于提取质粒DNA，进而进行DNA克隆实验。

通过将目标DNA片段插入质粒中，可以实现基因重组以及重组DNA的扩增。

2. 转化实验：质粒提取溶液123也可用于细菌的转化实验。

将提取的质粒DNA与目标细菌一起处理，使质粒DNA进入细菌细胞内，从而实现基因的转移和表达。

3. 基因测序：质粒提取溶液123还可以用于提取质粒DNA，以进行基因测序。

通过对质粒DNA的测序分析，可以获得目标基因的序列信息，进而了解基因结构和功能。

4. 基因表达：质粒提取溶液123中的质粒DNA可以用于基因的表达实验。

将目标基因插入质粒中，并转化至合适的宿主细胞中，通过合适的诱导条件，可以使目标基因在细胞内得到表达，从而研究其功能和调控机制。

质粒提取原理质粒提取是分子生物学实验中常见的操作，其原理主要是利用离心、溶解、沉淀等方法将目标质粒从细菌中提取出来，为后续的实验操作提供必要的材料基础。

下面将详细介绍质粒提取的原理及相关操作步骤。

一、离心法。

离心法是质粒提取的基础步骤之一，其原理是通过高速离心使得细菌细胞和质粒分离。

首先，将含有目标质粒的培养基液体培养物进行离心，使得细菌细胞被沉淀到离心管底部，上清液中则含有目标质粒。

接着，将上清液转移至新的离心管中，再次进行离心操作，将残余的细菌细胞去除，得到含有目标质粒的上清液。

二、溶解法。

溶解法是质粒提取的另一关键步骤，其原理是通过特定的溶解液将目标质粒从细菌细胞中释放出来。

一般情况下，利用含有EDTA和蛋白酶K的溶解液对细菌细胞进行裂解，使得细菌细胞壁和膜被破坏，质粒得以释放。

此时，目标质粒已经被释放到溶解液中，为后续的纯化操作做好准备。

三、沉淀法。

沉淀法是质粒提取的最后一步，其原理是通过加入盐类或醇类使得目标质粒沉淀到溶液底部，从而实现质粒的分离和纯化。

一般情况下，将加入盐类或醇类的溶液与目标质粒混合后，通过离心将质粒沉淀到离心管底部，上清液中则含有杂质和其他不需要的物质。

最后，将上清液倒掉，得到沉淀的质粒，即可用于后续的实验操作。

综上所述，质粒提取的原理主要包括离心、溶解和沉淀三个步骤。

通过这些操作，可以有效地将目标质粒从细菌中提取出来，并得到相对纯净的质粒样品，为分子生物学实验提供了重要的基础材料。

在实际操作中，需要严格按照操作步骤进行操作，并注意操作中的细节，以确保提取到高质量的质粒样品。

希望本文介绍的质粒提取原理能够对相关实验工作有所帮助。

质粒提取溶液123的作用质粒提取溶液123是一种常用的实验试剂，用于从细菌中提取质粒。

质粒是细菌中的一种环状DNA分子，质粒提取溶液123的作用是通过一系列化学和物理方法，将质粒从细菌细胞中分离出来，以便进一步进行质粒的研究和应用。

质粒提取溶液123的主要成分是盐酸、EDTA和蛋白酶K等。

盐酸起到调节溶液酸碱度的作用，使其适合质粒提取的过程。

EDTA是一种螯合剂，能够与金属离子结合，防止金属离子的存在对质粒提取的影响。

蛋白酶K是一种蛋白酶，能够降解细菌细胞中的蛋白质，使质粒能够被有效地提取出来。

在使用质粒提取溶液123进行质粒提取的过程中，首先需要将细菌细胞收集起来，并在适当的条件下进行裂解。

细菌细胞裂解后，质粒与其他细胞组分分离，形成混合物。

接下来，将质粒提取溶液123加入混合物中，通过离心等操作，将质粒从其他细胞组分中分离出来。

