第17章细 胞 的 诱 导 分 化

第十二章细胞增殖及其调控一、填空题1.在细胞有丝分裂中, 微管的作用是；微丝的作用是。

2.中心粒是由_________构成的，每个中心体各含有一对互相__________的中心粒，在细胞周期的______________期进行复制。

3.动物细胞的有丝分裂器有、、和四种类型的微管；植物细胞中没有。

4.细胞分裂的方式有、和。

5.细胞周期可分为四个时期即、、和。

6.最重要的人工细胞周期同步化的方法有阻断法和阻断法。

7.2001年诺贝尔医学和生理学奖授予了三位科学家，他们在方面作出了杰出贡献。

8.按照细胞增殖能力不同，可将细胞分为三类即、和。

9.在细胞周期调控中，调控细胞越过G1/S期限制点的CDK与周期蛋白的复合物称为。

10.以培养细胞为材料，通过有丝分裂选择法可以获得M期的细胞，这是因为培养的细胞在M期时。

11.用DNA合成阻断法获得同化细胞时，常用的阻断剂是和。

12.MPF由两个亚单位组成，即和。

当两者结合后表现出蛋白激酶活性，其中为催化亚单位，为调节亚单位。

13.肝细胞和肌细胞属于不同细胞周期类型，肝细胞在受到损伤情况下能进行分裂，而肌细胞却不行，由此可判断肝细胞属于，而肌细胞属于。

14.细胞周期中重要的检验点包括、、和。

15.在减数分裂的前期发生同源染色体的和等位基因的；在有丝分裂后期中，是发生分离，而在减数分裂后期I中则是发生分离。

16.细胞减数分裂中，根据细胞形态的变化可以将前期Ⅰ分为、、、、。

17.细胞完成和全过程称为细胞增殖周期，简称细胞周期。

18.根据增殖状况，可将细胞分为3类，分别为、、。

19.可以选用等DNA合成抑制剂可逆的抑制DNA合成，通过药物诱导实现细胞周期的同步化。

20.用甲氨蝶呤将培养细胞同步化后再用秋水仙素胺短暂处理，可以获得大量的分裂相，显带后将呈现出更多更细的带纹。

21.和动物细胞的细胞周期相比较，植物细胞的细胞周期两个突出的特点是和。

22.所有染色体排列到上，标志着细胞分裂已进入中期。

畜牧兽医学报 2023,54(7):3108-3117A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.07.041开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):I L -17A 基因敲除对氟诱导小鼠肝炎症反应和肝细胞凋亡的影响赵阳飞,于洋欢,王金明,张建海,孙子龙,牛瑞燕,王俊东*(山西农业大学动物医学学院,太谷030801)摘 要:畜禽水和食物中广泛存在的氟严重威胁着畜禽的肝健康和动物性食品的安全㊂为阐明氟致肝损伤的内在机制,明确I L -17A 在氟诱导肝炎症反应和肝细胞凋亡中的调节作用,本研究将24只野生型C 57小鼠和12只I L -17A 基因敲除小鼠随机分为对照组㊁N a F 组㊁K O+N a F 组㊂同时,运用H E 染色观察肝的组织形态变化,并通过E L I S A ㊁流式细胞术㊁免疫组化检测肝中炎症细胞㊁炎症因子㊁凋亡的变化情况㊂结果显示,氟暴露诱导了肝组织结构损伤,增加了肝中炎症因子(T N F -α㊁I L -17A ㊁I N F -γ㊁I L -23㊁T G F -β)㊁M 2型巨噬细胞和树突状细胞的水平,并降低了I L -1β㊁自然杀伤细胞㊁γδT 细胞㊁C D 4+T 细胞水平和C D 4+T 细胞/C D 8+T 细胞比值㊂同时,凋亡检测结果显示,氟暴露增加了肝中凋亡细胞的数量和凋亡关键基因(C y t -c ㊁C a s pa s e 3)的蛋白表达水平㊂然而,与N a F 组相比,K O+N a F 组的肝损伤减轻,肝中炎症因子(T N F α㊁I L -17A ㊁I N F -γ㊁I L -23㊁T G F -β)和树突状细胞含量显著降低,I L -1β表达水平显著升高,且凋亡细胞数量㊁C y t -c 和C a s p a s e 3的蛋白表达水平显著降低㊂综上表明,I L -17A 基因敲除能够缓解氟诱导的炎症反应和肝细胞凋亡㊂本研究为氟中毒性肝损伤的研究和科学防治提供理论依据和新思路㊂关键词:氟中毒;I L -17A ;肝;炎症反应;凋亡中图分类号:S 856.9 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)07-3108-10收稿日期:2022-11-28基金项目:山西省应用基础研究计划(20210302124063)作者简介:赵阳飞(1991-),男,山西阳城人,讲师,博士,主要从事环境兽医学及动物营养代谢病研究,E -m a i l :z y f 91s k y @163.c o m *通信作者:王俊东,主要从事环境兽医学及动物营养代谢病研究,E -m a i l :w a n g jd 53@o u t l o o k .c o m E f fe c t s of I L -17A K n o c k o u t o n F l u o r i d e -I n d u c e d H e pa t i c I n f l a m m a t i o n a n d H e p a t o c y t e A p o pt o s i s Z H A O Y