第23卷 第5期Vol.23 No.5平 原 大 学 学 报J OU RNAL OF PIN GYUAN UN IV ERSIT Y2006年10月 Oct.2006多糖结构的研究方法及其活性的研究进展3丰贵鹏(平原大学化学与环境工程学院,河南新乡453003)摘 要:综述多糖研究的经典方法和新技术的应用情况,以及5年来其活性的研究进展状况。
关键词:多糖结构;多糖活性;抗肿瘤活性;抗氧化活性中图分类号:Q539 文献标识码:A 文章编号:1008-3944(2006)05-0128-03 多糖作为天然大分子物质同核酸、蛋白质一样是所有生命有机体的重要组成部分,在高等动物、植物、藻类以及菌类中均有存在,是自然界含量最丰富的生物聚合物,与维持生命所需的多种生理功能密切相关。
就多糖的研究状况而言,虽然已经取得了巨大进展,但与核酸和蛋白质的飞跃发展相比,显得远远落伍。
[1]近年来,生物学、化学等学科的研究飞速发展,对多糖及其复合物的化学结构和生物活性的研究也越来越深入。
[2]一、结构研究(一)经典方法紫外分光光度法、纸层析和Sep hadex 凝胶柱层析:在实验室常采用硫酸苯酚法和蒽酮硫酸法测定多糖的总含量及其纯度,其中硫酸苯酚法尤为常用。
此外,可以利用紫外分光光度计在280nm 和260nm 处有无吸收来判断多糖样品是否含有蛋白质和DNA 。
因此,紫外分光光度法在多糖结构研究中被广泛应用。
闫吉昌、崔春月、张奕等[3]用纸层析和Sep hadex 凝胶柱层析分析以库拉索芦荟为材料,经热水抽提,乙醇分级沉淀,酶法和seveg 法去除蛋白质后得到的2种酸性多糖PSA1和PSA2,证实其均为单一组分。
甲醇解、气相层析质谱(GC/MS )、高效液相色谱(HPL C )、薄层层析:多糖的甲醇解是分析多糖组分的常用方法,GC/MS 常用于单糖的分离和鉴定。
佘志刚、胡谷平、吴耀文等[4]用改进的甲醇解方法从鲍鱼中分离出一种鲍鱼多糖HalA ,甲醇解后的产物经三甲硅醚衍生,进行GC/MS 分析,确定鲍鱼多糖HalA 主要由萄萄糖、半乳糖、甘露糖,以及少量木糖、岩藻糖和半乳糖醛酸组成。
闫吉昌、崔春月、张奕等[3]用薄层层析和乙酰化GC/MS 分析库拉索芦荟中的多糖PSA1,发现其是由甘露糖和葡萄糖组成,摩尔比为1∶1.3;多糖PSA2主要由甘露糖组成。
孟庆勇、刘志辉、徐美奕等[5]用薄层层析分析从半叶马尾藻中用热水浸提法获得的半叶马尾藻多糖,发现其组成可能为木聚糖。
丁琼、张俐娜[6]等用GC/MS 、H PL C 方法分析茯苓菌丝体中的多糖,从中提取出4种多糖组分,编号分别为PCM1、PCM2、PCM3和PCM4。
PCM1、PCM2为酸性杂多糖由D —鼠李糖、D —木糖、D —甘露糖、D —半乳糖、D —葡萄糖及葡萄糖醛酸组成。
PCM3主要为线型β(1→3)—D —葡聚糖,PCM4由D —葡萄糖和葡萄糖醛酸组成。
红外光谱、核磁共振(NMR ):红外光谱是分析多糖结构的强有力的工具,可以判别多糖的特征吸收峰。
例如:利用890cm -1吸收峰来判别β-糖苷键的存在,840cm -1吸收峰来判别α-糖苷键的存在,吡喃糖苷在1100～1010cm -1间应有3个吸收峰,而呋喃糖苷在相应区域只有2个吸收峰,810cm -1和870cm -1是甘露糖的吸收峰,1260cm -1和1730cm -1是酯基或O -乙酰基的特征。
此外,利用红外光谱在3500cm -1处有无吸收常用来判断甲基・821・3收稿日期:2005-12-23 修回日期:2006-06-26作者简介:丰贵鹏(1982-),男,河南新乡人,主要从事生物化工方面的教学与研究。
化反应是否完全。
核磁共振常用来解决多糖结构中糖苷键的构型,以及重复结构中单糖的数目,500或600m HZ的高分辨1H-NMR能准确测定结构表征基团的位移和峰宽。
带有微型计算机的傅立叶转换的应用使那些丰度较低的BC13、15N得到满意的NMR图谱。
此外,2D-NMR和13C、15N、31P的NMR数据对糖链一级结构的分析是必不可少的。
对于N-连接的糖链,完备的1D-NMR数据库已经建立,并已成功应用于糖肽和糖蛋白上N-糖链的结构的分析。
13C NMR谱较1H NMR更具有实用性。
13C NMR的δ可达200pp m以上,讯号清晰。
[7](二)新技术的应用高场核磁共振波谱:高场核磁共振技术在多糖共价结构,及其在溶液中或固体状态下的构象和动力学特征的研究方面都是最强有力的工具。