最后，经过一系列的洗涤和纯化步骤，得到纯净的质粒溶液。

质粒提取溶液123在科研领域有着广泛的应用。

首先，质粒提取溶液123可以用于基因工程研究中。

通过提取细菌中的质粒，可以获得含有特定基因的质粒，进而进行基因克隆、基因表达等研究。

其次，质粒提取溶液123也可以用于制备质粒文库。

质粒文库是一种保存了大量质粒的库，可以用于筛选特定基因或进行基因测序等研究。

此外，质粒提取溶液123还可用于质粒测序、质粒转染等实验。

然而，质粒提取溶液123的使用也存在一些注意事项。

首先，在使用过程中需要严格遵守实验操作规范，避免对人体和环境造成伤害。

其次，使用质粒提取溶液123时需要注意浓度的选择，以及合适的操作温度和时间。

此外，质粒提取溶液123在保存和运输过程中需要避免高温和阳光直射，以防止溶液的变质和降解。

总的来说，质粒提取溶液123是一种常用的实验试剂，具有分离提取质粒的作用。

它在基因工程研究、质粒文库制备等领域有着广泛的应用。

然而，在使用质粒提取溶液123时需要注意实验操作规范，并严格遵守使用要求。

提取质粒的原理随着基因工程技术的不断发展，提取质粒已经成为了分子生物学和生物技术领域中的一项基本操作。

质粒提取是指从细菌中提取质粒，并进行纯化和鉴定的过程。

质粒是一种很小的环状DNA分子，它存在于细菌细胞内，并承担着细菌的一些重要生命活动，如抗生素抗性等。

质粒提取的过程是分子生物学实验中的一个重要步骤，对于分子生物学实验的成功与否有着至关重要的作用。

本文将介绍质粒提取的原理和方法。

质粒提取的原理提取质粒的原理主要是利用细菌细胞壁的物理和化学特性，将细菌细胞壁破裂，并将质粒从其中分离出来。

主要的步骤包括：1. 细胞裂解将细菌细胞裂解是提取质粒的第一步。

细胞壁的物理和化学特性限制了质粒的提取，因此需要先破坏细胞壁。

通常使用碱性溶液、高渗液、超声波等方法破坏细胞壁，使得细胞内的物质可以释放出来。

2. 分离质粒破坏细胞壁后，质粒和细胞内的其他物质就一起释放出来了。

此时需要用化学方法将质粒与其他物质分离开来。

常用的方法有离心、溶液层析、凝胶过滤等。

3. 纯化质粒分离出来的物质中，除了质粒外还有其他的DNA片段、RNA、蛋白质等。

为了得到纯净的质粒，需要进行进一步的纯化。

如聚丙烯酰胺凝胶电泳、离子交换层析、亲和层析等。

4. 鉴定质粒最后一步是鉴定质粒。

鉴定质粒的方法有多种，包括酶切、PCR、测序等。

通过这些方法可以确定质粒序列、大小、拓扑结构等信息。

质粒提取的方法1. 碱裂解法碱裂解法是最常用的质粒提取方法之一。

其原理是利用NaOH和SDS对细胞壁进行破坏，使得细胞内的DNA、RNA、蛋白质等物质可以释放出来。

具体步骤如下：（1）将细菌菌落接种到含有适当抗生素的LB培养基中，进行培养。

（2）将菌落转移到含有适当抗生素的LB培养基中，进行预培养。

（3）收集细菌菌落，进行洗涤。

（4）将菌落加入含有10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0的缓冲液中，进行瞬时冻存。

（5）加入含有50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl、10mM EDTA、0.5% SDS、pH12.0的溶液中，进行碱裂解。

