山羊IGFBP3基因序列及群体遗传分析
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参照Ｃ，ｅｎＢｍ＇山所提供的牛ＩＧＦＢＰ－３基因序列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ｕ８３４６５）所设计的引物。Ｆ：５：ＣＣＡ ＡＯＣ ＧＴＧＡＧＡ ＣＡＧＡⅣｒ ＡＣ一３７；Ｒ：５＂－ＡＧＧ ＡＧＧＧＡＴＡＧＧ ＡＧＣＡＡＧＴＦ．３，。ＰＣＲ反应总体系为：１０ ＸＰＣＲ缓冲液 ２ ５ｔｄ，ｄＮ’『ｆＰｓ（２．５ｎｕｎｏｌ／Ｌ）２．ｏ脚，ＭｇＣｌ２（２５ｎｕｎｏｌｆＬ）２ ５＞Ｌ，引物（１００ｎｇ／ｄ）ｏ ３儿Ｔａｑ酶（５ Ｕ／ｆｔｄ）０．２一，模板 （５０ｎｇ／出）１ｍ，补水至２５山。反应条件为：预变性９７０ｃ／５ＩＩｌｉｎ；变性９４。Ｃ／ｈｎｉｎ，退火６０℃／ｌｍｉｎ，延伸７２％／ ２ｍｉｎ，循环３５次；延伸７２。Ｃ／ｌＯｎｆｉｎ。 １．４ ＰＣＲ产物及酶切片段的检测
（５．Ｔｈｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆＣａｔｔｌｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎＨｅｎａｎ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ，４５０００３）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅＤＮＡ ｓｅｑｕｅＨｃｅｓ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ＭＲＦ４ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ ｔｏ Ｂｌａｓｍ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ａｇａｉｌｌｓｔ ｔｈｅ Ｉｌｒ ａｎｄ ｈｔｇｓ ｉｎ ＮＣＢＩ．Ａ ｗｏｒｋｉｎｇ ｄｒａｆｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣ １３８１６６）ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ．ＡＣ １３８１６６ ｓｈｏｗｓ ｈｉｇｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ｔｈｅ ｃＤ— ＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，Ｇｅｍｃａｎ，ＨＭＭｇｅｎｅ ａｎｄＧＥＮＥＩＤ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｗｅｒｅ ｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔｔｈｅ ｅｘｏｎｓａｎｄ ｉｎｔｒｏＩｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｅｕｓ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆＡＣｌ３８１ ６６．Ｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅ ＭＲＦ４ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｒｅｅ ｅｘｏｎｓ． Ｔｈｅ ｆｕｌｌ．１ｅｎｇｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅ ＭＲＦ４ ｓｌｌｍ％７７％ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｉｎ １８１７ ｂｐ ｏｖｅｄａｐ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ＭＲＦ４ ｇｅｎｅ ａｎｄ ７２％ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｉｎ １６６１ ｂｐ ｏｖｅｒｌａｐ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆｔｈｅ ｍｏｌｌｆｉｅ ＭＲＦ４ ｇｅｎｅ．Ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂｙ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ＭｅＰｍｍｏｔｅｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ，
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｏｖｉｎｅ ＭＲＦ４ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｃａｌ Ｘｉｎｌ Ｃｈｅｎ Ｈｏ暗’３ Ｚｈａｎｇ Ｈａｉｍｎ９４ Ｗａｎｇ Ｓｈａｎ２ Ｗａｎｇ Ｘｉｎｚｈｕａｎ９５
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ啦Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，）＇ａｎｇｌｉｎｇ，７１２１００）
经ｙ２适合性检验：ＹＪ、ｃＦ、凹、Ｆｌ、Ｆ２、ＷＩ）和Ｉｓ群体全部处于Ｈａｒｄｙ—Ｗｅｉｚｒｂｅｒｇ平衡状态，其ｚ２值依
次为０．４７３、１．８９８、０．９３０、２．８８３、１．５４５、０．３５４和０．３５７，均低于５．９９１（见表１）。
经ｘ２独立性检验，基因型在群体问的分布不存在显著差异（Ｐ＞０．０５，ｚ２＝８．９５２‘ｘ：＝ｏ．０５（１２）＝
关键词：山羊；ＩＧＦＢＰ－３基因；序列分析；群体遗传；ＰＥＲ．ＲＦＬＰ
ＩＧＦＢＰ．３是一种生长激素依赖型复合体的结合亚基，由５３ ｋｄ的耐酸亚单位与不耐酸的８５ ｋｄ的亚 单位结合，再结合一个ＩＧＦ—Ｉ或ＩＩ，组成了一个１５０ ｋｄ的１ＧＦ结合蛋白，是循环中主要的运输分子。１。 ＩＧＦＢＰ－３可以增强ＩＧＦ—Ｉ的效应，能促进ＩＧＦ—Ｉ在骨上的合成代谢效应。ＩＧＦＢＰ－３可作为ＩＧＦｓ的局部存 储器，通过自分泌或旁分泌形式持续将其释放于局部环境而增加ＩＧＦｓ的半衰期。２ｌ。ＩＧＦＢＰ－３主要存在 于血液，是血液中最丰富的ＩＧＦＢＰ结合形式，对ＩＧＦ－Ｉ和ＩＧＦ．１Ｉ具有很高的亲合力，血液中９５％以Ｅ的 ＩＧＦ－Ｉ和ＩＧＦ－ＩＩ与ＩＧＦＢＰ－３结合。可见，ＩＧＦＢＰ－３对ＩＧＦｓ正常功能的发挥具有重要的作用。
多态性，这说明在我国的西农萨能奶山羊、崂山奶山羊和文登奶山羊等地方选育奶山羊品种和肉用波尔 山羊、鲁北白山羊及其杂交后代中，在Ｈｏｅ ＩｌＩ和７如Ｉ的酶切位点处碱基序列都很保守，在Ｈｏｅ ｌＩＩ和 ７ａｑ Ｊ酶切位点，不易发生转换或颠换等遗传变化。但是孙维斌等（２００３）对秦川牛ＩＧＦＢＰ－３基因该位点 进行ＰＣＲ．ＲＦＬＰ分析时却发现该位点存在Ｈａｅ ＨＩ多态性，分析浚序列发现：第２９９位的ｃ—Ａ颠换导致 了１个强＊Ⅲ酶切位点的丢失，是该位点产生多态性的根本原因”Ｊ。这或许预示着：物种间在该位置存 在保守性的差异，具有种属特征。这有待于扩大ｔｌｊ羊和牛的品种数目和实验样本数目以及在其他物种 中加以验证。本研究也证明该位点与许多经济性状有关系，因此继续在物种问及品种内在此位置拓展 实验群体以研究其多态性，对分子标记辅助选择（ＭＡＳ）和研究亲缘关系都很有意义。
２１．０２６），这说明在该位点基因型的分布没有种属特征。
３讨论
山羊１ＧＦＢＰ－３基冈该位点的扩增产物测序后为６５３ｂｐ，这与蓝贤勇对西农萨能奶山羊的相应片段的
测序结果有差异Ｌ４一，与其（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ：ＡＹ５２６１１４）相比发生了碱基Ｃ和Ａ的缺失；和Ｋｌｌ，１１ａｒ等人（２００３）
２０２∞中国动物遗传育种研究进展
图１山羊１ＧＦＢＰ－３基因ＰＣＲ产物图
图２山羊１ＧＦＢＰ－３基因ＸＷ Ｔ多态图
Ｍａ矗盯：ＤＧＬ２０００
Ｍａ＾ｅｒ：ＤＧｌ２０００；１，２：ＡＧ；３－５：ＡＡ；６：ＧＧ
