水蛭素基因植物表达载体的构建

水蛭素生物合成通路
水蛭素是凝血酶最强的特异抑制剂，具有促进血管生成、抗坏死的作用，在治疗血栓疾病方面具有广阔的前景。

水蛭素的生物合成通路大致如下：
1. 通过递归PCR，根据医用水蛭（Hirudo medicinalis）头部水蛭素（HV-2）的氨基酸序列，合成水蛭素基因。

2. 将水蛭素基因重组到大肠杆菌分泌型表达载体pIN-ompA-HI中，使其编码序列直接位于大肠杆菌外膜蛋白A信号肽序列的下游。

3. 转化大肠杆菌DH 5α，筛选出重组体，通过PCR、限制酶切图谱和序列分析，确保合成的水蛭素基因与设计完全一致。

4. 在大肠杆菌中表达水蛭素基因，重组水蛭素（rHV-2）被分泌到细胞周质及培养基中。

通过上述通路，成功表达出水蛭素，并证明其具有明显抗凝血酶生物活性。

水蛭素的成功合成，为血栓疾病的治疗提供了新的思路和方法。

水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达龙铟;刘家云;刘莉;王宗仁【期刊名称】《第四军医大学学报》【年(卷),期】2006(027)008【摘要】目的:构建水蛭素毕赤酵母表达载体,获得重组蛋白在毕赤酵母中的分泌型表达. 方法: 通过PCR扩增获得水蛭素HV2, HV2-N47K基因,将序列正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,构建表达质粒pPIC9K-HV2, pPIC9K-HV2-N47K. 重组质粒转化宿主菌GSM1168,G418抗性筛选高拷贝的稳定表达菌株,经甲醇诱导表达并对表达产物进行鉴定. 结果: 成功构建了水蛭素毕赤酵母表达载体,获得水蛭素在毕赤酵母中的分泌型表达,表达产物具有抗凝血酶活性. 结论: 水蛭素在毕赤酵母中获得分泌型表达,为研究新药奠定了基础.【总页数】4页(P673-676)【作者】龙铟;刘家云;刘莉;王宗仁【作者单位】第四军医大学,西京医院中医科,陕西,西安,710033;第四军医大学,西京医院检验科,陕西,西安,710033;第四军医大学,药学系药理学教研室,陕西,西安,710033;第四军医大学,西京医院中医科,陕西,西安,710033【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达 [J], 马精彩;曹晓娜;熊蔚俐;李敬华;左爱军;孙蓓;梁东春2.人组织型纤溶酶原激活剂-水蛭素融合基因的构建及其在毕赤酵母中的表达 [J], 于爱平;石炳兴;董春娜;蒋中华;吴祖泽3.葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高效分泌表达 [J], 魏东升;段广东;钱江潮4.人骨保护素在毕赤酵母中的分泌表达及表达产物的生物活性分析(英文) [J], 刘继中;陈苏民;李毅;胡蕴玉;纪宗玲;杨彤涛5.水蛭素基因的递归PCR合成和在大肠杆菌中的表达与分泌 [J], 毕群;黄仪秀;朱圣庚因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

三种水蛭全基因组精细图谱构建及其抗凝血机制演化研究水蛭(Leech)俗称蚂蟥,是环节动物门蛭纲动物的统称。

营外寄生生活,短暂寄生于鱼类、爬行类、哺乳类的体表,吸血为食;或取食软体动物。

其中吸血种类因在吸血过程中产生高效的抗凝血活性物质而被中、西医广泛应用于临床治疗血栓性疾病。

除水蛭素外,有多种抗凝血活性物质被报道。

但这些抗凝血活性物质的合成途径及其在水蛭演化中的形成过程并不清楚。

基因组包含了一个物种全部的遗传信息,是生物生命活动和演化研究的基础。

完整的基因组常被称为全基因组图谱,包括一个物种的全部基因序列,以及这些基因的数量、位置、功能,相互关联关系等信息。

构建物种的全基因图谱不仅能为研究基因的表达机理及演化模式奠定基础,而且通过将这些基因信息与其它物种的基因组进行比较基因组研究,能够揭示生物物种形成和生理机能演化的途径和机制。

但由于目前测序技术成本很高,图谱构建与分析都具有一定难度等原因,只有少数模式生物及与人类密切相关的生物进行了全基因组测序。

在水蛭中仅有分布于美国,取食软体动物的泽蛭(Helobdella robusta)的全基因组被报道。

中国药典收录的三种医用水蛭:日本医蛭(Hirudo nipponica),宽体金线蛭(Whitmania pigra),菲牛蛭(Hirudinaria manillensis)都没有基因组数据。

