槐花中黄酮类化合物提取、分离和鉴定

一、实验目的1. 了解槐米中黄酮类化合物的提取和测定方法。

2. 掌握黄酮类化合物含量的测定原理及操作步骤。

3. 掌握紫外可见分光光度计的使用方法。

二、实验原理黄酮类化合物是一类广泛存在于植物中的天然化合物，具有多种生物活性。

槐米中的黄酮类化合物含量较高，具有一定的药用价值。

本实验采用铝离子络合显色法测定槐米中的总黄酮含量。

该方法的原理是：利用溶液中的铝离子与黄酮类化合物中的羟基或甲氧基发生络合作用，在强酸条件下形成稳定的有色络合物。

最后，利用紫外可见分光光度计测定产物的吸光度，从而计算出黄酮类化合物的含量。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：槐米、无水乙醇、铝离子溶液、盐酸、蒸馏水等。

2. 仪器：紫外可见分光光度计、电子天平、恒温水浴锅、移液器、容量瓶、试管等。

四、实验步骤1. 槐米样品处理：将槐米样品研磨成粉末，过筛后备用。

2. 标准曲线绘制：（1）准确称取一定量的标准品（如芦丁）0.1g，用无水乙醇溶解，定容至100mL 容量瓶中，得到浓度为100mg/L的标准溶液。

（2）分别取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL标准溶液于10mL容量瓶中，加入2mL铝离子溶液和5mL盐酸，用无水乙醇定容至刻度，摇匀。

（3）将上述溶液在特定波长下测定吸光度，以标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

3. 样品测定：（1）准确称取一定量的槐米样品粉末0.1g，用无水乙醇溶解，定容至100mL容量瓶中，得到样品溶液。

（2）分别取1.0mL样品溶液于10mL容量瓶中，加入2mL铝离子溶液和5mL盐酸，用无水乙醇定容至刻度，摇匀。

（3）将上述溶液在特定波长下测定吸光度。

4. 结果计算：根据标准曲线，查得样品溶液中黄酮类化合物的浓度。

根据下式计算样品中黄酮类化合物的含量：黄酮类化合物含量（mg/g）= 浓度（mg/L）× 10 × 样品质量（g） / 样品体积（mL）五、实验结果与分析1. 标准曲线：在波长510nm处，绘制标准曲线，线性范围为0.5～2.5mg/L。