２．２山羊ＩＧＦＢＰ－３基因序列分析
用ＢＬＡＳＴ进行序列比对发现该序列（ＡｃｃｅｓｓｊｏｎＮｏ．：ＡＹ７８５５５９）包括山羊ＩＧＦＢＰ－３基因的部分ｅｘｏｎ２、
关系具有科学性，能够反映比较真实的进化历程。
２．３ ｇＩＧＦＢＰ．３基因的基因型、基因频率及群体平衡性检验
检测结果表明：每个群体均有３种基因型，其中均以杂合型居多，纯合基因型叉以ＡＡ居多。等位
基囚Ａ和Ｇ在每个群体中基本稳定，等位基因Ａ的频率均在ｏ．５以上，以“群体等位基因Ａ频率最高
（０．５９２），以Ｆ１群体为最低，仅为ｏ．５２９（见表１）。
ｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ａ１６０７１２４）和人类的相应序列，用ＤＮＡＭＡＮ软件进行了序列比对，结果发现该序列与它们的
同源性依次为９９．１％、９８．１％、９４．１％、７９ ０％、３４．４％和５４．１％，４种反刍动物之间非常保守，同源性均
在９０％以上，见图３。以比对结果构建的分子系统发育树，也基本能够反映出物种问的进化过程，如
某基因位点的Ｈａｒｄｙ－Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡性检测采用皮尔逊Ｙ２统计量，其公式为：
７（２：费蛳－—ｎｐ—ｉ）２
～
茸
印：
其中，ｍ为某一遗传位点基因型应有个数；ｉ为基冈型序号；＾代表第ｉ个基因型的实际个体数量；
ｎ为样本数量；Ｐ。代表第ｉ个基因型的理论频率。
不同晶种（群体）之间的基因型分布差异采用１２独立性检验。
图４。
１００％９０％８０％７０％６０％５０％４０％３０％
渡尔 西萨 绵羊 奶牛 猪 人类 家鼠
家鼠
幽３ ７种生物的同源利
图４ ７种生物的系统发育树
从上图可以明显看出肉用山羊与奶山羊的亲缘关系最近，其后依次是与绵羊、奶牛和猪，与家鼠的
进化关系最远。这与生化、细胞和形态上的聚类结果相吻合，这说明以此位点研究物种之问的起源进化
完整ｉｎｔｒｏｎ２和ｅｘｏｎ３及部分ｉｎｔｒｏｎ３。对该波尔山羊序列与西农萨能奶山羊（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＹ５２６１１４）、
绵羊（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＹ３０６０１２）、奶牛（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＹ３０６０１１）、猪（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＹ４２２０４５）、小鼠（Ａｃ—
２结果与分析
２．１扩增产物及酶切分型
扩增产物为６５０ｂｐ左右，电泳带明亮，特异性好，如图ｌ。对１只波尔山羊个体和１只鲁北自山羊个
反刍动物分子遗传与育种田２０１
体的ＰＣＲ产物进行回收和测序，结果两条序列完全相同（序列已提交ＧｅｎＢａｎｋ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．： ＡＹ７８５５５９），存网上用软件ＢＬＡＳＴ进行序列分析，以期获得变异碱基信息，然后用Ｂｉｏｅｄｉｔ ７．０软件有针对
性地进行限制性内切酶分析。根据情况，选用ＨｉｎｆＩ、脚Ｉ、Ｈａｅ ＩＨ、Ｍｓｐ ｌ、ｎ“Ⅱ、ｚ如Ｉ和Ｘｈｏ Ｉ等进行 消化实验，结果表明，除如Ｉ外，均没有发现其他内切酶的多态性。图２是扩增产物经ＸｓｐＩ酶切的电
泳图谱。对另一纯合型个体扩增产物纯化测序后发现：２种纯合基因型在ｉｎｔｒｏｎ２内部２３６位（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＡＹ７８５５５９）有Ａ＿＋Ｇ转换。在该位置是Ａ的定义为等位基因Ａ，即存在ＸｓｐＩ切点，等位基因Ａ有 ２３４ｂｐ和４１９ｂｐ２条带；是Ｇ的定义为等位基因Ｇ，等位基因Ｇ仅有一条带，没有ＸｓｐＩ切点。
１．２％含ＥＢ的琼脂糖凝胶上电泳检测。酶切反应体系中酶和其他必要成分的用量按说明书进行， ３７℃恒温循环器巾消化４．５ｈ后取出。制作２．５％的琼脂糖凝胶，ＩＯＯＶ电压电泳１ｈ，ＥＢ染色。用Ｋ０． ｄａｋｌ２０凝胶成像系统或数码相机成像。 １．５基因和基因型频率
