茶多酚的提取

实验名称：普洱茶多酚的提取研究及抗氧化作用的研究

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一. 实验目的

1. 掌握从茶叶或茶叶的下脚料屮提取茶多酚的方法；

2. 学:握用分光光度计测定茶多酚总量的方法；

3. 棠握酒石酸铁比色法测定茶多酚的含帚：

二. 实验原理

产物：茶多酚

物理性质：茶多酚在常温下呈浅黄或浅绿色粉末.易溶于温水(40°C — 80°C) 和含水乙醇中；稳定性极强，在pH值4一8、250°C左右的环境中，1.5个小时内 均能保持稳定，在三价铁离子下易分解。1989年被中国食品添加剂协会列入 GB2760-89食品添加剂使用标准，1997年列为中成药原料。茶多酚是茶叶屮多酚 类物质的总称，为白色无定形粉末，易溶于水。茶多酚具有很好的抗氧化活性, 且抗氧化性优于丁基羟基茴香瞇(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、叔丁基对苯二酚 (TBHQ)等。国内外学者对茶多酚进行了急性毒性、亚急性毒性和各种药理试验研 究，结果表明茶多酚安全无毒。茶多酚不仅是一种新型的天然抗氧化剂，还具有 明显的抗衰老、消除人体过剩的白由基、去脂诚肥、降低血糖、降低血脂利胆固 醇、预防心血管疾病、抑制肿瘤细胞等药理功能，在食品加工、医药、口用化工 等领域具有重要的应用化学性质：茶多酚是从茶叶中提取的全天然抗氧化食品, 具有抗氧化能力强，无毒副作用，无异味等特点。

离子沉淀法提取普洱茶多酚

1.原理

普洱茶是以云南省一定区域内的云南大叶种晒青毛茶为原料，经过后发酵 加工成的散茶和紧压茶，其外形色泽褐红内质汤色红浓明亮，香气独特陈香，滋 味醇厚回甘，叶底褐红⑴.普洱茶具有降血糖、降血脂、杀死癌细胞、抗突变、 防癌等功能［2］・其中具有药理作用的主要成分是茶多酚、茶多糖等.茶多酚有 降血糖、延缓衰老、抑制动脉粥样硬化、防癌抗癌等作用［3］；主题为黄烷醇(儿 茶素)类，儿茶素占60-80%o类物质茶多酚乂称茶糅或茶单宁，是形成茶叶色 香味的主要成份之一，也是茶叶中有保健功能的主要成份之一。研究表明，茶多酚等活性物质具解毒和抗辐射作用，能有效地阻止放射性物质侵入骨箭，并可使 總90和钻60迅速排出体外，被健康及医学界誉为"辐射克星"。

茶多酚是指茶叶中一大类组成复杂、分子量及其结构差异很大的多酚类及 其衍生物混合物，主要由儿茶素、黄酮醇、花色素、酚酸及其缩酚酸等组成的有 机化A物，以儿茶素为主的黄烷醇类化合物占茶多酚总星的60% — 80%,其中含 量最高的几种组分为 L-EGCG(50%-60%)、L-EGC(15%-20%)> L-ECG(10%-15%) 和L-EC(5%-10%)o其结构式如下：

L-EGC: R1=OH R2=H

其他方法:

经收集相关资料发现目前国内外茶多酚粗品的提取的方法主雯有:溶剂萃 取法、离子沉淀法、树脂吸附分离法、超临界流体萃取法、超声波浸提方法、微 波浸提法等等。其中有工业化生产较成熟的有机溶剂萃取法和金属离子盐沉淀法, 以及近年来开始匚业化应用的树脂吸附法。

a. 溶剂萃取法有机溶剂萃取法是较传统的方法，主要是根摒儿茶素易溶于 水、甲醇、乙醇、丙醇和乙酸乙酯等，不溶于氯仿、苯等有机溶剂的特性，利用 茶多酚和茶叶中其他成分在不同溶剂中溶解度的差异进行分离。常用溶剂萃取法 提取制备茶多酚的工艺路线为：茶叶浸提f过滤一滤液浓缩f除杂质f乙酸乙酯 萃取一回收溶剂一干燥一茶多酚产品。传统工艺中常用热水作为浸提溶剂，但是， 随着温度的升高，儿茶素易氧化形成邻醍初级产物，然后继续聚合形成联苯酚醉 类物质，再进一步氧化主成茶色素。对于有机溶剂萃取法，利用酶先对茶叶进行 处理后再用有机溶剂萃取，可使茶多酚损失少，提取率显苦提高。一般來说，茶 叶提取液中还含有纤维素、茶色素、咖啡碱等杂质。去除杂质的方法主要有：用 氯仿去除咖啡碱、石油瞇除色素、低温静止除沉淀等。用柠檬酸等有机酸洗涤茶 叶提取液，可使茶多酚中咖啡碱的含星降至1%左右，但茶多酚损失较多。有机 溶剂萃取法制备茶多酚，工艺己趋成熟，实现了工业化生产，但是，精品的生产 须经反复除杂精制，需要用的有机溶剂量较大。生产中应用的有机溶剂，部分存 在L-EC: R1=H R2=H 回收困难、能耗较大、生产成本较高、有毒性等问题，如工艺处理不当，产品 可能存在有机溶剂的残留。

