实验柱层析和薄层层析

柱层析

极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统

极性较大的用甲醇：氯仿系统

极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统

拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸

硅胶柱层析

下面介绍我现在惯用的方法：匀浆法。

1。称量。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。

2。搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。

3。装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚（氯仿），装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。

4。压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。

5。上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。

6。过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收集的例子：10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶（200-300目），20-50ml收一馏分。

7。检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。

8。送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。

柱层析和薄层层析实验报告

篇一：柱层析实验报告 柱层析分离色素

一、【实验目的】

1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。

2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。

二、【实验原理】

叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、 胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。利

用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。 分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。柱层析法是色谱法中的一种，它是根据

混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分

离。常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。 吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面

积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液

流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。由于不同化合

物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速

度下移，形成色带。继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过

程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。 本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚

提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附

柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行

洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。

三、【实验材料】

原料：

新鲜的菠菜叶

试剂 ：

1． 无水乙醇或95%乙醇 5.三氧化二铝

2． 石英砂 6．饱和氯化钠溶液 3． 丙酮7.水硫酸钠 4． 石油醚（60-90℃） 8洗脱液：丙酮：石油醚＝1：9 器材 ：层析柱（1×30cm）， 研钵， 蒸馏装置， 脱脂棉， 天平， 烧杯，过滤漏斗，玻璃棒， 锥形瓶， 分液漏斗， 试管 ，铁架台

柱层析分离步骤

1. 取样

拿到样品后用毛细管蘸取少量的样品放入离心管中,加入相应的溶剂将样品溶解，标号后作为对照。

2. 跑板

将取出的样品与要分离的样品点在同一块硅胶板上进行跑板，确定第几个点是将要分离出来的样品.

3. 装柱

将少量的棉花（棉花太少会露出硅胶,太多过滤的较慢）塞入柱子低端防治硅胶露出，配制硅胶溶剂时浓度应适当（浓度过大易造成干柱，溶度过小会大量浪费溶剂），将硅胶装入柱子直径的15—20倍高即可（柱子过高浪费时间且没有必要，柱子过低会造成物质没有分离开就应经被洗下）。

倒入一定量的硅胶之后将硅胶压实,然后将溶液压至和硅胶面向近处，重复加入硅胶到达预定的高度，然后加入一定量的无水硫酸钠（作用是防治在加样时将硅胶面冲的变形)，然后用手稍微弹动柱子将无水硫酸钠弹平,在溶剂将柱内壁的硅胶及无水硫酸钠洗净。

4. 加样

将样品用溶剂溶解后加入柱内(加入溶液时从中间像外圈旋转滴加，不要将柱面冲出坑)，并用溶剂反复洗瓶子3遍左右(洗瓶子时将溶剂沿磨砂口加但不能碰到瓶内壁，否则会污染试剂）,将洗后的液体转移至柱子内。

5. 过柱

先用滴管沿柱内壁加入溶液，溶液到达一定高度后再将配制的溶液倒入到柱子上面的球型漏斗内，加压，先用锥形瓶接取前面柱内的溶剂，然后当溶液到达一定的高度时开始用试管接，然后不断的检验试管中是否有样品洗出，当从有样品洗出到没有时,第一个样品就被完全洗出,跳跃的点一定数量的点，然后进行跑板，确定没有自己要分离的样品后就可以倒掉，继续洗柱子.换取极性稍大的溶剂，分离到第二个样品后同第一个做同样的处理，直至得到自己要的样品。

6. 旋干

将的的样品转移至圆底瓶中旋干，在将样品瓶安装好后，先打开冷凝系统和加热系统,然后打开旋转和抽气，缓慢关闭活塞，此时不停的观察是否有气泡，若有气泡应放入一定气体，然后缓慢关闭直至没有气泡，旋干后用油泵抽气（油泵的真空度比选转蒸发仪的真空度更大,能抽的更干）然后放入称量过质量的小瓶中，封口后放入冰箱内保存。

薄层色谱和柱层析

一、薄层色谱（TLC）

1.原理：

薄层色谱是一种基于分子在固体表面和流动相之间相互作用的分离技术。它使用薄层固定在玻璃或铝板上的吸附剂（例如硅胶或氧化铝）来分离混合物中的化合物。在色谱板上涂覆样品后，通过液态或气态的流动相让混合物成分在吸附剂上移动，不同化合物的移动速度不同，从而实现分离。

2.应用：

薄层色谱被广泛应用于药物化学、食品科学、环境科学和生命科学等领域。它通常用于混合物的分析，确定混合物中是否存在特定化合物。此外，它也可用于纯化样品中的化合物，通过可视化或其他检测方法来定位目标化合物位置。

3.操作步骤：

薄层色谱的操作步骤主要包括：

（1）准备色谱板：将吸附剂均匀涂覆在固定的玻璃或铝板上，使其成为薄层。

（2）样品的涂覆：将待分离的混合物溶解在适当的溶剂中，并用微量移液管将样品均匀地涂覆在色谱板上。

（3）开展分离：将涂覆了样品的色谱板悬挂在色谱槽中，加入合适的溶剂溶液，使之满足色谱板的一端。 （4）显色：在色谱板完全干燥后，通过目视或化学法将化合物可视化。常用的显色剂包括碘、紫外线灯或化学染色剂。

二、柱层析（CC）

1.原理：

柱层析是一种基于分子在固定填料（固相）和流动相之间相互作用的分离技术。根据样品的特性选择不同的固相材料，并将其装填在柱中。当样品通过柱时，不同化合物与固相发生不同程度的相互作用，从而分离。

2.应用：

柱层析广泛应用于化学和生物化学领域，用于分离和纯化化合物。它可用于药物合成中的纯度检查、食品中毒素的分离、蛋白质的纯化等。柱层析的分离效果通常较好，纯度高。

3.操作步骤：

柱层析的操作步骤主要包括：

（1）准备填料和柱子：根据需要选择适当的固相材料，并将其装填在柱子中。

（2）样品的预处理：将待分离的样品预处理，如溶解在适当的溶剂中，并清除杂质。

（3）样品注入：将样品注入柱中，注意控制样品体积和注入速度。

（4）洗脱：通过加入不同组成的洗脱液（流动相），使样品中不同化合物以不同速率从柱中洗脱。