ＰＡＡ＝ＮＡＡ／Ｎ；ＰＡ＝ｆ２ＮＡＡ＋ＮＡａｌ＋ＮＡａ２＋ＮＡａ３＋ＮＡａ４＋··－···＋ＮＡａｎ）／２Ｎ 其中：ＰＡＡ代表某一位点的ＡＡ基因型频率；ＮＡＡ表示群体中具有ＡＡ基因型的个体数；Ｎ为检测群 体的总数量。ＰＡ表示等位基因Ａ频率，ＮＡＡ表示群体中具有ＡＡ基因型的个体数量，ＮＡｔａｌ表示群体中 具有Ａａｉ基因型个体数量，ａｌ～ａｎ为等位基因Ａ的ｎ个互不相同的复等位基因。 １．６群体平衡性检验
表ｌ ｇＩＧＦＢＰ－３基因Ｆ４／Ｒ４位点基因与基因型频率分布
（５．Ｔｈｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆＣａｔｔｌｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎＨｅｎａｎ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ，４５０００３）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅＤＮＡ ｓｅｑｕｅＨｃｅｓ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ＭＲＦ４ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ ｔｏ Ｂｌａｓｍ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ａｇａｉｌｌｓｔ ｔｈｅ Ｉｌｒ ａｎｄ ｈｔｇｓ ｉｎ ＮＣＢＩ．Ａ ｗｏｒｋｉｎｇ ｄｒａｆｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣ １３８１６６）ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ．ＡＣ １３８１６６ ｓｈｏｗｓ ｈｉｇｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ｔｈｅ ｃＤ— ＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，Ｇｅｍｃａｎ，ＨＭＭｇｅｎｅ ａｎｄＧＥＮＥＩＤ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｗｅｒｅ ｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔｔｈｅ ｅｘｏｎｓａｎｄ ｉｎｔｒｏＩｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｅｕｓ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆＡＣｌ３８１ ６６．Ｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅ ＭＲＦ４ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｒｅｅ ｅｘｏｎｓ． Ｔｈｅ ｆｕｌｌ．１ｅｎｇｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅ ＭＲＦ４ ｓｌｌｍ％７７％ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｉｎ １８１７ ｂｐ ｏｖｅｄａｐ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ＭＲＦ４ ｇｅｎｅ ａｎｄ ７２％ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｉｎ １６６１ ｂｐ ｏｖｅｒｌａｐ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆｔｈｅ ｍｏｌｌｆｉｅ ＭＲＦ４ ｇｅｎｅ．Ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂｙ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ＭｅＰｍｍｏｔｅｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ，