a n g f e i ,Y U Y a n g h u a n ,WA N G J i n m i n g ,Z H A N G J i a n h a i ,S U N Z i l o n g ,N I U R u i ya n ,WA N G J u n d o n g*(C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,S h a n x i A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,T a i gu 030801,C h i n a )A b s t r a c t :T h e f l u o r i d e w i d e l y p r e s e n t i n w a t e r a n d f o o d o f l i v e s t o c k a n d p o u l t r y s e r i o u s l y th r e a t -e n s t h e l i v e r h e a l t h o f l i v e s t o c k a n d p o u l t r y a n d t h e s a f e t y of a n i m a l f o o d .T o e l u c i d a t e t h e i n t e r -n a l m e c h a n i s m o f f l u o r i d e -i n d u c e d l i v e r i n j u r y ,a n d c l a r i f y t h e r eg u l a t o r y ro l e o f I L -17A i n f l u o r -i d e -i n d u c e d l i v e r i n f l a mm a t i o n a n d h e p a t o c y t e a p o p t o s i s ,t h i s s t u d y r a n d o m l y di v i d e d 24w i l d -t y p e C 57m i c e a n d 12I L -17A k n o c k o u t m i c e i n t o c o n t r o l ,N a F ,a n d K O+N a F g r o u ps .I n a d d i -t i o n ,H E s t a i n i n g ,E L I S A ,f l o w c y t o m e t r y ,a n d i mm u n o h i s t o c h e m i s t r y we r e u s e d t o d e t e c t t h e c h a n g e s of m o r p h o l og y ,i n f l a mm a t o r y c e l l s ,i n f l a mm a t o r y f a c t o r s ,a n d a p o pt o s i s i n t h e l i v e r .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t f l u o r i d e e x p o s u r e i n d u c e d l i v e r m o r p h o l o g y d a m a ge ,i n c r e a s e d t h e c o n -t e n t of i n f l a mm a t o r y f a c t o r s (T N F -α,I L -17A ,I N F -γ,I L -23,T G F -β)a n d t h e l e v e l s o f M 2m a c -7期赵阳飞等:I L-17A基因敲除对氟诱导小鼠肝炎症反应和肝细胞凋亡的影响r o p h a g e s a n d d e n d r i t i c c e l l s,d e c r e a s e d t h e l e v e l s o f I L-1β,n a t u r a l k i l l e r c e l l s,γδT c e l l s,C D4+Tc e l l s a nd t he r a t i o of C D4+T c e l l s/C D8+T c e l l s i n t h e l i v e r.I n a d d i t i o n,t h e r e s u l t s o f a p o p t o s i sd e t e c t i o n s h o w e d t h a t f l u o r i d e e x p o s u r e i n c r e a s e d t h e a p o p t o t i c c e l l s a n d t h e p r o t e i n e x p r e s s i o n l e v e l s o f k e y a p o p t o s i s g e n e s C y t-c a n d C a s p a s