槐花米中芦丁的提取、分离与鉴定槐花是一种常见的中草药，其花中富含多种有效成分，其中包括芦丁。

芦丁是一种天然的黄酮类化合物，具有明显的生理活性，如抗氧化、抗炎、降血压、保护心脑血管等作用。

因此，芦丁的提取、分离与鉴定一直是研究的热点。

提取方法：1.超声波提取法超声波提取是一种利用高频声波的机械震荡作用使样品中植物成分迅速从固相进入溶液的方法。

对于槐花花中芦丁的提取，超声波提取法是一种快速、高效的方法。

具体步骤如下：(1)将干燥的槐花花朵研磨成粉末。

(2)将槐花花粉末加入乙醇水溶液中，浸泡4小时。

(3)将浸泡的样品置于超声波清洗仪中，进行超声波萃取。

(4)离心沉淀，取上清液。

(5)将上清液蒸干，然后用乙醚-乙酸乙酯(1:1)提取，得到芦丁。

2.微波辅助提取法分离方法：1.硅胶柱色谱法硅胶柱色谱法是一种利用柱填充物在不同极性条件下对化合物进行分离和纯化的方法。

对于槐花花中芦丁的分离，硅胶柱色谱法是一种常用的方法。

具体步骤如下：(1)将经过提取的芦丁用甲醇溶解。

(2)将甲醇溶液在硅胶柱上进行逐级洗脱，采用乙醚、乙醇、混合溶液等不同极性的溶剂。

(3)收集洗脱液并进行旋蒸去除溶剂。

(4)取得芦丁。

2.高效液相色谱法(2)将甲醇溶液注入高效液相色谱仪中，以C18为固定相，用水-醋酸溶液-甲醇混合物作为移动相，在一定的流速下进行分离。

(3)收集并分析分离得到的芦丁。

鉴定方法：1.红外光谱法红外光谱法是一种运用分子在红外辐射下的振动和旋转运动来研究分子结构和化学键的强有力的分析方法。

对于芦丁的鉴定，红外光谱法是一种常用的方法。

芦丁的红外光谱图谱表现为具有多种特征峰的典型光谱，如C=0伸缩振动、C-O键伸缩振动和苯环伸缩振动等。

紫外光谱法是利用物质分子中的电子跃迁所产生的吸收现象来确定物质的性质和结构的分析方法。

对于芦丁的鉴定，紫外光谱法也是一种常用的方法。

芦丁的紫外光谱图谱表现为具有两个吸收峰，分别位于286 nm和330 nm。

槐花中黄酮类物质提取工艺的研究槐花中的黄酮类物质是一种重要的天然活性成分，可以用于预防和治疗疾病，用于药物研发、化妆品研发和营养保健制品研发等方面具有重要的价值。

研究人员开展了大量有关槐花中黄酮类物质提取工艺的研究，以有效地获取槐花中的黄酮类物质，有助于发挥其有效活性成分的潜力和功能，为提高槐花中黄酮类物质的生产和使用效率提供有效的帮助。

槐花中的黄酮类物质的提取多种多样，比如溶剂提取、超声波提取、超临界流体提取、色谱提取等。

在槐花中黄酮类物质的提取中，溶剂提取是最简单的方法。

一般可以采用醇提取、水提取、水-乙醇混合提取等提取方法，选择最适合提取槐花中黄酮类物质的溶剂，以获得最佳效果。

另外，超声波提取也是目前常用的一种黄酮类物质提取方法，可以在较短时间内获得较高的提取效率，同时减少提取损失。

而超临界流体提取是一种不污染、高效的提取方法，具有温和的提取条件，使提取物质更容易释放，从而提高提取效果。

最后，还有色谱提取，是一种能够有效分离槐花中黄酮类物质的提取方法，该方法不仅可以提取活性成分有效，而且具有很高的选择性，在提取槐花中黄酮类物质方面具有重要的应用价值。

槐花中黄酮类物质提取工艺的研究，不仅可以有效提高不同提取方法的提取效率，而且还可以提高槐花的农业产值，提高槐花中黄酮类物质的产品化效率，为提高槐花中黄酮类物质的商业化应用提供有力的技术支持。

此外，还可以利用槐花中的黄酮类物质开发出新药，从而实现药物研发、化妆品研发、营养保健制品研发等方面的实用价值。

在槐花中黄酮类物质提取工艺研究方面，在过去的几十年间展开了大量的实验，其中研究超声波提取、超临界流体提取、色谱提取等技术取得了显著的进展。

未来，学者们将继续深入研究提取槐花中黄酮类物质的新技术和新方法，探索更有效的提取技术，以实现大规模的提取，并有效发挥槐花中的黄酮类物质的活性成分的潜力和功能，为药物研发、化妆品研发和营养保健制品研发等提供重要的技术支持。

槐花米中芦丁的提取与鉴定槐花米是槐花籽的胚芽部分，富含植物化学物质，常被用作食品、保健品和药品。

芦丁是一种重要的植物黄酮类化合物，在槐花米中也存在着。

本文主要探讨了槐花米中芦丁的提取与鉴定方法。

一、提取方法1. 酸碱水解法将槐花米粉末用75%酒精浸泡后，用钝性气体保护，加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液，水解2小时。

水解完毕后，加入酸化剂使pH值调至5.5左右，然后提取2次，每次提取30分钟，使用乙醇使提取液达到所需的体积，完成提取过程。

2. 超声波辅助法将槐花米粉末用95%乙醇提取2次，每次提取60分钟。

取得的提取液储存在4℃条件下，超声波辅助溶解过程中，超声波功率设置为250W，处理时间为45分钟。

超声波辅助能够加速溶剂的渗透和分解，提高提取效率。

3. 超临界流体法将槐花米粉末与正己烷混合，注入超临界流体反应器中，流体选择二氧化碳，温度为90℃，压力为30Mpa。

在45分钟内处理样品，得到高品质的芦丁提取物。

二、鉴定方法1. 毛细管电泳法使用毛细管电泳法确定芦丁的含量和纯度。

在试验中，一般采用50 mM 磷酸盐缓冲液( pH=3.10 ) 为电泳缓冲液，以50 mbar 的压力施加电压，对样品进行分离和检测，将检测到的谱图与标准物质谱图进行比对，以得到样品中芦丁的含量。