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｏｖｉｎｅ ＭＲＦ４ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｃａｌ Ｘｉｎｌ Ｃｈｅｎ Ｈｏ暗’３ Ｚｈａｎｇ Ｈａｉｍｎ９４ Ｗａｎｇ Ｓｈａｎ２ Ｗａｎｇ Ｘｉｎｚｈｕａｎ９５
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ啦Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，）＇ａｎｇｌｉｎｇ，７１２１００）
经ｙ２适合性检验：ＹＪ、ｃＦ、凹、Ｆｌ、Ｆ２、ＷＩ）和Ｉｓ群体全部处于Ｈａｒｄｙ—Ｗｅｉｚｒｂｅｒｇ平衡状态，其ｚ２值依
次为０．４７３、１．８９８、０．９３０、２．８８３、１．５４５、０．３５４和０．３５７，均低于５．９９１（见表１）。
经ｘ２独立性检验，基因型在群体问的分布不存在显著差异（Ｐ＞０．０５，ｚ２＝８．９５２‘ｘ：＝ｏ．０５（１２）＝
关键词：山羊；ＩＧＦＢＰ－３基因；序列分析；群体遗传；ＰＥＲ．ＲＦＬＰ
ＩＧＦＢＰ．３是一种生长激素依赖型复合体的结合亚基，由５３ ｋｄ的耐酸亚单位与不耐酸的８５ ｋｄ的亚 单位结合，再结合一个ＩＧＦ—Ｉ或ＩＩ，组成了一个１５０ ｋｄ的１ＧＦ结合蛋白，是循环中主要的运输分子。１。 ＩＧＦＢＰ－３可以增强ＩＧＦ—Ｉ的效应，能促进ＩＧＦ—Ｉ在骨上的合成代谢效应。ＩＧＦＢＰ－３可作为ＩＧＦｓ的局部存 储器，通过自分泌或旁分泌形式持续将其释放于局部环境而增加ＩＧＦｓ的半衰期。２ｌ。ＩＧＦＢＰ－３主要存在 于血液，是血液中最丰富的ＩＧＦＢＰ结合形式，对ＩＧＦ－Ｉ和ＩＧＦ．１Ｉ具有很高的亲合力，血液中９５％以Ｅ的 ＩＧＦ－Ｉ和ＩＧＦ－ＩＩ与ＩＧＦＢＰ－３结合。可见，ＩＧＦＢＰ－３对ＩＧＦｓ正常功能的发挥具有重要的作用。
多态性，这说明在我国的西农萨能奶山羊、崂山奶山羊和文登奶山羊等地方选育奶山羊品种和肉用波尔 山羊、鲁北白山羊及其杂交后代中，在Ｈｏｅ ＩｌＩ和７如Ｉ的酶切位点处碱基序列都很保守，在Ｈｏｅ ｌＩＩ和 ７ａｑ Ｊ酶切位点，不易发生转换或颠换等遗传变化。但是孙维斌等（２００３）对秦川牛ＩＧＦＢＰ－３基因该位点 进行ＰＣＲ．ＲＦＬＰ分析时却发现该位点存在Ｈａｅ ＨＩ多态性，分析浚序列发现：第２９９位的ｃ—Ａ颠换导致 了１个强＊Ⅲ酶切位点的丢失，是该位点产生多态性的根本原因”Ｊ。这或许预示着：物种间在该位置存 在保守性的差异，具有种属特征。这有待于扩大ｔｌｊ羊和牛的品种数目和实验样本数目以及在其他物种 中加以验证。本研究也证明该位点与许多经济性状有关系，因此继续在物种问及品种内在此位置拓展 实验群体以研究其多态性，对分子标记辅助选择（ＭＡＳ）和研究亲缘关系都很有意义。
２１．０２６），这说明在该位点基因型的分布没有种属特征。
３讨论
山羊１ＧＦＢＰ－３基冈该位点的扩增产物测序后为６５３ｂｐ，这与蓝贤勇对西农萨能奶山羊的相应片段的
测序结果有差异Ｌ４一，与其（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ：ＡＹ５２６１１４）相比发生了碱基Ｃ和Ａ的缺失；和Ｋｌｌ，１１ａｒ等人（２００３）
２０２∞中国动物遗传育种研究进展
图１山羊１ＧＦＢＰ－３基因ＰＣＲ产物图
图２山羊１ＧＦＢＰ－３基因ＸＷ Ｔ多态图
Ｍａ矗盯：ＤＧＬ２０００
Ｍａ＾ｅｒ：ＤＧｌ２０００；１，２：ＡＧ；３－５：ＡＡ；６：ＧＧ
２．２山羊ＩＧＦＢＰ－３基因序列分析
用ＢＬＡＳＴ进行序列比对发现该序列（ＡｃｃｅｓｓｊｏｎＮｏ．：ＡＹ７８５５５９）包括山羊ＩＧＦＢＰ－３基因的部分ｅｘｏｎ２、
关系具有科学性，能够反映比较真实的进化历程。
２．３ ｇＩＧＦＢＰ．３基因的基因型、基因频率及群体平衡性检验
检测结果表明：每个群体均有３种基因型，其中均以杂合型居多，纯合基因型叉以ＡＡ居多。等位
基囚Ａ和Ｇ在每个群体中基本稳定，等位基因Ａ的频率均在ｏ．５以上，以“群体等位基因Ａ频率最高