e3i n t h e l i v e r.H o w e v e r,c o m p a r e d w i t h t h e N a F g r o u p,t h e l i v e r i n j u r y w a s a l l e v i a t e d,t h e c o n t e n t s o f i n f l a mm a t o r y f a c t o r s(I N F-γ,T N F-α, T G F-β,I L-23,I L-17A)a n d d e n d r i t i c c e l l s w e r e s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d,a n d t h e n u m b e r o f a p o p-t o t i c c e l l s a n d t h e p r o t e i n e x p r e s s i o n l e v e l s o f C y t-c a n d C a s p a s e3w e r e s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d i n t h e l i v e r o f K O+N a F g r o u p.I n s u mm a r y,I L-17A k n o c k o u t a l l e v i a t e d f l u o r i d e-i n d u c e d i n f l a m-m a t o r y r e s p o n s e a n d h e p a t o c y t e a p o p t o s i s.T h i s s t u d y p r o v i d e s t h e o r e t i c a l b a s i s a n d n e w i d e a s f o r t h e r e s e a r c h a n d t h e s c i e n t i f i c p r e v e n t i o n/t r e a t m e n t o f f l u o r o t o x i c l i v e r i n j u r y.K e y w o r d s:f l u o r o s i s;I L-17A;l i v e r;i n f l a mm a t o r y r e s p o n s e;a p o p t o s i s*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:WA N G J u n d o n g,E-m a i l:w a n g j d53@o u t l o o k.c o m由于地理因素和环境因素的影响,氟广泛存在于人畜生活的水和食物中㊂长期过量的氟暴露能够导致人畜氟中毒㊂畜禽氟中毒导致繁殖率㊁生产性能㊁使用价值降低,使其成为威胁我国畜牧业发展的潜在因素[1-2]㊂肝作为机体重要的解毒和代谢器官,前期研究氟能够导致肝结构和功能的损伤[3]㊂肝损伤能够导致机体物质代谢紊乱和有害物质的蓄积,进而影响畜禽的生产性能和动物性食品安全㊂因此,深入探究氟致肝损伤的致病机理寻找可能的治疗靶点对于维持畜牧业的可持续发展和动物性食品安全具有重要意义㊂I L-17作为T h17细胞分泌的促炎因子,其家族包含I L17A~F㊂I L-17家族中I L-17A含量最多,且生物活性最强,通常所说的I L-17即I L-17A[4]㊂前期研究发现氟暴露后肝中I L-17A显著升高㊂I L-17A的高表达将导致中性粒细胞的募集和免疫细胞的慢性浸润[5]㊂同时,I L-17A可通过I L-17A受体通路促进细胞因子的产生,导致自身免疫和组织损伤[6]㊂最近的研究发现,I L-17A能够调节多种细胞的凋亡过程[7]㊂凋亡作为清除受损和有害细胞的程序性死亡过程,其与炎症反应密切相关㊂凋亡能够促进炎症病灶受损细胞的清除,而炎症反应过程中产生的炎症因子能够促进凋亡的增加[8-9]㊂然而,炎症反应和凋亡在氟诱导肝损伤中的相互作用关系,及I L-17A在该过程中的调节作用尚不清楚㊂为此,本研究建立I L-17A基因敲除氟中毒小鼠模型,运用H E染色㊁E L I S A㊁流式细胞术㊁免疫组化等技术检测肝的组织形态变化㊁炎症细胞含量㊁炎症因子水平和凋亡情况,进而探究氟对肝炎症反应和凋亡的影响,并明确I L-17A在该过程中的调节作用㊂1材料与方法1.1试验材料C57小鼠和I L-17A基因敲除小鼠购自南模生物有限公司;氟化钠购自S i g m a公司;H E染色试剂盒和B C A蛋白检测试剂盒购自索莱宝科技有限公司;E L I S A试剂盒购自西唐生物科技有限公司;J C-1和A n n e x i n V购自碧云天生物技术研究所;流式细胞抗体购自B D P h a r m i n g e n公司;免疫组化一抗和二抗购自武汉三鹰生物科技有限公司㊂1.2动物模型24只野生型8周龄C57成年雄性小鼠随机分为对照组和N a F组,12只8周龄I L-17A基因敲除雄性小鼠作为K O+N a F组(体重20~25g)㊂对照组饮用去离子水,N a F组和K