2株耐酸及耐胆盐嗜酸乳杆菌的分离筛选及其发酵特性研究

[收稿日期]　2006203219[基金项目]　吉林省科技发展计划项目(20050202-2).[作者简介]　王玉华(1972-),女,博士研究生,讲师,主要从事食品微生物学及功能性食品研究.[文章编号]100021832(2006)03201152042株耐酸及耐胆盐嗜酸乳杆菌的分离筛选及其发酵特性研究王玉华1,2,张桂荣2,3,刘景圣1(1.吉林农业大学食品工程学院,吉林长春130118;2.吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室,吉林长春130021;3.吉林大学生命科学学院,吉林长春130021)[摘　要]　从乌克兰发酵食品中分离出2200株乳杆菌,采用含0.3%胆盐和p H 为4.0的MRS 平板筛选出2株耐酸及耐胆盐能力强的嗜酸乳杆菌,并命名为La -W2和La -W3.对2株菌在脱脂乳中37℃培养48h 的p H 值、滴定酸度和活菌数等发酵特性进行了研究,结果表明:La -W2和La -W3有较强的耐酸性和耐胆盐能力,其发酵特性适于乳酸发酵食品要求.[关键词]　嗜酸乳杆菌(L actobacill us aci dophil us );耐酸及耐胆盐;分离筛选[中图分类号]　TS 20113 [学科代码]　180・7150 [文献标识码]　A 嗜酸乳杆菌(L actobacill us aci dophil us )是人和动物肠道中的重要微生物,对人和动物具有益生作用(probiotic effects ),被广泛用于发酵食品与微生态制剂[1-3].据报道,为了防止有关疾病的发生,只有摄入含有106个/mL 以上的活性嗜酸乳杆菌(L .aci dophil us )才能充分发挥其益生作用[4].口服乳酸菌若要到达肠道并在肠道内起作用,需要菌体或菌体产生的酶能够通过低p H 胃液存活下来,并耐受肠道内的胆盐浓度[5].研究表明不是所有的嗜酸乳杆菌都能耐受低p H 和高浓度胆盐环境,仅有少数嗜酸乳杆菌(L .aci 2dophil us )具有这种能力[6].目前,美国、保加利亚、丹麦、荷兰等国,正积极从事优良乳酸菌的选育研究[1].因此,耐酸及耐胆盐是筛选嗜酸乳杆菌(L .aci dophil us )的一个重要指标[7],筛选耐酸和耐胆盐能力强的嗜酸乳杆菌(L .aci dophil us )是一个重要的研究内容.本研究以乌克兰发酵制品为供试材料,进行了耐酸和耐胆盐的嗜酸乳杆菌的分离筛选,并对筛选菌株生长特性进行了研究,为嗜酸乳杆菌发酵食品的生产应用提供参考.1　材料和方法1.1　材料1.1.1　菌种　嗜酸乳杆菌(L .aci dophil us )La -W ,本实验室保存标准株,购于中科院微生物所菌种保藏中心.1.1.2　样品　乌克兰发酵食品(乌克兰基辅工学院提供).1.1.3　培养基　用于嗜酸乳杆菌分离的BCP 培养基和用于嗜酸乳杆菌培养的MRS 培养基的配制参见文献[8].选择培养基:MRS 培养基基础上,采用4mol/L 乳酸调节p H 值为4.0,猪胆盐0.3%.第38卷第3期东北师大学报(自然科学版)Vol.38No.32006年9月Journal of Northeast Normal University (Natural Science Edition )September 2006112　方法1.2.1　分离培养　将样品(4℃冰箱保存)进行倍数稀释,选择适宜稀释度,涂布于BCP平板,置于5%CO2,37℃培养箱中培养36～48h.1.2.2　生理生化鉴定　参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《乳酸菌———生物学基础及应用》.1.2.3　耐酸性和耐胆盐菌株筛选　将分离菌株的脱脂乳培养液适当稀释涂布于选择平板(p H 4.0,猪胆盐013%),CO2(5%)培养箱37℃培养, 3d后观察结果.1.2.4　耐受性试验　耐酸性试验:菌株于MRS 液体培养基中37℃培养过夜(15h),离心收集菌体,液体MRS培养基洗涤两次,重悬于p H为3.0的液体MRS培养基(4.0mol/L HCL调整),置于37℃培养箱中培养,并于0,1,2,3,4h分别取样.0.01mol/L TrisHCl缓冲液(p H6.8)进行10倍稀释,取适当稀释度涂布MRS平板,CO2(5%)培养箱培养24～48h,计数,计算存活率.