（０．５９２），以Ｆ１群体为最低，仅为ｏ．５２９（见表１）。
ｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ａ１６０７１２４）和人类的相应序列，用ＤＮＡＭＡＮ软件进行了序列比对，结果发现该序列与它们的
同源性依次为９９．１％、９８．１％、９４．１％、７９ ０％、３４．４％和５４．１％，４种反刍动物之间非常保守，同源性均
在９０％以上，见图３。以比对结果构建的分子系统发育树，也基本能够反映出物种问的进化过程，如
某基因位点的Ｈａｒｄｙ－Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡性检测采用皮尔逊Ｙ２统计量，其公式为：
７（２：费蛳－—ｎｐ—ｉ）２
～
茸
印：
其中，ｍ为某一遗传位点基因型应有个数；ｉ为基冈型序号；＾代表第ｉ个基因型的实际个体数量；
ｎ为样本数量；Ｐ。代表第ｉ个基因型的理论频率。
不同晶种（群体）之间的基因型分布差异采用１２独立性检验。
图４。
１００％９０％８０％７０％６０％５０％４０％３０％
渡尔 西萨 绵羊 奶牛 猪 人类 家鼠
家鼠
幽３ ７种生物的同源利
图４ ７种生物的系统发育树
从上图可以明显看出肉用山羊与奶山羊的亲缘关系最近，其后依次是与绵羊、奶牛和猪，与家鼠的
进化关系最远。这与生化、细胞和形态上的聚类结果相吻合，这说明以此位点研究物种之问的起源进化
完整ｉｎｔｒｏｎ２和ｅｘｏｎ３及部分ｉｎｔｒｏｎ３。对该波尔山羊序列与西农萨能奶山羊（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＹ５２６１１４）、
绵羊（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＹ３０６０１２）、奶牛（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＹ３０６０１１）、猪（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＹ４２２０４５）、小鼠（Ａｃ—
２结果与分析
２．１扩增产物及酶切分型
扩增产物为６５０ｂｐ左右，电泳带明亮，特异性好，如图ｌ。对１只波尔山羊个体和１只鲁北自山羊个
反刍动物分子遗传与育种田２０１
体的ＰＣＲ产物进行回收和测序，结果两条序列完全相同（序列已提交ＧｅｎＢａｎｋ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．： ＡＹ７８５５５９），存网上用软件ＢＬＡＳＴ进行序列分析，以期获得变异碱基信息，然后用Ｂｉｏｅｄｉｔ ７．０软件有针对
性地进行限制性内切酶分析。根据情况，选用ＨｉｎｆＩ、脚Ｉ、Ｈａｅ ＩＨ、Ｍｓｐ ｌ、ｎ“Ⅱ、ｚ如Ｉ和Ｘｈｏ Ｉ等进行 消化实验，结果表明，除如Ｉ外，均没有发现其他内切酶的多态性。图２是扩增产物经ＸｓｐＩ酶切的电
泳图谱。对另一纯合型个体扩增产物纯化测序后发现：２种纯合基因型在ｉｎｔｒｏｎ２内部２３６位（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＡＹ７８５５５９）有Ａ＿＋Ｇ转换。在该位置是Ａ的定义为等位基因Ａ，即存在ＸｓｐＩ切点，等位基因Ａ有 ２３４ｂｐ和４１９ｂｐ２条带；是Ｇ的定义为等位基因Ｇ，等位基因Ｇ仅有一条带，没有ＸｓｐＩ切点。
１．２％含ＥＢ的琼脂糖凝胶上电泳检测。酶切反应体系中酶和其他必要成分的用量按说明书进行， ３７℃恒温循环器巾消化４．５ｈ后取出。制作２．５％的琼脂糖凝胶，ＩＯＯＶ电压电泳１ｈ，ＥＢ染色。用Ｋ０． ｄａｋｌ２０凝胶成像系统或数码相机成像。 １．５基因和基因型频率
ＰＡＡ＝ＮＡＡ／Ｎ；ＰＡ＝ｆ２ＮＡＡ＋ＮＡａｌ＋ＮＡａ２＋ＮＡａ３＋ＮＡａ４＋··－···＋ＮＡａｎ）／２Ｎ 其中：ＰＡＡ代表某一位点的ＡＡ基因型频率；ＮＡＡ表示群体中具有ＡＡ基因型的个体数；Ｎ为检测群 体的总数量。ＰＡ表示等位基因Ａ频率，ＮＡＡ表示群体中具有ＡＡ基因型的个体数量，ＮＡｔａｌ表示群体中 具有Ａａｉ基因型个体数量，ａｌ～ａｎ为等位基因Ａ的ｎ个互不相同的复等位基因。 １．６群体平衡性检验
表ｌ ｇＩＧＦＢＰ－３基因Ｆ４／Ｒ４位点基因与基因型频率分布