O+N a F组饮用50m g㊃L-1N a F的去离子水[5]㊂标准实验室条件下按照试验分组饲养12周㊂饲养结束后眼球采血,断颈处死小鼠,收集肝样品㊂1.3H E染色小鼠处死后立即取适量大小肝组织固定于4%多聚甲醛㊂固定后的组织块进行冲洗㊁脱水㊁透明㊁浸蜡㊁包埋㊁切片制成5μm的石蜡切片㊂然后,石蜡切片经过脱蜡至水㊁苏木精(5m i n)和伊红(1 m i n)浸染㊁脱水㊁透明㊁封片㊂最后400倍镜下随机挑选10个区域观察组织中的异常病理变化并记录,并根据记录综合评定每组肝的损伤情况㊂肝的组织形态㊂1.4透射电镜透射电镜用于观察肝的超微结构变化㊂快速切9013畜牧兽医学报54卷取2mm3的新鲜肝组织放入预冷的2.5%戊二醛溶液中固定2h㊂组织块经乙醇和丙酮常规脱水,环氧树脂包埋㊂然后,用超薄切片机制作50~70n m 切片,并用醋酸铀染色液(30m i n)和柠檬酸铅染色液(10m i n)染色㊂最后,用透射电镜观察肝超微结构㊂1.5E L I S A检测用预冷的P B S洗涤肝,并切取适量组织加入到10倍体积的P B S中㊂组织匀浆后,4ħ离心(12000g,15m i n),吸取上清备用㊂然后,B C A测定蛋白浓度,并按照E L I S A试剂盒说明书步骤检测匀浆液中炎症因子(I L-6㊁T N F-α㊁I L-17㊁T G F-β㊁I N F-γ㊁I L-1β㊁I L-23)的含量㊂最后,计算每m g肝组织匀浆液中炎症因子含量=炎症因子含量/蛋白浓度㊂1.6流式细胞检测本研究分别用C D3+/C D4+㊁C D3+/C D8+㊁C D68㊁C D11c㊁C D56㊁C C1㊁γδT C R流式抗体标记C D4+T细胞㊁C D8+T细胞㊁巨噬细胞㊁树突状细胞㊁自然杀伤细胞㊁肥大细胞㊁γδT细胞㊂小鼠处死后,取新鲜肝组织制备细胞悬液㊂细胞悬液经过滤和洗涤后,用裂解液破碎红细胞㊂随后用流式抗体(1ʒ100)孵育30m i n(对于胞内蛋白在抗体孵育前进行固定和破膜)㊂洗涤3次后上机(B D L S R F o r t-e s s a细胞分析仪),并使用F l o w J o处理数据㊂1.7免疫组化石蜡切片常规脱蜡至水,3%H2O2消除内源性过氧化物酶,并用柠檬酸钠-E D T A抗原修复液100ħ修复15m i n㊂P B S洗涤后,兔抗鼠一抗(C a s p a s e3和C y t-c,1ʒ100)4ħ孵育过夜,生物素化的山羊抗兔二抗(1ʒ1500)室温下孵育1h㊂然后,用D A B显色(试验过程中防止组织干燥),并用中性树脂封片㊂最后,用普通显微镜观察和图像分析软件(I m a g e-P r o P l u s)分析光密度值㊂1.8数据统计数据用 xʃs 表示,并用G r a p h P a d P r i s m6分析数据的显著性㊂通过O n e-w a y a n a l y s i s o f v a-r i a n c e(A N O V A)分析,随后进行T u k e y检验㊂P<0.05表示具有统计学意义㊂2结果2.1I L-17A基因敲除对氟诱导的肝组织形态和超微结构损伤的影响通过H E染色和透射电镜观察组织病理学和超微结构变化(图1)㊂结果显示,对照组小鼠的肝形态结构正常,肝索排列紧密且有规则,线粒体和内质网形态正常,无明显异常㊂然而,氟暴露后肝中炎症细胞浸润增加,肝细胞间隙增大,颗粒变性㊁空泡变性㊁核固缩㊁核溶解肝细胞数量增多,线粒体畸形和脊损伤增加,内质网扩张和破碎增加㊂与N a F组相比,I L-17A基因敲除后肝组织结构损伤减轻,核固缩和核溶解细胞数量减少,炎症细胞浸润降低,畸形线粒体数量降低,内质网损伤减轻㊁数量增多㊂结果表明,I L-17A缓黄色箭头:炎症细胞;蓝色剪头:颗粒变性;黄色箭头:空炮变性;橙色箭头:核固缩;紫色箭头:核溶解;N.细胞核;M.线粒体;E.内质网Y e l l o w a r r o w:i n f l a mm a t o r y c e l l s;B l u e a r r o w:p a r t i c l e d e n a t u r a t i o n;Y e l l o w a r r o w:v a c u o l a r d e n a t u r a t i o n;O r a n g e a r r o w: n u c l e a r s o l i d i f i c a t i o n;P u r p l e a r r o w:k a r y o l y s i s;N.N u c l e a r;M.M i t o c h o n d r i a;E.E n d o p l a s m i c r e t i c u l u m图1H E染色(400ˑ,n=6)和透射电镜结果(20000ˑ,n=3)F i g.1T h e r e s u l t s o f H E s t a i n i n g(400ˑ,n=6)a n d t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y(T E M,20000ˑ,n=3) 01137期赵阳飞等:I L-17A基因敲除对氟诱导小鼠肝炎症反应和肝细胞凋亡的影响解了氟诱导的肝组织形态和超微结构损伤㊂2.2I L-17A基因敲除对氟诱导肝炎症因子表达改变的影响本研究运用E