大连海域产碱性蛋白酶海洋菌的筛选
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36生物技术世界 BIOTECHWORLD碱性蛋白酶是一类在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,是一类非常重要的工业用酶,广泛应用于医药、食品、饲料、废物处理等行业[1]。
目前工业用蛋白酶大多由芽孢杆菌属菌株产生,经过条件优化及诱变处理,蛋白酶具有较高的产量及稳定性,但仍无法满足市场对特殊性能蛋白酶的需求。
海洋微生物因其特殊生存环境,相比于陆地微生物具有独特的生理特点、代谢途径及营养利用方式,其产生的酶及其他代谢产物往往具有特殊性能[2],因此海洋微生物是产碱性蛋白酶的重要资源之一。
国内对产碱性蛋白酶海洋微生物的研究主要集中在青岛海域、南海海域、红树林海域等地区[3],黄海海域特别是大连海域的研究较少。
本研究从大连大窑湾海域采集的海泥样品中,筛选出3株具有较好的产碱性蛋白酶能力的菌株,为后续实验奠定了基础。
1 材料与方法1.1 材料实验材料:大连大窑湾海域采集的3份海泥样品。
富集培养基(g/L):牛肉膏5,蛋白胨1,酵母粉5。
2216E培养基(g/L)[4]:蛋白胨5,酵母粉1,磷酸铁0.1,琼脂15。
酪蛋白培养基(g/L):干酪素10,酵母粉1,琼脂15。
种子及发酵培养基(g/L):蛋白胨10,牛肉膏3。
以上培养基均用海水配制,pH调至8.0。
牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、干酪素,北京奥博星生物技术有限责任公司;琼脂,日本进口分装;磷酸铁,美国西格玛奥德里奇公司;福林试剂,北京索来宝科技有限公司;其余试剂均采用国产分析纯。
分光光度计,美国赛默飞BioMate 3S分光光度计。
1.2 方法1.2.1 样品采集大连大窑湾海域枯潮时,无菌采样器采取浅滩5-20cm深的海泥样品,并取30cm以下的海水。
海泥采集后尽快进行实验,海水经过滤、灭菌后冷藏备用。
1.2.2 菌株分离纯化取1g 土样于无菌试管中,加入9mL无菌生理盐水,充分震荡后,静置取上清液1mL于富集培养基中,28℃、140r/min摇床培养48h。
将培养液按浓度梯度稀释至106倍后涂布于酪蛋白培养基上,37℃培养48h。
挑取能产生水解圈的单菌落于2216E培养基上多次划线分离纯化,得到纯菌株后保存于2216E斜面上[5]。
1.2.3 菌株初筛纯化后的菌株点种于酪蛋白培养基上,37℃培养24h。
测量其产生的水解圈直径(D)和菌落直径(d),测3 次,取平均值,并计算水解圈直径与菌落直径的比值(D/d) ,比值越大则相对产酶能力越强。
水解圈不明显的,可以在平板上滴加10%(W/V)的三氯乙酸(TCA)溶液,沉淀酪蛋白,水解圈会更明显[2]。
1.2.4 菌株复筛挑取具有较好产酶能力的菌株接于种子培养基中,32℃、140r/min摇瓶培养24h得种子液。
以3%的接种量接于50mL发酵培养基中,37℃、160r/min摇瓶培养48h [3]。
发酵液10000r/min、4℃离心10min 得上清液即为粗酶液,用福林酚法测定其酶活力。
选择酶活大的菌株进行重复试验。
酶活力测定参考文献[6]。
2 结果大连海域产碱性蛋白酶海洋菌的筛选洪涛 马金龙*1(大连民族学院生命科学学院 大连辽宁 116600)摘要:从大连海域采集的海泥样品中筛选能产碱性蛋白酶的海洋细菌。
用酪蛋白平板涂布法筛选得到55株具有产碱性蛋白酶能力的菌株。
分离纯化后,经酪蛋白平板点种法初筛和福林酚法复筛,得到3株具有较强产碱性蛋白酶能力的菌株DL07、DL18和DL31,其酶活分别为156.5 U/mL、129.7U/mL和179. 4 U/mL。
实验结果表明从大连海域获得了碱性蛋白酶高产菌株,丰富了菌种资源。
菌株DL07和DL31将来可作为良好的出发菌株进行改良、驯化,探索产物碱性蛋白酶优良特性,以期适用于工业应用。
关键词:碱性蛋白酶 海洋菌 筛选中图分类号:TQ925文献标识码:A文章编号:1674-2060(2015)10-0036-02Abstract:To Isolate the alkaline protease-producing marine bacteria from sea mud samples of Dalian sea area, 55 bacteria which can product alkaline proteasewere obtained from Casein media using spread-plate method. And after the separation and purification, 3 strains called DL07, DL18 and DL31 with stronger enzyme production capacity have been got by size comparison of the hydrolysis zone and by rescreening by Folin-phenol reagent method. And their enzymeactivity were 156.5 U/mL, 129.7U/mL and 179. 4U/mL. It shows that we can get alkaline protease-producing marine bacteria from Dalian sea area, and thespecies resources may be enriched. Strain DL07 and DL31 may be improved and domesticated as the good starting strains.Key Words:alkaline protease marine bacteria isolation基金项目:大连民族大学博士启动金、中央高校基本科研业务费专项资金(DC201502020401)和大学生创新创业训练计划(X201403060)作者简介:洪涛,大连民族大学生物工程专业本科生,主持大学生创新创业训练项目一项。