对这些物种进行全基因组图谱构建与比较基因组分析,将有助于发现新的抗凝血物质、阐述其作用机制,同时可以探讨水蛭吸血习性的形成过程,为进化生物学和医学发展提供数据。

本研究应用了目前先进的三代长片段Pacbio sequel测序技术,二代Illumina测序技术获得DNA与RNA数据,对日本医蛭、宽体金线蛭、以及菲牛蛭的基因组进行组装、注释,及比较基因组分析。

研究结果如下:1、水蛭基因组数据获取、组装和注释本研究使用二代short-read Illumina测序分别获取了日本医蛭、宽体金线蛭、菲牛蛭12.43 Gb、12.34Gb、12.23Gb DNA序列数据,基于k-mer分布估测了基因组大小及杂合度。

水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂表达载体的构建与表达（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的：构建水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂（leech derived tryptase inhibitor,LDTI）原核表达载体,并在大肠埃希菌［BL21(DE3)］中高效表达重组蛋白。

方法：以含有目的核酸序列的质粒为模板，通过PCR技术扩增出LDTI蛋白编码序列，构建含目的片段的T克隆载体以及原核表达载体pET28a LDTI重组质粒亚克隆，进行限制性内切酶双酶切鉴定和核酸序列分析，然后将该质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导，以Tricine SDS PAGE和蛋白质印迹方法分析和鉴定重组蛋白的表达。

结果：成功构建了水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂原核表达载体pET28a LDTI，并获得相应的融合蛋白；本实验证明， LDTI在大肠埃希菌工程菌中高效表达，在温度为33℃，IPTG浓度为0.7 mmol，诱导时间为1 h，所表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的15%左右。

结论：成功构建了LDTI原核表达载体并使其在原核系统中高效表达，为进一步研究水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂的生化特性和生物学功能奠定了良好的基础。

【关键词】构建；原核表达；水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂［Abstract］Objective: To construct the prokaryotic expression vector of LDTI gene and express LDTI protein in E.coli［BL21(DE3)］.Methods： A 141 bp fragment of the LDTI gene was amplified by PCR technique from the template of the plasmid containing LDTI gene, then it was cloned into T vector.After amplified and digested with restricted enzyme, the target fragment was subcloned into plasmid pET28a, the recombinant plasmid was transferred into E.coli Jm109.The fragment was identified by restricted enzyme and nucleotide sequencing.The recombinant expression plasmid containing LDTI gene was transformed into E.coli BL21(DE3) and the target protein expression was induced by isopropyl B D thiogalactopyranoside(IPTG) and confirmed by Tricine SDS PAGE and Western blot. Results：The recombinant plasmid of pET28a LDTI was obtained by PCR and identified by sequencing.The target protein was expressed abundantly in E.coli BL21(DE3) and the yield of LDTI protein was accounted for approximately 15% of germ proteins after one hour′s induction by 0.7 mmol/L IPTG at 33℃. Conclusion：pET28a LDTI was successfully constructed and can highly express objective protein in BL21(DE3), which will further help to the bioactivity of LDTI studying.［Key words］ construction; prokaryotic expression; leech derived tryptase inhibitor类胰蛋白酶抑制剂（tryptase inhibitor,TPI）属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，具有稳定肥大细胞的作用［1］，对于肥大细胞介导的变态反应性疾病如哮喘、变应性鼻炎等有潜在的治疗作用。

湖北生物科技职业学院学生毕业论文论文题目：应用DNA改组技术构建水蛭素突变体库系别：生物工程系专业：生物技术及应用年级：0510 姓名：宁晓微学号：0501011018 指导老师：艾炎军2007年11月18日摘要水蛭索是水蛭中抗凝血蛋白质的一种，它对凝血酶有强烈抑制作用：水蛭索的三维构象与水蛭中作用于血小板糖蛋白Ⅱb—Ⅲ a的拈抗剂decorsin十分相似，而该拮抗剂是以RGD保守序列作为识别序列的。

本文试图通过水蛭素定向进化获得既抑制凝血酶又抑制血小板凝集的双功能抗凝剂。

因此，本文运用DNA改组技术，在重组反应中掺入含RGD基序的化学合成的寡聚核苷酸，得到水蛭素各种变异体基因，然后将此突变体基因片段插入噬菌质粒pCANTAB 5\ G8，转化大肠杆菌，建立水蛭索突变体噬菌体表面展示库。