L I S A检测炎症反应过程中关键炎症因子(I L-6㊁T N F-α㊁I L-17㊁T G F-β㊁I N F-γ㊁I L-1β㊁I L-23)在肝中的含量(图2)㊂与对照组相比, N a F组肝中T N F-α㊁I L-17㊁I N F-γ㊁I L-23㊁T G F-β的含量显著升高(P<0.05,P<0.01),I L-1β的含量显著降低(P<0.01),然而,与N a F组相比,K O+ N a F组肝中T N F-α㊁I L-17㊁I N F-γ㊁I L-23㊁T G F-β的含量显著降低(P<0.05,P<0.01),I L-1β的含量显著升高(P<0.01)㊂I L-6含量在N a F组和K O+ N a F组无显著变化㊂这些结果表明,I L-17A基因敲除缓解了氟诱导的肝炎症因子表达改变㊂与对照组相比,*.P<0.05,**.P<0.01;#.P<0.05,与N a F组相比,##.P<0.01;下同*.P<0.05,**.P<0.01,v s c o n t r o l g r o u p;#.P<0.05,##.P<0.01,v s N a F g r o u p;T h e s a m e a s b e l o w 图2肝炎症因子E L I S A检测结果(n=8, xʃs)F i g.2E L I S A d e t e c t i o n r e s u l t s o f h e p a t i c i n f l a m m a t o r y f a c t o r s(n=8, xʃs)2.3I L-17A基因敲除对氟诱导肝C D4+T细胞和C D8+T细胞水平改变的影响本研究用流式细胞术检测了肝中C D4+T细胞和C D8+T细胞㊂如图3所示,氟暴露后肝C D4+T 细胞和C D4+T细胞/C D8+T细胞比值显著降低(P<0.05)㊂然而,与N a F组相比,I L-17A基因敲除显著增加了肝中C D4+T细胞和C D4+T细胞/ C D8+T细胞比值(P<0.05)㊂C D8+T细胞在N a F组和K O+N a F组中无显著差异㊂2.4I L-17A基因敲除对氟诱导肝炎症细胞水平改变的影响本研究通过流式细胞术检测肝中树突状细胞㊁巨噬细胞㊁肥大细胞㊁自然杀伤细胞㊁γδT细胞含量观察I L-17A基因敲除对氟诱导肝炎症细胞水平改变的影响(图4)㊂结果显示,与对照组相比,N a F组肝中自然杀伤细胞和γδT细胞显著降低,M2型巨噬细胞和树突状细胞显著升高(P<0.05)㊂I L-17A 基因敲除后肝中树突状细胞与N a F组相比显著降低(P<0.05)㊂同时,K O+N a F组中的γδT细胞和M2型巨噬细胞与对照组比无显著差异㊂上述结果表明,I L-17A基因敲除缓解了氟诱导的肝炎症细胞水平改变㊂2.5I L-17A基因敲除对氟诱导肝细胞凋亡的影响为探究I L-17A基因敲除对氟诱导的肝细胞凋1113畜 牧 兽 医 学 报54卷图3 C D 4+T 细胞和C D 8+T 细胞含量流式检测结果(n =6, x ʃs )F i g .3 T h e f l o w c y t o m e t r y re s u l t s of C D 4+T c e l l a n d C D 8+T c e l l c o n t e n t s (n =6, x ʃs )亡的影响,本研究运用流式细胞术和免疫组化检测了凋亡肝细胞数和凋亡标志蛋白C a s p a s e 3和C y t -c 的蛋白表达水平㊂A n n e x i n V 和P I 双染法是流式细胞术检测细胞凋亡的经典方法,流式结果如图5所示,与对照组相比,N a F 组中肝细胞凋亡率显著增加(P <0.05)㊂然而,与N a F 组相比,K O+N a F组中肝细胞凋亡率显著降低(P <0.05)㊂与流式结果相似,免疫组化结果显示(图6,表1),与对照组相比,N a F 组肝中C a s p a s e 3和C yt -c 的蛋白表达水平极显著增加(P <0.01),而I L -17A 基因敲除显著降低了C a s p a s e 3和C yt -c 蛋白表达与N a F 组相比(P <0.05,P <0.01)㊂结果表明,I L -17A 基因敲除减轻了氟诱导的肝细胞凋亡㊂表1 肝C a s p a s e 3和C y t -c 蛋光密度值统计结果(n =5, x ʃs )T a b l e 1 T h e o p t i c a l d e n s i t y v a l u e s t a t i s t i c a l r e s u l t s o f C a s p a s e 3a n d C yt -c p r o t e i n i n t h e l i v e r (n =5, x ʃs )蛋白名称P r o t e i n n a m e s对照组C o n t r o l g r o u pN a F 组N a F g r o u pK O+N a F 组K O+N a F g r o u pC a s p a s e 30.1775ʃ0.00130.1906ʃ0.0025**0.1835ʃ0.0021#C yt -c 0.1160ʃ0.00290.1834ʃ0.0052**0.1529ʃ0.0046##3 