b. 金属离子沉淀法茶多酚在一定条件下可与某些金属离子络合生成结晶 性沉淀，使其从浸提液中分离出来，与茶叶中的咖啡碱、单糖、氨基酸等组分分 离，从而制备茶多酚。该法制备茶多酚的主要步骤为：茶叶经热水浸提后，调节 pH值，加入沉淀剂形成茶多酚与金属离子的沉淀物，沉淀经酸转溶和乙酸乙酯 萃取，干燥后可得茶多酚产品。常用的沉淀剂有AI3+、Ca2+、Fe2+、Mg2+、 Zn2+、Ba2+等多种离子，其中Zn2+、AI3 +是茶多酚得率较高的弱酸性沉淀剂， 但存在于产品中的AI3+易弓|发老年性痴呆症，故多选用Zn2+为沉淀剂。余兆祥 等采用Zn2+和AI3+的复合沉淀剂提取低档绿茶中的茶多酚，获得了纯度大于96% 的淡黄色茶多酚晶体，提取率为10.4%,较单一沉淀剂高约1%O金属离子沉淀 法制取茶多酚，在茶叶浸提液中加入沉淀剂即可得到茶多酚与金属的结晶性沉淀 物，因而不必浓缩浸提液，可在一定程度上降低能耗：同时，该方法选择性强，

产品纯度较高，无须使用大量的有机溶剂和氯仿等有毒物质，成本低。但是，该 方法盂在碱性条件下进行，再以酸转溶，大量酸碱溶液的利用，导致废液、废渣、 废水处理量大，对环境污染大：此外，茶多酚容易被氧化而损失较大。综合来看， 虽然该方法生产的茶多酚产品中，咖啡碱含星低，但因使用重金属盐作沉淀剂， 产品中重金属离子残留高，而金屈离子有一定的毒性，达不到茂品工业标准，限 制了产品的应用。

c. 柱层析法柱层析法的原理是利用样品中组分在两相之间的分配系数不同, 而达到分离的目的。常采用硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、凝胶、离子交换树 脂和大孔吸附树脂等固态物质作为载体。根据所采用的树脂类型的不同，可分为 吸附柱分离法、离子交换柱分离法和凝胶分离法。该方法的一般工艺流程为：茶 叶浸提一过滤一滤液超滤〜用树脂吸附一乙醇洗脱一回收乙醇一干燥一茶多酚 产品。该方法用于提取茶多酚，工艺简单、能耗较低、安全，有利于实现大规模 生产，以乙醇作为有机溶剂，也有无毒、易回收、残留低、对环境无污染等优点； 选择出适用于分离的树脂材料，具有机械强度好、解吸和再生容易、使用寿命长、 成本低的优点。

以上传统方法均普遍存在一些问题和弊端，产品无法在安全性、价格和纯 度方面全部满足食品添加剂和医药行业的要求。针对这些问题，经有关专家反复 试验、成功地开发出将超临界C02萃収技术与传统提取、浓缩和萃取技术相结 合，制备高纯度茶多酚新匚艺。该工艺既提高了茶多酚的纯度和得率。乂符合工 业化生产对原料、溶剂使用、制作路线、生产过程安全性和产品颜色、产率、纯 度诸方而的要求，有利于茶多酚更有效地在医药和食品工业中应用。下面将简单 介绍一下：