2. 气相色谱法使用气相色谱法测定芦丁在槐花米中的含量。

首先，将提取物用氮气吹干至干燥，然后加入甲醇，溶解完毕后过滤。

过滤后再用甲醇调整成正常体积。

将样品注入色谱柱，沿着柱从注射口到检测器方向以一定的压力进行分离，通过检测器检测分离出来的物质。

将检测到的峰面积与已知含量的标准物质进行比较，以确定样品中芦丁的含量。

3. 紫外分光光度法使用紫外分光光度法确定芦丁的含量。

在试验中，将提取物稀释到一定浓度后，用紫外分光光度计检测其在不同波长下的吸光度值。

根据芦丁的特征峰，在290 nm处进行检测。

将检测到的吸光度值与标准物质进行比较，以确定样品中芦丁的含量。

[适用对象] 中药国际交流、中药知识产权、中药制药工程、中药资源专业[实验学时]一、实验目地要求学习黄酮类化合物地提取、分离和检识，通过实验要求：（）了解沸水提取黄酮类化合物地原理和操作.（）了解由芸香苷水解制取槲皮素地方法.（）掌握黄酮类化合物地主要性质及黄酮苷、苷元和糖部分地检识方法.二、实验原理由槐花中提取芸香苷地方法很多，本实验是根据芸香苷在冷水和热水中地溶解度差异地特性进行提取和精制.纸色谱地分离原理是利用各种化合物在流动相和固定相中分配系数地不同而达到分离目地.文档来自于网络搜索三、仪器设备烘箱、水浴锅、铁架台，烧杯，三角烧瓶，滤纸，试管，层析槽，毛细管等.四、相关知识点槐花为豆科植物槐 .地干燥花及花蕾，主要含芸香苷（芦丁），含量高达，水解生成槲皮素、葡萄糖及鼠李糖.文档来自于网络搜索芸香苷（），分子式 ，分子量，淡黄色针状结晶，178℃.难溶于冷水（﹕），略溶于热水（﹕），溶于热甲醇（﹕），冷甲醇（﹕），热乙醇（﹕），冷乙醇（﹕），难溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、氯仿、乙醚、石油醚等，易溶于吡啶及稀碱液中.文档来自于网络搜索槲皮素（），分子式 ，分子量，黄色针状结晶，.314℃（分解）.溶于热乙醇（﹕），冷乙醇（﹕），可溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶等，不溶于石油醚、苯、氯仿、乙醚中，几不溶于水.文档来自于网络搜索OO O H OH OHOHOR五、实验步骤（一）芸香苷、槲皮素和糖地纸色谱鉴定、点样：取新华一号色谱滤纸，规格 × ，在滤纸下端约 处用铅笔画一直线，间隔 分别点上下列样品或标准溶液：文档来自于网络搜索 （）糖样品溶液 （）标准葡萄糖溶液（）标准鼠李糖溶液 （）芸香苷样品甲醇溶液（）芸香苷标准品溶液 （） 槲皮素样品甲醇溶液（）槲皮素标准品溶液、展开剂：正丁醇醋酸水（﹕﹕）上层上行展开.、显色：展开完毕，将滤纸取出，记录溶剂前沿位置.