讨 论氟中毒是一种广泛分布于世界许多国家和地区的人畜共患性地方病,中国是受其危害较为严重的国家之一[10]㊂氟中毒主要是由于长期慢性的氟暴露引起,并造成机体多种组织和器官的损伤㊂肝是氟中毒的重要靶器官,氟能够损伤肝的结构和功能,进而影响机体的物质代谢和有害物质的蓄积[1]㊂在一项关于美国青少年血氟含量与肝功能相关性调查的研究发现血清氟含量与肝功能呈负相关,氟暴露影响肝功能,反过来肝功能损伤会影响氟的吸收和代谢过程,这样的恶性循环进一步加重了氟对肝的危害[11]㊂同时,大量研究发现氟暴露能够导致肝中核固缩㊁核溶解㊁空泡变性㊁脂肪变性增多,线粒体和内质网损伤,以及炎症细胞的浸润[5,12]㊂与上述研究结果相似,在本研究中氟暴露导致了肝组织形态和超微结构损伤㊂在前期研究中,作者发现氟暴露后肝中I L -17A 含量和炎症细胞浸润显著增加[5]㊂I L -17A 作为重要的促炎因子,其在炎症的发生和发展过程中发挥重要的调节作用[13]㊂因此,作者推测I L -17A 在氟诱导了肝的炎症损伤中发挥重要的作用㊂I L -17A 参与急慢性炎症过程,I L -17A 的高表达能够促进免疫细胞的慢性浸润和多种炎症因子的21137期赵阳飞等:I L -17A基因敲除对氟诱导小鼠肝炎症反应和肝细胞凋亡的影响图4 巨噬细胞㊁树突状细胞㊁自然杀伤细胞㊁肥大细胞㊁γδT 细胞含量流式检测结果(n =6, x ʃs )F i g .4 T h e f l o w c y t o m e t r y r e s u l t s o f m a c r o p h a ge s ,d e n d r i t i c c e l l s ,n a t u r a l k i l l e r c e l l s ,m a s t c e l l s ,a n d γδT c e l l s c o n t e n t s (n =6, x ʃs )表达,并最终导致炎症反应和组织损伤[14-15]㊂Z h a n g 等[16]研究发现,I L -17A 功能的阻断能够有效缓解胆汁淤积诱导的肝细胞坏死和肝损伤㊂同时,G o m e s 等[17]的研究也发现阻断I L -17A 信号传导可减少脂肪变性和肝损伤,并预防肝细胞癌㊂相似地,在本研究中I L -17A 的基因敲除缓解了氟诱导的肝组织形态损伤㊂为探究I L -17A 基因敲除缓解肝损伤的机制,本研究进一步检测了肝中炎症因子和炎症细胞的变化情况㊂炎症反应是机体抵御不良刺激的一种防御反应,但过强或长期的炎症反应能够诱导机体组织器官的功能损伤[18]㊂已有大量的研究报道外源性毒物能够导致肝中炎症因子和炎性细胞的水平改变,进而引发肝炎症[19]㊂同时,研究发现氟作为广泛存在与水和食物中的外源性毒物能够增加肝中炎症因子I L -2㊁I L -4㊁I L -6㊁I L -13㊁I L -21㊁T N F -α和T G F -β3113畜 牧 兽 医 学 报54卷图5 肝细胞凋亡流式检测结果(n =6, x ʃs )F i g .5 T h e f l o w c y t o m e t r y r e s u l t s o f h e p a t o c y t e a p o pt o s i s (n =6, x ʃs)图6 肝C a s p a s e 3和C y t -c 蛋白免疫组化结果(400ˑ)F i g .6 C a s p a s e 3a n d C yt -c i m m u n o h i s t o c h e m i c a l r e s u l t s (400ˑ)水平升高,以及I F N -γ/I L -4和I L -2/I L -10比值的降低[20]㊂与上述结果相似,本研究中氟暴露增加了肝中T N F -α㊁I L -17A ㊁I N F -γ㊁I L -23㊁T G F -β含量,以及M 2型巨噬细胞和树突状细胞水平㊂同时,氟暴露降低了I L -1β㊁自然杀伤细胞㊁γδT 细胞和C D 4+T 细胞水平,以及C D 4+T 细胞/C D 8+T 细胞比值㊂I L -23㊁I L -17㊁T N F -α㊁I N F -γ㊁I L -1β是关键的促炎细胞因子,T G F -β是关键的抑炎细胞因子[21]㊂巨噬细胞㊁树突状细胞㊁T 淋巴细胞㊁自然杀伤细胞㊁γδT 细胞能够产生炎症因子,并介导炎症反应过程[18]㊂C D 4+T 细胞是机体免疫力的重要指标,其含量降低表明机体免疫力减弱㊂C D 4+T 细胞/C D 8+T 细41137期赵阳飞等:I L-17A基因敲除对氟诱导小鼠肝炎症反应和肝细胞凋亡的影响胞比值是免疫调节的一项重要指标,其比值的异常表明免疫功能的紊乱[22]㊂这些结果表明氟暴露降低了肝的免疫能力,扰乱了肝炎症平衡,增加了肝的炎症反应㊂I L-17A作为炎症反应过程中重要的促炎因子,其不仅能够增加炎症因子的分泌,而且能够促进炎症细胞在受损组织中的浸润[14]㊂Z h a n g 等[16]发现阻断I L-17A的作用显著减少肝中促炎细胞因子㊁中性粒细胞㊁巨噬细胞的流入㊂在本试验中,与N a F组相比,I L-17A基因敲除降低了肝中T N Fα㊁I L-17A㊁I N F-γ㊁I L-23㊁T G F-β的表达水平和树突状细胞含量,增加了I