特别是对于经典方法难以阐述的多糖,高场核磁共振技术可以在有或没有背景知识的情况下获得糖类化合物最完全的结构信息及其在溶液或固态的行为,同时还可通过计算机把样品中的1H和13C NMR谱数据和数据库信息进行比较来确定糖类化合物的结构,从而取代耗时又耗样的经典分析方法。
[8]毛细管电泳:用毛细管电泳分析糖类物质是在20世纪90年代发展起来的,它是利用带电粒子在高压电场中不同组分的迁移率不同而达到分离目的的一种新技术。
其检测方式有紫外可见检测,激光诱导荧光检测,电化学检测等。
[9]目前毛细管电泳对糖的分析集中在单糖和寡糖的分离分析方面。
而对多糖的分析主要是建立在对单糖、寡糖毛细管电泳的基础上,先用酶解和化学水解使糖链分解为单糖、寡糖,再对其进行分离分析。
因此,对多糖的分析主要是对其所含糖原的分析。
[10]原子力显微镜:由于多糖分子多带有支链,具有分子不均一性和非线性,故原子力显微镜对多糖成像分辨率较差。
原子力显微镜主要用于多糖的以下几个方面的研究:(1)观察多糖分子的高级结构;(2)研究多糖凝胶网格结构;(3)直接观察以纤维素微纤维素为主体的植物细胞壁。
二、活性研究(一)抗肿瘤活性张连茹、陈喀林、李妮等[11]从中药二色补血草中分离提取到一种水溶性多糖(L P),用M T T实验测定其抑制肿瘤细胞活性,L P对Hela细胞抑制的IC50为0.0622mg/mL。
廖建民、沈自龙等[12]对从海带中分离得到3种多糖I、II、III进行抗肿瘤实验。
100mg/mL.d注射含Hep s瘤株的小鼠10d,结果显示多糖I、II有轻微的抑制Hep s瘤株的生长作用,而多糖III的抑瘤率高达61.15%。
(二)抗氧化活性1.体内实验谈锋、邓君[13]以果蝇为动物模型研究了从苋科植物牛膝根中分离得到的4个水溶性牛膝多糖组分Con.1、Con.2、Con.3和Con.4的抗衰老作用。
结果表明,Con.2、Con.3和Con.4三个小分子量组分在培养基中浓度为2mg/g和5mg/g(多糖质量/培养基质量)时,都可显著或极显著地使果蝇平均体重增加3.85%～5.47%,并使果蝇平均寿命延长2.61%～3.16%。
王雁、杨祥良等[14]对来自虎奶菌菌核羧甲基化修饰的虎奶多糖进行抗氧化研究表明,虎奶多糖能有效抑制Fe2+-V it C引起的大鼠肝线粒体脂质过氧化、膜流动性的降低和线粒体的肿胀,清除连苯三酚自氧化产生的超氧自由基O2-并呈一定的剂量———效应关系。
2.体外实验钦传光、周军等[15]采用化学发光法和分光光度法在多种化学模拟体系中研究了泥鳅多糖清除活性氧的作用,结果显示泥鳅多糖对超氧阴离子的清除作用有明显的量效关系,在1.00×10-5mg/mL～1.00×10-2mg/mL范围内,随着泥鳅多糖浓度的增加,发光强度的峰值(CL)随之下降。
泥鳅多糖对连苯三酚自氧化速率的抑制作用呈一定的量效关系,在0.0mg/mL～0.1mg/mL范围内呈浓度依赖性。
陈海霞、张敏等[16]报道一种分离自绿茶的茶多糖缀合物对羟自由基、过氧化自由基和脂过氧化反应抑制的IC50分别是0.101mg/mL、0.145mg/mL和0.238mg/mL,并且对超氧化物歧化酶有一定的激活作用。
王展、方积年[17]用浓度为0.45mg/mL的酸性菟丝子多糖H2,使大鼠成嗜铬细胞瘤PC12神经细胞在H2O2存在下的存活率提高了2倍。
三、其他方面的研究任德成、杜冠华等[18]报道了硫酸多糖916对中性粒细胞-内皮细胞的粘附作用,硫酸多糖916 (0.01mg/mL～1.0mg/mL)剂量依赖性地抑制TN Fα对HUV EC的粘附作用。
佘志刚、胡谷平等[19]采用热重、热重-红外谱联用以及差示扫描量热法对鲍鱼多糖进行热分析。
鲍鱼多糖在空气和氮气氛中,230℃～340℃之间发生剧烈的分解反应。
・921・氮气氛中,是吸热的分解过程;而空气氛中,是放热氧化反应,并且在453℃左右,有另一个急剧的氧化裂解过程。
四、结语多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等生物活性,并且多糖的生物功能与其结构密切相关。
多糖的生物学活性与其高级结构的关系尚不十分清楚,但高级结构比一级结构在活性方面起更大的作用,对于这一观点的认识则是一致的。
有些多糖虽具有相同的一级结构,但活性相差很大,这主要是高级结构的不同引起的。
因此,探索用更有力的方法研究多糖的高级结构,利用多糖的高级结构模型与生命细胞受体模型推断多糖的作用方式,可为活性多糖的筛选和改造多糖更具有生物活性提供必须的理论基础。
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