诺唯赞质粒提取原理一、引言质粒提取是分子生物学研究中常用的实验技术之一，用于从细菌中提取质粒DNA。

诺唯赞质粒提取试剂盒是一种常用的质粒提取工具，其原理基于离心、裂解、沉淀和洗涤等步骤，能够高效地提取出纯度较高的质粒DNA。

本文将详细介绍诺唯赞质粒提取试剂盒的原理及操作步骤。

二、诺唯赞质粒提取试剂盒的原理诺唯赞质粒提取试剂盒的原理主要包括以下几个步骤：1. 细菌裂解首先，将含有目标质粒的细菌进行裂解。

细菌裂解液中含有蛋白酶和裂解缓冲液，能够有效地破坏细菌细胞壁和细胞膜，释放出细菌内的质粒。

2. 质粒DNA的结合裂解后的细菌溶液中加入提取试剂盒中的结合缓冲液，该缓冲液中含有高盐浓度和特定的结合物质。

高盐浓度可以使DNA与其他细胞组分（如蛋白质）发生离子相互作用，从而使DNA更容易与结合物质结合。

结合物质则能够选择性地结合质粒DNA。

3. 质粒DNA的洗脱经过结合步骤后，将溶液转移到柱子中，并进行离心。

离心过程中，质粒DNA与结合物质结合在柱子上，而其他细胞组分则被洗涤缓冲液洗去。

最后，加入低盐洗涤缓冲液，以去除残留的盐离子。

4. 质粒DNA的洗脱和纯化最后，将洗脱缓冲液加入柱子中，使质粒DNA从结合物质上洗脱下来。

洗脱缓冲液中含有适当的pH和离子浓度，能够使DNA解离出结合物质，并保持其稳定性。

洗脱后的质粒DNA即为纯化的质粒DNA，可用于后续的实验操作。

三、诺唯赞质粒提取试剂盒的操作步骤以下是使用诺唯赞质粒提取试剂盒进行质粒提取的详细操作步骤：1. 细菌裂解1.取出含有目标质粒的培养物，离心沉淀细菌。

2.弃去上清液，加入适量的细菌裂解液。

3.充分混匀，放置一定时间使细菌完全裂解。

2. 质粒DNA的结合1.加入适量的结合缓冲液，充分混匀。

2.将混合液转移到柱子中，进行离心。

3.弃去滤液，再次进行离心。

3. 质粒DNA的洗脱1.加入洗脱缓冲液，进行离心。

2.弃去滤液，再次进行离心。

3.加入低盐洗涤缓冲液，进行离心。

碱裂解法提取质粒一、基本概念1．质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。

现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。

在基因工程中质粒常被用做基因的载体。

许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。

质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。

有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。

目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。

细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。

根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。

每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。

按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。

一般分子量较大的质粒属严紧型。

分子量较小的质粒属松弛型。

质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。

在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。

人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。

常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。

pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。

如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。

各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA 分子。

目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH 和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。

例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。

对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。

1M Tris-HCl[t1] (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。

在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。

任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。

50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。

因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。

质粒DNA提取的原理及方法碱裂解法质粒DNA提取原理质粒DNA提取主要包括以下几个方面:如何将细胞裂解释放质粒DNA，如何将质粒DNA和基因组DNA分离开来，如何去除RNA污染，如何去除蛋白质和其它杂质。

质粒提取方法中，最常用的方法是碱裂解法,它具有得率高,适用面广，快速，纯度高等特点.其原理是：强碱性条件下,质粒DNA和基因组DNA同时从细胞中释放出来，并发生变性.在pH中性,并有高盐浓度存在的条件下，质粒DNA会迅速发生复性,仍为可溶性状态，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构,在去垢剂SDS作用下，染色体DNA与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，通过离心去除沉淀后，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA，用异丙醇或乙醇沉淀可将之纯化出来。

BIOMIGA公司质粒DNA纯化系列试剂盒，采用碱裂解法质粒提取原理，在高盐环境下，采用硅胶膜特异性的吸附质粒DNA，而蛋白质不被吸附，最后用低盐洗脱液将DNA从膜上洗脱下来,方法简单，快速，质量好,收获量高。

影响质粒提取的因素影响质粒提取的因素有很多种，如质粒拷贝数,宿主菌株的种类，细菌的培养时间、培养基种类、培养条件等等。

质粒拷贝数质粒DNA最终收获量取决于质粒的拷贝数和质粒的大小。

BIOMIGA 公司质粒DNA提取系列试剂盒,操作步骤适用于高拷贝数质粒的纯化，对于低拷贝质粒纯化提取，应加大起始菌液量的体积，并且相应地增加各种缓冲液的用量。

下表给出一些常用质粒载体的拷贝数：质粒种类复制起点拷贝数1 mL菌液质粒DNA收获量（µg）pSC101pSC10150。

1-0。

2pACYCP15A10-120。

4—0.6pSuperCospMB110—200。

4-1pBR322pMB115-200.6—1pGEMRMuted pMB1300-4006—7pBluescriptRColE1300—5006—8pUCMuted pMB1500—7008—12宿主菌株宿主菌株的种类将会影响质粒的收获量。

质粒提取方法及原理质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，当前通常用其来特指细菌、真菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的 DNA分子。

在基因工程领域，质粒常常被当做基因的载体使用。

在分子生物学中，质粒 DNA被当做基因运载工具具有非常广泛的应用。

在质粒DNA的应用过程中，其纯度对于酶切、PCR扩增等实验结果有着比较大的影响，因此需要保证质粒DNA提取的纯度和效率。

在细菌中提取质粒DNA通常按照以下步骤进行:第一步，培养细菌，使质粒扩增;第二步，进行细菌的收集和裂解;第三步，质粒 DNA的分离和纯化。

在质粒DNA的提取过程中，其提取效果和其大小呈现出正比例关系，越小越容易进行提取，这主要是由于，如果质粒DNA比较大的话，其特性机会和染色体DNA比较接近，这样想要将二者分离开来难度就会变大。