耐胆盐试验:将MRS培养基37℃培养过夜的培养物接种于含0.3%胆盐的MRS新鲜培养基中,37℃培养,0,2,4h分别取样、稀释,涂布MRS平板,CO2(5%)培养箱培养24～48h,计数计算存活率.1.2.5　发酵特性试验　分别采用平板计数法, p H计和0.1mol/L NaOH滴定法测定筛选菌株在脱脂乳中37℃培养48h过程中的活菌数、p H 值和滴定酸度.2　结果与讨论2.1　菌株的分离、筛选2.1.1　嗜酸乳杆菌培养特征及形态特征　BCP 培养基上,菌落呈絮状,灰白色或无色,扁平,表面粗糙,边缘不整齐,直径1～2mm,并且使菌落周围培养基变黄.随机取数个菌落进行革兰氏染色、镜检.革兰氏染色呈阳性,无芽孢,粗杆或细杆,呈单杆、双杆或链杆排列.挑取2200个菌落周围培养基变黄范围较大的菌落于灭菌脱脂乳中37℃培养24h后,置于-20℃冰箱中保存备用.2.1.2　菌株的初筛　将分离菌株在灭菌脱脂乳培养基中按3%的接种量进行3次传代培养,培养温度为37℃.观察各菌株的凝乳速度,测定其发酵12h时的滴定酸度,感观评定无异味的菌株,共278株,传代于灭菌脱脂乳中,37℃培养24 h后置于-20℃冰箱中保存备用.2.2　耐酸和耐胆盐菌株的筛选　乳杆菌生长的p H范围为4.5～7.0,多数乳杆菌在p H为4.0的条件下不能生长,仅有嗜酸乳杆菌能够生长,而0.3%的胆盐是筛选耐胆盐菌株的关键浓度[9].将初筛菌株分别转接到选择培养基平板,37℃培养3d,获得耐酸和耐胆盐的菌落.另外,采用乳酸调节培养基的p H,有利于筛选耐酸性更好的菌株,游离的乳酸比氢离子对乳酸菌的影响更强[10-11],而且,在培养过程中,嗜酸乳杆菌(L.aci dophil us)自身代谢产生的酸性物质主要是乳酸,也有利于保证培养基质中的活菌数.由于这些菌落还存在着高度不稳定性,所以将所获得菌落连续传代于灭菌脱脂乳中12次后,传代于p H为3.0,含0.3%胆盐的液体MRS培养基.37℃培养3h,取样稀释,涂MRS平板,测定活菌数,筛选活菌数大于80%的菌株,获得2株性状稳定的菌株La-W2和La-W3.2.3　菌种的鉴定参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)和《乳酸菌———生物学基础及应用》,对2株菌株进行生理生化鉴定.形态观察和生理生化鉴定结果表明: 2株筛选菌株为嗜酸乳杆菌.2.4　筛选菌株的耐酸能力胃液p H值的大小根据饮食结构不同波动很大,通常p H值为3.0左右;而食品通过胃的时间相对较短,一般为1～2h[12].因此,观察4h内La -W2,La-W3与La-W在p H为3.0的液体MRS培养基中的活菌数变化,比较筛选菌株与标准菌株的耐酸能力,结果见图-W在p H为3.0的条件下,2h后活菌数降到105个/mL,4h 后,活菌数仅剩104个/mL;而筛选菌株La-W2和La-W3在p H为3.0的条件下,2h后活菌仍在107个/mL以上,活菌数存活率达80%,4h后,活菌数仍超过106个/mL,其耐酸性明显高于标准菌株.由于食物摄入2h后可通过胃到达肠道,所以筛选菌株能够耐受胃酸,可以通过胃进入肠道,并符合活菌数达到80%的要求.2.5　筛选菌株的耐胆盐能力人体小肠中胆汁盐含量在0.03%～0.3%之间波动,故采用0.3%胆盐作为筛选耐受肠道内胆盐的指标.将过夜培养的La-W2,La-W3与La-W分别接种在胆盐含量为0.3%的MRS培养基上,接种量为10%,37℃培养,观察菌株在611东北师大学报(自然科学版)第38卷0～4h 之间活菌的变化情况(见图2). 图1　La -W2,La -W3与La -W 耐酸性比较 图2　La -W2,La -W3与La -W 耐胆盐能力比较 由图2可见,La -W 菌株于含0.3%胆盐的MRS 液体培养基中培养2h 和4h 的活菌数与原培养液中活菌数差异显著;而筛选菌株La -W2和La -W3在此条件下,2h 后活菌数仍在107个/mL 以上,活菌存活率达80%,4h 内,活菌数仍超过106个/mL ;尤其是La -W3培养4h 后,活菌数达107个/mL.