A. 超临界流体萃取法：是一种新型分离技术，在提取茶多酚方面非常有应 用前景。该方法是用介于气体和液体之间的流体作溶剂，在略超过或靠近临界温 度与丿玉力的条件卜进行萃取，压力与温度的细微变化都会弓I起流体密度的大幅度 改变，流体也极易渗透到样品中，使萃取组分通过分配扩散作用而充分溶解，把 某些天然产物组分提取出来，然后再降低载气的床力或提高载气的温度，使其溶 解能力降低，目标提取物将分离出來并与载气分离，从而达到提取的目的。茶多 酚在超临界流体萃取过程中不易氧化，产品纯度很高，稱品经简单精制即可达 95%以上，适用于医药食品添加剂等产品的应用。该方法制备茶多酚的匸艺流程 为：茶叶经超临界流体萃収一茶多酚粗品一纯化一高纯度的茶多酚产品。该技术 的优点在于萃取的速度快、效率髙、溶剂耗量少、无残留，热敏性的化合物在萃 取过程中不会氧化、分解而变质。但是，该法用于提収茶多酚，由于其在超临界 C02中的溶解度仍较小，加入极性改性剂后的一次提取率仍很低，并且固定设

备投入成本高。

B. 超声波浸提法：是依靠超声波的机械粉碎和空化作用，利用液体空穴的 形成、增大和闭合，产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎释放出胞内物。该 法用于提取，具有时间短、温度低、提収率高等优点。现有研究屮用双频复合超 声提取绿茶中的茶多酚，在浓度、提取率和提収速率方而都优于单频超声法。超 声波提取茶多酚的工艺条件，用pH「2的80%乙醇溶液，超声处理40-60min, 产品收率比常规溶剂提取法提高约30%。

C. 微波法该法的基本原理，是利用分子在微波场中发生高频的运动，扩散 速率增大，从而将茶多酚等浸提物在微波的作用下快速浸取出来。利用微波辅助 浸提，可缩短浸提吋间，避免了茶多酚的氧化，有效地保护原料中的活性成分, 效果明显优于单一溶剂法和沉淀法，但制备的茶多酚主要倉EGC、EGCG、ECG等 茶素。

近年來对茶多酚含量测定方法也很多，光度法测定茶多酚常用的有酒石酸 亚铁比色法、近红外光谱法、差式分光光度法、三波长光度法等［4-6］但在实验室 受到各方面的限制，考虑到省时省力，综合利弊，因此我认为还是采取离子沉淀 法较好及酒石酸铁比色法测定提取茶多酚及测量。

考虑实验室条件，已经参考教科书，选取如下方式进行试验：

三.实验步骤： 3. 1仪器与试剂

仪器：电动搅拌器、离心机、pH试纸、真空干燥箱、抽虑瓶、旋转蒸发仪、 真空泵、天平、紫外分光光度计、容量瓶、烧杯、量筒等。

实验试剂及材料：普洱茶茶叶、可溶性金属离子盐、氯化钠、碳酸氢钠、 柠檬酸、硫酸铝、盐酸、亚硫酸氢钠、乙酸乙酯、维生素C （抗坏血酸）、磷酸 氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、酒石酸钾钠、硫酸、绿茶提取物等，均为分析 纯。

3.2普洱茶多酚的提取

査找资料知道影响普洱茶多酚浸提效果的因素顺序为：浸提温度〉乙醇浓度〉 料液比〉浸提时间。即浸提温度和乙醇浓度对浸提效果有显著影响，浸提时间和 料液比差异不显苕。茶多酚浸提的优化条件为：温度80。C,乙醇浓度30%,料 液比1： 30,时间50mino

在最佳条件下完成浸提，过滤后滤液浓缩去乙醇，往浓缩液中加入0. 4mol /L的氯化锌溶液，用碳酸氢钠溶液调节pH至6・0,静置30min,然后离心得 沉淀。溶液用等体枳的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，减斥•浓缩。将浓缩液转 移至蒸发皿在40°C下，进行减压蒸镉，回收乙酸乙酯，最后进行低温真空干燥， 即得茶多酚粗品，称最并计算茶多酚的提取率。

3.3.酒石酸铁比色法测定茶多酚

33.1样品试液的制备

准确称取茶多酚的粗晶体，用少最重蒸水溶解，测定用20ml移液管精确 量取20ml待测样品至100ml定暈瓶中，加入蒸懈水（或RO水）稀释定容至100ml, 充分振荡混匀。

3.3.2于25ml容最瓶内吸収lml稀释液,4ml蒸慵水以及酒石酸铁溶液5ml, 充分混合，再加PH5磷酸盐缓冲稀释至刻度，摇匀。

3.3.3用10mm比色皿，在波长540nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度 （Al）o（试剂空白溶液为：4ml蒸馆水+5ml酒石酸铁溶液+磷酸缓冲液定容至25ml）