食品微生物学检验菌落总数培训

大，易流出等 2、颜色特别重的样品，如桔黄色，掩盖了菌落； 3、抑菌剂浓度比较高的样品，如辣椒及辣椒粉、大蒜及洋葱制品； 4、某些微生物会液化凝胶，造成局部扩散或菌落模糊的现象，大部分是芽胞杆菌。
3、菌落计算公式
有两个稀释度的菌落数在合适范围， 按照如下公式计算：
N
C (n10.1n2)d
N = 样品中菌落数
• 有时，当细菌浓度很高时，测试片中央没有可见菌落，但 圆形培养膜的边缘有许多小的菌落，其结果也记录为“多 不可计”；进一步稀释样品可获得准确的读数。
• 某些微生物会液化凝胶，造成局部扩散或菌落模糊的现象 。如果液化现象干扰计数，可以计数未液化的面积来估算 菌落浓度。
结果的表述
• 菌落总数的计算方法和报告规则同第一法。
菌落计算－例子
1:100（第一稀释度） 232，244 1:1000（第二稀释度）38，35
N
C (n1 0.1n2 )d
232 [2
244 (0 .1
38 2 )]
10
35
2
549 2 .2 10
2
24909
25000
N
C1 n1
d1
C n2
2
d2
2
C 1 10 n1
• 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL磷酸盐缓冲 稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻 璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
操作步骤——样品稀释
• 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管 壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸 头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸 管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
结果的表述——菌落总数的报告
• 菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效 数字报告。
• 大于或等于100时，前第3位数字采用“四舍五入”原则修约后 ，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指 数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有 效数字。
• 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 • 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。 • 称重取样以cfu/g为单位报告，体积取样以cfu/mL为单位报告。
操作步骤——接种
• 根据对样本污染状况的估计，选择2～3个适宜稀 释度的样品匀液进行检验。将测试片置于平坦实 验台表面，揭开上层膜，用吸管或微量移液器吸 取1mL样品匀液，垂直滴加在测试片的中央，将上 层膜盖下，允许上层膜直接落下，但不要滚动上 层膜，将压板（凹面底朝下）放置在上层膜中央 ，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养膜 上，切勿扭转压板。拿起压板，静置至少1分钟以 使培养基凝固。每个稀释度接种两张测试片。
• 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应 以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状 菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀， 即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
• 平板内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界线)，则应 将每条链（不同来源）作为一个菌落计。
菌落计数
• 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释 倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（ colony-forming units，cfu）表示。
• 选取菌落数在30cfu～300cfu之间、无蔓延菌落生长的平 板计数菌落总数。低于30cfu的平板记录具体菌落数，大 于300cfu的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采 用两个平板的平均数。
结果的表述——菌落总数的计算方 法
• 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落 数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）中菌落总数 结果。
• 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式计算。 • 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300，则对稀释度最高的平板进行计
营养琼脂（NA)
蛋白胨 牛肉膏 氯化钠 琼脂 蒸馏水
10.0g 3.0g 5.0g 15.0g 1000mL
培养基改变依据
• 国外食品微生物权威的检测方法如ISO、AOAC和 FDA/BAM等基本上都是采用平板计数琼脂或在平板 计数琼脂的基础上进行了改良；