L-1β的表达水平㊂虽γδT细胞和M2型巨噬细胞与氟组无显著差异,但其与对照组比无显著差异㊂有趣的是在本研究中I L-1β㊁自然杀伤细胞和γδT细胞在氟组降低,且I L-17A基因敲除增加了I L-1β水平㊂I L-1β结果可能的机制:I L-1β作为组织的细胞防御和组织修复的关键因子,其在细胞增殖㊁分化和凋亡等生物过程中发挥重要作用㊂肝作为自我修复能力较强的器官,受到氟的损伤后启动修复机制,抑制了I L-1β的表达㊂I L-17A基因的敲除能够缓解氟诱导的肝损伤,从而促进I L-1β的表达趋于正常㊂自然杀伤细胞和γδT细胞结果可能的机制:自然杀伤细胞和γδT细胞较为敏感,容易受到外源性毒物氟的刺激,激活细胞的凋亡程序,进而导致肝中自然杀伤细胞和γδT细胞数量的降低㊂自然杀伤细胞和γδT细胞作为机体重要的免疫细胞,其数量的减少能够降低机体的免疫力,进一步影响机体的炎症反应㊂同时,I L-17A基因的敲除未参与到上述诱导自然杀伤细胞和γδT细胞凋亡的过程㊂因此,I L-17A基因的敲除未缓解氟诱导的上述改变㊂在未来的研究中作者将进一步探究I L-1β㊁自然杀伤细胞和γδT 细胞在氟致肝损伤中的作用机制㊂上述结果表明, I L-17A基因敲除缓解了氟诱导的肝炎症损伤㊂已有大量研究发现,炎症反应与细胞凋亡密切相关,一方面大量的炎症因子能够诱导细胞凋亡的发生,另一方面细胞凋亡能够清除炎症病灶内中性粒细胞和其他滞留细胞,限制组织损伤,促进炎症吸收[23]㊂因此,本研究进一步探究了I L-17A基因敲除对氟诱导的肝细胞凋亡的影响㊂细胞凋亡是一种维持细胞微环境稳态的细胞自主性和程序性死亡方式㊂在生理条件下,机体通过凋亡去除不需要的和异常的细胞㊂而在病理条件下,受不利条件刺激细胞凋亡增加,导致正常细胞损伤[24]㊂已有研究发现,氟可导致肝细胞的凋亡增加[25-26]㊂例如,O u y a n g等[25]报道氟通过C y t-c/ C a s p a s e3/9通路诱导了鸭肝细胞的凋亡㊂L u等[26]报道氟通过氧化应激和凋亡导致了小鼠肝损伤㊂与上述研究结果相似,本研究中氟暴露增加了肝中的凋亡细胞,以及凋亡关键基因C y t-c和C a s p a s e3的蛋白表达水平㊂C y t-c是凋亡C a s p a s e级联反应的关键蛋白酶激活因子,C a s p a s e3是介导凋亡信号和执行细胞凋亡的关键激酶[8]㊂同时,本研究发现I L-17A基因敲除减轻了氟诱导的肝细胞凋亡,降低了C y t-c和C a s p a s e3的蛋白表达水平㊂在外源性毒物诱导肝炎症的研究发现,I L-17A作为重要炎症因子,其能够刺激多种细胞释放金属蛋白酶和炎症因子,促进炎症细胞的募集和肝炎症反应[14]㊂最近研究发现,I L-17A能够通过I L-17A受体通路调节细胞自噬㊁线粒体损伤㊁凋亡等生物过程[27-28]㊂例如,K i m等[27]研究发现I L-17A通过损伤线粒体功能诱导滑膜成纤维细胞的凋亡㊂因此,I L-17A缓解氟诱导的肝细胞凋亡的机制可能是氟引起了肝的炎症反应,炎症因子的大量释放刺激肝细胞的凋亡,同时氟作为外源性毒物能够激活I L-17A受体通路诱导肝细胞凋亡㊂然而,I L-17A基因的敲除缓解了氟诱导的肝炎症反应,减轻了炎症因子刺激的凋亡,并阻断了I L-17A受体通路诱导的肝细胞凋亡㊂4结论氟暴露损伤了肝的组织形态,并改变了肝内炎症因子(T N F-α㊁I L-17㊁I N F-γ㊁I L-23㊁T G F-β㊁I L-1β)和炎症细胞(M2型巨噬细胞㊁树突状细胞㊁C D4+T 细胞㊁自然杀伤细胞㊁γδT细胞)的水平㊂同时,氟暴露诱导了肝细胞凋亡㊂然而,I L-17A基因敲除能够缓解氟诱导的肝炎症反应,并减轻氟诱导的肝细胞凋亡㊂本研究明确了I L-17A在氟诱导肝炎症反应和凋亡中的作用,并进一步揭示了氟肝毒性的内在机理,为氟中毒的防治提供了理论依据㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] Z HA O S Y,G U O J X,X U E H J,e t a l.S y s t e m a t i ci m p a c t s o f f l u o r i d e e x p o s u r e o n t h e m e t a b o l o m i c s o fr a t s[J].E c o t o x i c o l E n v i r o n S a f,2022,242:113888.[2]龚涛,陈涛,柏才敏,等.高氟对雏鸡肝细胞周期和凋亡影响的研究[J].畜牧兽医学报,2009,405113畜牧兽医学报54卷(11):1675-1680.G O N G T,C H E N T,B A I C M,e t a l.E f f e c t o fd ie t a r y h i g hf l u o r i n e o n t h e c e l l c y c l e a n d a p o 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第十七章杂环化合物一、本章知识结构及知识要点本章知识结构知识要点1、杂环化合物命名和结构1命名杂环母核音译法按照IUPAC推荐的普通名称用23个汉字音译使用带口字旁的同音汉字。