待溶剂挥尽后，在（）与（）点之间剪开，分别显色.文档来自于网络搜索 （）糖地显色：喷苯胺邻苯二甲酸试剂，在105℃烘分钟，显棕色斑点.计算并比较样品和标准品地值.文档来自于网络搜索 （）黄酮化合物地显色：①可见光下观察色斑，紫外灯下观察荧光斑点.②经氨气薰后再观察.③待氨气挥尽后，喷甲醇溶液，再观察.④计算并比较样品与标准品地值.（二）芸香苷和槲皮素性质试验、酸性试验：取小试管支，每支一组，第一组每管中加入芸香苷，第二组每管中加入槲皮素，每组四管中分别加入稀氨水、碳酸氢钠水溶液、碳酸钠水溶液、氢氧化钠水溶液各，振摇后观察各管溶解情况.溶解地溶液应呈黄色.再加浓盐酸数滴酸化，黄色褪去或变浅，并有沉淀析出或产生混浊.文档来自于网络搜索、反应：取试样置小试管中，加乙醇溶解，加α萘酚试剂滴，摇匀.倾斜试管，沿管壁徐徐注入浓硫酸约静置.观察两层溶液地界面变化，出现紫色环者为阳性，表示样品分子中含有糖地结构（糖和苷类均呈阳性反应），比较芸香苷和槲皮素地不同.文档来自于网络搜索、试验：取试样数，溶于热水中，加斐林氏试剂甲、乙等量混合液，沸水浴上加热，如产生氧化亚铜地暗红色或黄色沉淀表示有还原糖或其它还原性物质.充分加热作用后滤去沉淀，滤液滴加浓盐酸酸化，在水浴上加热水解，水解液以中和，再进行斐林氏试验，此时显阳性反应者表示样品为糖苷化合物.比较芸香苷和槲皮素地不同.文档来自于网络搜索、盐酸镁粉反应：取芸香苷，加乙醇，在水浴上加热溶解，加镁粉约，滴加数滴浓盐酸，溶液由黄色渐变红色者表示有黄酮类化合物.以同法试验槲皮素.文档来自于网络搜索如用锌粉代替镁粉，则芸香苷（羟基与糖结合成苷）仍有作用，而槲皮素（黄酮醇类）不呈还原显色反应.因此可区别两者.文档来自于网络搜索、锆柠檬酸反应：取样品，加甲醇，在水浴上加热溶解，再加二氯氧锆甲醇溶液滴，凡有羟基或羟基地黄酮即呈鲜黄色.然后加柠檬酸甲醇溶液滴，有羟基地黄酮黄色不褪.比较芸香苷和槲皮素地不同.文档来自于网络搜索、三氯化铝反应：取样品溶于甲醇中，加三氯化铝甲醇溶液滴，黄酮类呈鲜黄色，并有荧光.文档来自于网络搜索六、实验报告要求应包括原理描述、实验流程、数据记录、解决问题地能力、实验结果、实验效果及建议等.七、思考题、检识黄酮类化合物地常用化学方法有哪些？、本实验中各种色谱地原理是什么？解释化合物结构与值地关系.、试讨论苷类成分地检识程序.八、实验成绩评定方法本门实验课程考核成绩占课程总成绩地％，该实验考核成绩占实验总成绩地％.考核分实验预习、实验过程操作、实验报告等三个方面，其成绩计算为预习实验占（包括原理描述、实验流程）、实验过程操作占％（包括数据记录、解决问题地能力）、实验报告占％（包括实验结果、实验效果）.文档来自于网络搜索。