通讯作者: 马金龙,博士,工程师,研究方向为微生物发酵,植物生理,基因工程。
图1 菌株DL07的水解圈37BIOTECHWORLD 生物技术世界2.1 菌株分离纯化对3份海泥样品中的海洋菌进行富集、筛选、分离纯化,在酪蛋白平板上可观察到白色、浅黄色、橘黄色等颜色,直径1mm-8mm,菌落边缘整齐度不一,表面光滑度各异的菌落。
根据菌落形态和水解圈情况挑选出了55株具有产酶能力的细菌,3次划线分离后使菌株得到纯化。
2.2 菌株初筛纯化后的菌株点种于酪蛋白平板上,37℃培养24h。
挑选水解圈直径(D)与菌落直径(d)比值(D/d)较大的进行相应直径测量,其中12株D/d相对较大,如表1所示。
其中DL07菌株比值最大为3.23。
DL07菌株于酪蛋白平板上培养48小时形成的水解圈如图1。
选择表中12株菌株进行复筛。
2.3 菌株复筛根据蛋白酶活力测定法[6],以酪氨酸的浓度为横坐标,OD680值为纵坐标,绘制标准曲线,由曲线得y=0.0082x+0.0007,R2=0.9990。
说明该方法在所测量的酪氨酸浓度范围内,酪氨酸浓度与OD680值之间有良好的线性关系。
将初筛得到的12株海洋菌进行摇瓶发酵培养后,经福林酚法测酶活力,其中DL07,DL18,DL31表现出较大的酶活力。
对这三个菌株进行重复试验再测两次酶活力,得其平均酶活力分别为156.5U/mL、129.7 U/mL和179.4 U/mL。
3 讨论与结论本实验在大连大窑湾海域采集的3份海泥样品中分离出55株具有产碱性蛋白酶能力的菌株,经过酪蛋白平板法初筛和福林酚测酶活力法复筛,得到3株具有较好产酶能力的菌株。
其中菌株DL31产酶菌株编号 菌落直径(d) 水解圈直径(D) 比值(D/d) 菌株编号 菌落直径(d) 水解圈直径(D) 比值(D/d) DL07 4.60 14.75 3.21 DL18 4.07 10.33 2.54 DL11 5.15 10.25 1.99 DL20 5.25 10.75 2.05 DL12 4.50 8.63 1.92 DL24 5.23 9.60 1.84 DL13 4.75 10.25 2.16 DL26 5.10 9.77 1.92 DL14 6.90 13.00 1.88 DL29 7.77 13.33 1.72 DL15 3.40 7.65 2.25 DL31 3.33 7.93 2.38表1 菌落直径与水解圈直径(单位:厘米)酶活高达179.4 U/mL。
郇惠杰等人[7]在南海海域筛选的产蛋白酶的菌株中,产酶最高酶活力为90 U/mL,本实验筛选的3株菌产酶酶活均比其高。
崔洪霞等人[3]在秦皇岛海域筛选的碱性蛋白酶产生菌,最高酶活为172.75 U/mL,与本实验筛选出的DL31相当。
本实验在大连海域筛选出的产碱性蛋白酶的海洋菌具有较好的产酶能力,相信经过后期对DL07和DL31菌株发酵条件进行优化及相关驯化处理,其产碱性蛋白酶能力还能得到较大提高,并适用于工业应用。
本文为该菌株的进一步研究和应用奠定了基础。
参考文献[1]胡学智,王俊.蛋白酶生产和应用的进展[J].工业微生物,2008,38(4):49-61.[2]张祁,宁喜斌.上海临港海域产蛋白酶海洋细菌的筛选及鉴定[J].食品工业科技,2013,34(03):192-197.[3]崔洪霞,李春林,钱龙,孙滢,周艳艳,史云柯.一株高产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及发酵条件的优化[J].燕山大学学报,2013,37(01):88-94.[4]张晓华.海洋微生物学[M].青岛:中国海洋大学出版社,2007.[5]DENG AH, WU J, ZHANG Y, et al.Purification and characteriza-tion of a surfactant-stable high alkaline protease from Bacil-lus spB[J].Bioresource Techology, 2010, 101(18):7111-7117.[6]中华人民共和国专业标准( SB/T 10317－1999) .蛋白酶活力测定法[S].北京:中国标准出版社,1999.[7]郇惠杰,钟泓波,雷芬芬,崔春,赵谋明.产蛋白酶海洋细菌的筛选、鉴定及发酵培养基的研究[J].食品工业科技,2013,34(24):181-185.1.3 结果与分析1.3.1 单因素实验对酶解椰衣的研究1.3.1.1 温度对酶解的影响由图1可知,在不同的温度下酶解48h后,还原糖的最高浓度出现在当T=50℃左右,说明此温度是酶解椰衣纤维的最适温度。