由此表明,筛选菌株具有较强的抗胆汁盐能力,能顺利通过小肠到达大肠.此外,筛选菌株La -W2和La -W3的耐酸性和耐受胆盐能力也表现出不同,从图1可见,La -W3的耐酸性明显高于La -W ;图2表明La -W3的耐受胆盐能力又远不如La -W2强.2.6　筛选菌株的发酵特性La -W2和La -W3菌株在37℃脱脂乳中生长期间(48h )的活菌数、p H 值、滴定酸度变化的测定结果见图3和4.　图3　La -W2和La -W3菌株于脱脂乳中37℃ 图4　La -W2和La -W3菌株于脱脂乳中37℃培养活菌数随时间的变化曲线培养pH 值与滴定酸度随时间变化曲线 由图3可见,筛选菌株在2～4h 期间生长速度最快,活菌数的对数与时间呈直线关系,此时斜率最大,即此期间为对数生长期;在8h 左右活菌数达到最高峰,其平衡期可延续至48h ,活菌数无明显衰减,这可能与该菌株的耐酸性有关.图4表明,筛选菌株在发酵过程中的p H 值随时间的推移逐渐下降.初期,p H 值下降速度慢,一段时间后,p H 值下降速度加快,即达到最适p H 值范围(5.5～6.0);在6～8h 期间,p H 值下降速度最快,此p H 值为该菌株的最适p H (5.5左右);当p H 值降至一定程度后,速度减慢并趋于零,最低p H 值达到3.5左右.这与一般乳酸菌最适p H 值5.5～6.0,在中性条件下通常会降低其生长速率,而当p H 值降至一定范围后,其生长速率也会下降的特性是一致的.随培养时间的延长滴定酸度不断递增,在10～12h 之间,滴定酸度形成速度最大,其滴定酸度占48h 期间总滴定酸度的30%以上,12h 内滴定酸度占总滴定酸度的70%左右,其产酸量主要集中在对数生长期,可以使发酵食品迅速达到所需要的酸度.711第3期王玉华,等:2株耐酸及耐胆盐嗜酸乳杆菌的分离筛选及其发酵特性研究由以上结果可见,两株分离菌株的生长特性符合乳酸发酵食品的要求[8],可以应用于酸奶、酸奶饮料及豆类、谷物等乳酸发酵制品中.也可在发酵肉制品、医药和发酵饲料工业中得到广泛的应用.[参　考　文　献][1]　FULL ER R.Peobiotics in human medicine[J].Gut,1991,32:439-442.[2]　COLL INS J K,Thornton G,Sullivan G O.Selection of probiotic strains for human applications[J].Int Dairy,1998(8):487-490.[3]　SANDERS M E,K laenhammer T R.The scientific basis of L actobacill us aci dophil us NCFM functionality as a probiotic[J].J DairySci,2001,84:319-331.[4]　SV ENSSON U.Industrial perspectives[M]//Tannock G W.Probiotics:a critical review.Wymondham:Horizon Scientific Press,1999:57-64.[5]　HOV EL H,Nùrgaard1H,Brùbech ctic acid bacteria and the human gastrointestinal tract 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analysesed in skim milk for48hours at37℃.Results show La-W2and La-W3both are acid and bile resistant stains and can be used for production of lactic acid fermented food.K eyw ords:L actobacill us aci dophil us;isolate;screening;acid and bile tolerance(责任编辑:方　林) 811东北师大学报(自然科学版)第38卷。