在进行质粒DNA的分离时，适宜的条件是非常重要的，主要包括pH值、SDS浓度、时间和溶菌温度等，在适宜的条件下质粒DNA和染色体DNA 才能够更好的分离开来。

细菌浓度对于质粒 DNA的提取也是非常重要的，如果细菌的浓度比较高，那么在溶菌时，溶菌液很难和细菌液充分混合，导致溶菌不彻底的问题，这样会造成质粒的回收率比较低；而如果细菌溶度比较低，溶菌液和菌液均分混合，会造成溶液中含有较多的蛋白质、染色体以及菌体碎片，在这样的情况下，沉淀时质粒回合这些物质共沉，进而导致质粒的回收率也会比较低。

在生物学的相关研究之中，细菌质粒DNA的提取是比较常规的技术和操作，主要的方法有碱裂解法、煮沸法以及SDS裂解法等，下面对碱裂解法进行介绍。

碱裂解法碱裂解法是当前应用比较广泛的质粒 DNA提取方法，这种方法的优点在于提取的质粒DNA纯度高，操作便捷，缺点是需要较长的提纯时间。

研究人员在缩短这一方法的提纯时间方面做了大量的研究，但是没有得到理想的效果，当前这一方法提取 DNA 的时间都在1.5h 以上。

碱裂解法提取质粒DNA的基本原理:首选，在菌液中加入溶液Ⅰ，细菌细胞悬浮，同时其中的EDTA会和Ca2+以及Mg2+鳌合，起到抑制DNase活性的作用；然后，加入溶液Ⅱ，将细胞裂解，在这个过程中蛋白质和少量质粒将会变质；再次，加入溶液Ⅲ，使多数蛋白质以及染色体DNA被沉淀，并使得质粒DNA复性。

1、实验安排：碱变性法抽提质粒DNA DNA，除了菌体培养、质粒扩增金额和收集菌体外，其提，除了菌体培养、质粒扩增金额和收集菌体外，其提取过程大致可分为三个步骤：从染色体DNA 中分离质粒DNA DNA，这是提取过程中最关键的操作，这是提取过程中最关键的操作步骤步骤;;去除质粒DNA 中的RNA;RNA;进一步纯化质粒进一步纯化质粒DNA DNA，去除蛋白质等杂质。

，去除蛋白质等杂质。

，去除蛋白质等杂质。

2、一些试剂的生化作用原理、一些试剂的生化作用原理（1）溶液Ⅰ）溶液Ⅰ溶霉菌：水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌作用。

糖苷键，因而具有溶菌作用。

葡萄糖：增加溶液的粘度，防止DNA 受机械剪切力作用而降解。

受机械剪切力作用而降解。

EDTA EDTA：：金属离子螯合剂，金属离子螯合剂，螯合螯合Mg2+Mg2+，，Ca2+Ca2+等金属离子，等金属离子，等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶抑制脱氧核糖核酸酶抑制脱氧核糖核酸酶（（DNase DNase））对DNA 的降解作用（DNase 作用时需要一定的金属离子强度作辅基），同时EDTA 的存在，的存在，有利于溶有利于溶霉菌的作用。

因为溶霉菌的反应要求有较低的离子强度环境。

霉菌的作用。

因为溶霉菌的反应要求有较低的离子强度环境。

（2）溶液Ⅱ）溶液Ⅱ-NaOH-SDS -NaOH-SDS 液NaOH NaOH：核酸在：核酸在pH 值为5~9的溶液中是最稳定的，但pH 大于12或小于3时，就会引起双键之间氢键的解离而变性。

在溶液Ⅱ中的NaOH 浓度为0.2N 0.2N，加入提取液时，该系统的，加入提取液时，该系统的pH 就会高达12.612.6，因而促使染色体，因而促使染色体DNA 与质粒DNA 的变性。

的变性。

SDS SDS：为阴离子表面活性剂，主要功能有：溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，从而破坏细胞膜；：为阴离子表面活性剂，主要功能有：溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，从而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白SDS 蛋白质结合为复合物，使蛋白变性沉淀下来，但SDS 能抑制核糖核酸没的作用，酸没的作用，所以在以后的提取过程中，所以在以后的提取过程中，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，必须把它去除干净，必须把它去除干净，以防用以防用RNase 去除RNA 时受到干扰。