如呋喃、吡啶等。

系统命名法根据相应的碳环命名。

如O氧杂-24-环戊二烯原子的编号杂环化合物分类、命名和结构分类和命名结构和芳香性五元杂环化合物化学性质常见的五元杂环化合物呋喃和糠醛噻吩吡咯和吲哚咪唑和噻唑六元杂环化合物吡啶和嘧啶喹啉和异喹啉嘌呤编号从杂原子开始。

含有两种以上杂原子时①让杂原子的位号尽可能小②当两个杂原子不相同时价数小的在前大的在后③价数相等时原子序数小的在前大的在后。

有些稠杂环化合物的原子编号是固定的。

2结构和芳香性呋喃、吡咯、噻吩的结构sp2杂化结构特点杂原子共轭效应是供电子的诱导效应是吸电子的。

杂原子是sp2杂化未成键电子对在2p轨道上参与共轭。

由于6个π电子分布于5个原子上整个环的π电子几率密度比苯大是富电子芳环因而比苯环活泼亲电取代反应比苯快得多。

芳香性由大到小苯噻吩吡咯呋喃吡啶的结构sp2杂化结构特点杂原子的共轭效应和诱导效应都是吸电子的。

未成键电子对在sp2杂化轨道上不参与共轭。

形成∏66共轭体系具有芳香性。

由于N原子的吸电子作用使环的电子云密度降低亲电反应活性比苯低类似硝基苯。

2、五元杂环化合物1吡咯、呋喃和噻吩的化学性质容易发生亲电取代反应主要发生在α-位反应的活性为吡咯呋喃噻吩苯。

由于这些五元杂环容易被破坏稳定性差因而对试剂及反应条件应有所控制。

硝化硝化应在较低的温度下使用温和的硝化剂乙酰硝酸酯。

NHNHNO2CH3COONO210CH3CO2O ℃SSNO2CH3COONO210CH3CO2O ℃呋喃比较特殊先生成稳定的或不稳定的25加成产物然后加热或用吡啶除去乙酸得到硝化产物。

OCH3COONO230 5 ℃ONO2HONO2HHCH3COO吡啶ONO2 磺化吡咯、呋喃不太稳定所以须用温和的磺化试剂磺化。

综述・讲座¬紫杉类化疗药物抗肿瘤免疫调节的作用何秋山1,2,　易铁男1,　高基民21.华中科技大学同济医学院附属襄樊医院肿瘤科,湖北襄樊4410002.南方医科大学生物技术学院生物治疗研究所,广东广州510515E ffects of taxane s on the antitumor immunotherapyH E Qi u2shan1,2,Y I Tie2nan1,GA O J i2min21.De partment of Chemothera p y,A f f iliated X iang f an Hos pital,Tong j i Medical College,H uaz hong S cienti f ic andTechnical Universit y,X iang f an441000,P.R.China2.I nstitute of B iotherap y,College of B iotechnolog y,S outhern Medical Universit y,Guangz hou510515,P.R.China【摘要】　总结国内外关于紫杉类化疗药物对肿瘤免疫调节作用的研究进展。

方法:应用Medline和CH KD期刊全文数据库检索系统,以“紫杉醇/多西紫杉醇,免疫调节,免疫治疗,化疗,肿瘤”为关键词,检索1999201-2009204紫杉类化疗药与免疫及肿瘤免疫治疗相关的文献,其中英文146篇,中文11篇,根据研究内容为紫杉醇或多西紫杉醇的免疫影响以及在肿瘤免疫治疗中的作用对文献进行筛选,最后纳入20篇。

结果:紫杉类化疗药物具有明显的免疫调节作用,其抗肿瘤免疫调节作用与剂量和细胞亚群及作用时间相关。

当紫杉类化疗药物与疫苗合理联合应用时可产生明显的抗肿瘤协同效果,紫杉类化疗药物具体的作用机制尚未完全明确。

结论:化疗联合免疫疗法为肿瘤治疗带来了新的思路及希望,但目前紫杉类药物联合免疫治疗的研究尚处于初期,具体的机制及理想的联合方式仍需进一步研究。