建库后，分别用凝血酶和血小板对这个库进行亲和淘选，初步结果显示，在实验定向进化中可看出选出的突变体抗凝血酶活性与血小板结合能力都随着淘选而提高。

并且当一种选择压力消失时，在该压力下选择出的某性状也会随之减弱。

因此，在适宜选择条件下有希望从突变体库中选择出既抑制凝血酶又与血小板有结台能力的双功能水蛭素突变基因。

进一步的淘选工作和DNA测序鉴定工作正在进行中。

、关键词：水蛭素；DNA改组；亲和淘选。

目录摘要 (1)目录 (2)引言 (3)1材料和方法 (5)1.1材料 (5)1.1.1试剂和菌种 (5)1.1.2器材 (6)1.2方法 (6)1.2.1改组联合随机片段的插入 (6)1.2.2 pCANTAB 5V G8／HIndⅢ,BamHI大片段与水蛭素基因的连接 (8)1.2.3 构建水蛭素突变体库 (9)结论 (12)致谢 (15)参考文献 (16)引言水蛭是我国的传统中药，早在1800年前的《神农本草经>中就有记载。

中医认为水蛭有破血、逐瘀、通经等功效。

1884年Havcraft发现医用水蛭的提取物中含有抗凝血的物质。

专利名称：表达水蛭素的过继免疫细胞及其制备方法和用途专利类型：发明专利
发明人：何向锋,张锦林,施文
申请号：CN201710357861.9
申请日：20170519
公开号：CN107083366A
公开日：
20170822
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种表达水蛭素的过继免疫细胞及其制备方法和用途，过继免疫细胞为人源免疫细胞，过继免疫细胞表达的重组水蛭素包括信号肽和水蛭素。

重组水蛭素的氨基末端连接上人源分泌表达信号肽，将其编码基因利用基因工程技术转染过继免疫细胞，回输患者后，在患者体内持续稳定表达重组水蛭素，发挥“微型细胞药厂”的作用。

如此，通过过继免疫细胞作为载体细胞，可在体内长期稳定表达重组水蛭素，有效解决水蛭素对制备纯度要求较高、半衰期短、经常注射患者依从性差等弊端。

申请人：何向锋
地址：226000 江苏省南通市崇川区晨苑小区7栋205
国籍：CN
代理机构：北京商专永信知识产权代理事务所(普通合伙)
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利用基因工程菌生产抗凝药物水蛭素工艺技术水蛭素(hirudin)是水蛭（Leech）及其唾液腺中已提取出多种活性成分中活性最显著并且研究得最多的一种成分，它是由65—66个氨基酸组成的小分子蛋白质(多肽)。

水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药物，它可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和弥漫性血管凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程。

在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。

研究还表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。

它能阻止肿瘤细胞的转移，已证明有疗效的肿瘤如纤维肉瘤，骨肉瘤，血管肉瘤，黑素瘤和白血病等。

水蛭素还可配合化学治疗和放射治疗，由于促进肿瘤中的血流而增强疗效。

在医药市场上，抗栓药物的需求与日俱增，但由于天然水蛭来源有限，各国医药界都将注意力集中在重组水蛭素的开发上。

美国、法国、瑞士、德国、英国、日本十多家生物技术公司和医院都在临床应用或研究重组水蛭素类多肽抗栓药物治疗血栓疾病的范围和疗效。

1998年底，德国首先上市重组水蛭素药物。

1999年英国也获批准上市。

目前己注册的国家有欧洲、美国、澳大利亚、新西兰、南非等十多个国家。

中国具有心血管疾病药物和肿瘤药物的巨大市场，水蛭素又是传统中药，因此重组水蛭素开发前景十分看好。

据估计，我国目前血栓病人约有2000万人，如果其中l00万人采用水蛭素治疗，每年共需300—500公斤。

国际上常用肝素作为抗凝药物，这类抗凝药物的使用已有60多年历史，需用量逐年增加。

美国70年代每年就有1000万病人使用肝素，大部分是手术后预防血栓的形成。

仅美国肝素的年用量就超过9000亿单位，约相当于6吨。

研究表明，水蛭素素在许多性能上都优于肝素，它用药量小，不引起出血，也不依赖于内源性辅助因子。

随着临床研究的广泛开展，重组水蛭素的应用范围不断拓宽，它的需求也会日益增大。