• 针对能力验证菌落总数的样品，采用两种培养基，结 果无显著性差异；
∑C =平板菌落数之和 n1 = 含合适范围菌落数的第一稀释度（低）平板数 n2 =含合适范围菌落数的第二稀释度（高）平板数
d = 第一稀释度（低）
菌落计算公式
1:100（第一稀释度） 232，244 1:1000（第二稀释度）33，35
N
C (n10.1n2)d
23 224 34 3 35 544 [2(0.12) ]1 2 02.2 1 2 024 7 22 57 000
第二法 菌落总数PetrifilmTM测试片法
检验程序
• 除将平板计数琼脂培养基改成PetrifilmTM 菌落总数测试片外，其它与检验程序同第 一法。
操作步骤——样品的稀释
• 1:10的样品匀液制备后，用1mol/L NaOH或 1 mol/L HCl调节pH至6.6～7.2。
• 其他步骤同第一法
食品微生物学检验 菌落总数培训 （GB/T4789.2）
内容
一、立项修订依据 二、主要修订内容 三、检验程序 四、第一法 五、第二法
一 立项修订依据
• 修订的背景
– 标准清理 – 多年未进行修订
• 修订的意义（紧迫性）
– WTO的要求 – 原标准的局限（培养基、计数方式等） – 3M纸片法
• 菌落总数的卫生学意义
FROZEN PREPARED MEAT, POULTRY AND PASTEURIZED EGG PRODUCTS • ISO 4833:1991 Microbiology -- General guidance for the
enumeration of micro-organisms -- Colony count technique at 30 degrees C • ISO 6610:1992 Milk and milk products-Enumeration Colonyforming units of micro-organisms-Colony-count technique at 30℃ • NMKL APHA CCFRA JAPAN HPB
数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计 算。
• 若所有稀释度的平板菌落数均小于30，则应按体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以 最低稀释倍数计算。
• 若所有稀释度的平板菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300或小 于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
n2
C
2
d 1
2
232
244 380 4 10 2
350
1206 4 10 2 30150 30000
统计学依据：
– 平板菌落数越多，结果越具有代表性； （不考虑稀释倍数和培养基的营养状况等）
– 取样量越大，结果越具有代表性； （同等取样条件、排除其他方面的干扰因素）
两个相邻的稀释度平板菌落数直接相加，不考 虑稀释倍数的影响，采用加权平均值代替简单的 算术平均值
修订依据（修订的主要参考方法）
• FDA/BAM Chapter 3 Aerobic Plate Count Jan. 2001 • SN 0168-92 出口食品平板菌落计数 • AOAC 986.32 Aerobic Plate Count in Foods • AOAC 988.18 Aerobic Plate Count • AOAC 990.12 Aerobic Plate Count in Foods • USDA/FSIS MLG CHAPTER 3 EXAMINATION OF FRESH, REFRIGERATED AND
4、其他内容
—菌落形成单位的定义 —菌落总数的英文 —培养温度和时间
36℃±1℃培养48h±2h。水产品30℃±1℃培养72h±3h
—微量移液器 —天平
三 检验程序
检样 25g(mL)样品+ 225mL稀释液，均质
10倍系列稀释
选择2～3个适宜样品匀液， 各取1mL分别加入无菌培养皿内
每皿中加入15mL～20mL 平板计数琼脂培养基，混匀
二、修订的主要内容
——培养基由营养琼脂改为平板计数琼脂 ——添加了PetrifilmTM 细菌总数检验测试片法 ——菌落计数公式进行了修改 ——添加了拍打式均质器或等效的设备 —— ………
1、培养基改变情况
平板计数琼脂 （PCA)
胰蛋白胨 酵母浸膏 葡萄糖 琼脂 蒸馏水
5.0g 2.5g 1.0g 15.0g 1000mL
象； 3、准确计数，有方格，尤其是数目较多时，两个人分别计数同一纸片时差异； 4、菌落分布特别均匀； 5、平行平板菌落结果一致性比较好，与避免了热损伤有关； 6、菌落蔓延或半透明菌膜现象很少发生； 7、安全方面不像玻璃平皿易碎、对人员造成潜在的伤害，另外密封比较好，不容易直
接接触菌落。 缺点： 1、某些有红色颗粒的样品，需要注意；粘稠的液体样品，不易分散开；表面活性比较
• 及时将15mL～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基 (可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿， 并转动平皿使其混合均匀。
操作步骤——培养
• 琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h 。水产品30℃±1℃培养72h±3h。
• 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的 菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培 养基（约4mL），凝固后翻转平板，按上述条件进 行培养。