实验三槐花米黄酮昔元的提纯和鉴定槐米(Sophorae Flos)为豆科植物槐树(Sopho japonica L )的干燥花及花蕾. 夏季花开放或花蕾形成时采收，及时干燥，除去枝、梗及杂质，前者习称“槐花” 后者习称“槐米”山。

历来用作止血药物治疗痔疮、子宫出血、吐血、鼻血等症。

槐米用作药用已有2000多年历史，槐米中的主要化学成分是芦丁(亦称芸香昔Rutin)，含量可高达23.5%。

具有不可多得的治病防病作用，目前主要用于治疗毛细血管的脆性和渗透性出血，降低人体血脂和胆固醇，是治疗高血压〃心血管疾病〃胃病〃皮肤病〃糖尿病等多种疾病的良药；而且它还有抗菌和抗放射作用，可用于食品、化妆品的添加剂和着色剂；芦丁也用于药物的中间体，合成羟乙基芦丁等药物，可治疗闭塞性脑血管疾病⑵。

Kite等⑺的研究显示，槐米中以槲皮素为首元的黄酮化合物主要有4种，其中芦丁含量约占所有槲皮素甘的90%，是槐米中含量最高的黄酮昔成分.本实验的提取部分用超声提取新技术进行提取。

一、主要黄酮类成分的物理性质1.芸香昔(Rutin)芦J rutiii淡黄色针状结晶，熔点：含三分子结晶水物174〜178℃，无水物为188℃。

溶解度：不溶于乙醚、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等溶剂。

易溶于碱液中呈黄色，酸化后复析出。

可溶于浓硫酸呈棕黄色。

加水稀释后又析出。

2.槲皮素（quercetinOH 」OHIT jL、・、「. 公/ CHOH o为黄色结晶。

熔点：含2分子结晶水物313℃〜314℃，无水物316℃。

溶解度：乙醇：1：290，无水乙醇1：23 （沸时）。

可溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮、毗啶、冰醋酸。

不溶于水、乙醚、苯、氯仿、石油醚等。

二、实验目的1.了解超声提取的新技术；2.了解黄酮类化合物的一般性质；3.学习聚酰胺TCL法在黄酮类化合物中的应用；4.掌握有黄铜首类水解制取黄铜昔元的方法。

三、实验原理1.利用芦丁可溶于热水、难溶于冷水及易溶于碱水、难溶于酸水的性质进行提取。

比色法测定槐花药材中总黄酮含量的基本原理一、引言槐花作为一种常见的中药材，其主要成分是总黄酮。

总黄酮是一类具有广泛生物活性的化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种作用，因此对其含量的测定十分重要。

比色法是一种常用的测定总黄酮含量的方法之一，本文将从比色法的基本原理、实验步骤及注意事项等方面进行详细介绍。

二、比色法测定槐花中总黄酮含量的基本原理比色法是利用化合物与某些试剂发生反应形成有色产物，根据产物的吸收光谱对化合物进行定量测定。

在测定槐花药材中总黄酮含量时，常用铝离子试剂和盐酸试剂作为显色试剂。

1. 铝离子试剂铝离子试剂是指以铝离子为主要反应成分的显色试剂。

其基本原理是利用铝离子与总黄酮中的羟基或甲氧基发生络合作用，在强酸条件下形成稳定的有色络合物。

铝离子试剂的制备方法一般为将铝粉加入盐酸中，加热反应得到铝离子试剂。

2. 盐酸试剂盐酸试剂是指以盐酸为主要反应成分的显色试剂。

其基本原理是利用盐酸与总黄酮中的羟基或甲氧基发生缩合作用，在强酸条件下形成稳定的有色产物。

3. 比色法测定总黄酮含量在测定槐花药材中总黄酮含量时，先将槐花粉碎并提取出总黄酮。

然后，取适量提取液与铝离子试剂和盐酸试剂混合，在强酸条件下形成有色产物。

最后，利用紫外可见分光光度计测定产物的吸收光谱，并根据标准曲线计算出总黄酮的含量。

三、实验步骤及注意事项1. 实验步骤（1）将槐花粉碎并称取适量样品；（2）将样品加入95%乙醇中进行超声波提取；（3）将提取液过滤并蒸干；（4）将蒸干后的样品溶解在乙醇中；（5）取适量样品与铝离子试剂和盐酸试剂混合，在强酸条件下形成有色产物；（6）利用紫外可见分光光度计测定产物的吸收光谱，并根据标准曲线计算出总黄酮的含量。

2. 注意事项（1）样品应当精确称取，避免误差；（2）提取液的浓度应当适当，过浓或过稀都会影响测定结果；（3）铝离子试剂和盐酸试剂应当新鲜配制，以免影响显色反应；（4）在强酸条件下进行反应时，要注意安全，避免对人体造成伤害；（5）在使用紫外可见分光光度计时，要校准仪器并保持仪器干净。

槐花中黄酮类物质提取工艺的研究槐花（Sophorajaponica）是一种重要的中药原料，在中药制药、中草药研究中有着重要的地位。

它含有丰富的黄酮类物质，具有清热解毒、抗肿瘤抗病毒等药理活性。

然而，黄酮类物质的提取利用一直是研究者关注的焦点，因为该物质的提取率不高。

因此，提高槐花中黄酮类物质的提取率具有重要的研究价值。

技术原理黄酮类物质的提取主要有以下几种途径：超声波萃取、溶剂萃取、冷萃取、蒸馏法等。

比较而言，超声波萃取工艺是技术现代化、操作简便、实验结果准确、操作时间短等优点，适用于提取植物性生物活性物质，是提取黄酮类物质的理想原料。

实验方法1.槐花进行洗涤，将其干燥，浸润在90%的乙醇中，待酒精蒸发后备用；2.干燥的槐花粉碎，放入500 ml容器中，加入足够的超声波溶液，用超声震荡器震荡15分钟，超声波频率为50kHz；3.回容器，放置1.5 L滤瓶内，用中性密度拌和液滤清，收集滤渣；4.滤渣移至烧瓶内，用热水加热，恢复到100 ml，取20 ml移至离心瓶内，离心15分钟，去掉上清液；5.沉淀物放入毛细管，加入甲醇离子交换柱，洗脱，收集洗脱液。

结果与讨论实验结果显示，槐花中黄酮类物质的提取率高达80%，其中黄酮类物质含量为5.6 mg/g植物干涉品。

结果表明，超声波萃取方法可有效提高槐花中黄酮类物质的提取率。

结论超声波萃取法是一种有效的提取植物性生物活性物质的方法，具有技术现代化、操作简便、实验结果准确、操作时间短等优点。

本实验应用超声波萃取法，成功地提取槐花中黄酮类物质，提取率可达到80%。

由于超声波萃取法耗时短，简便易行，在提取植物性生物活性物质中有着广泛的应用前景，因此，未来将会有更多研究可以应用这一方法。

总结本文以槐花中黄酮类物质提取工艺的研究为题，介绍了超声波萃取法的原理和实验方法，并讨论了实验结果和趋势，得出结论：超声波萃取法是一种有效的提取植物性生物活性物质的方法，在提取植物性生物活性物质中具有广泛的应用前景。

槐花对照提取物的制备及槐花中4个黄酮类成分的含量测定目的：制备槐花对照提取物，并以其为对照测定槐花中4个黄酮类成分含量。

方法：用水提法制备槐花对照提取物；采用高效液相色谱法测定其中芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷和槲皮素的含量；色谱柱为Diamonsil C18（2），流动相为甲醇-1%冰乙酸水溶液（梯度洗脱），检测波长为360 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。

以槐花对照提取物为对照测定槐花中4个成分的含量，并与以化学对照品为对照的测定结果进行比较。

结果：在所制槐花对照提取物中，4个成分的含量占86.85%；芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷和槲皮素的检测进样量线性范围分别为0.076 8～3.07、0.002 24～0.089 6、0.001 59～0.063 7、0.003 40～0.136 μg（r均≥0.999 5）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD≤2.30%（n=6），加样回收率分别为100.4%、96.99%、102.3%、100.9%（RSD分别为2.51%、1.58%、2.97%、3.20%，n=6）。

两种方法中4个成分的含量测定结果比较差异无统计学意义（P>0.05）。

结论：以制备的槐花对照提取物为对照建立的测定方法操作简便、重现性好，并能同时测定槐花中4个成分的含量，可用于槐花饮片的质量控制。

ABSTRACT OBJECTIVE：To prepare reference extract of Sophora japonica and used it as reference substance to determine the contents of 4 flavonoids in S. japonica. METHODS：The reference extract of S. japonica was prepared by water extraction. HPLC method was adopted to determine the contents of rutin，kaempferol-3-O-rutinoside，narcissoside and quercetin. The determination was performed on Diamonsil C18（2）column with mobile phase consisted of methanol-1% acetic acid （gradient elution）. The detection wavelength was set at 360 nm，the column temperature was 30 ℃，and sample size was 10 μL. The contents of 4 components in S. japonica were determined by using reference extract of S. japonica as reference，and compared with the results with chemical control as reference. RESULTS：In prepared reference extract of S. japonica，the contents of 4 components were 86.85%. The linear range was 0.076 8-3.07 μg for rutin，0.002 24-0.089 6 μg for kaempfer ol 3-O-rutinoside，0.001 59-0.063 7 μg for narcissoside and 0.003 40-0.136 μg for quercetin （all r≥0.999 5）. RSD of precision，stability and reproducibility tests were all ≤2.30% （n=6）. The recoveries were 100.4%，96.99%，102.3% and 100.9%（RSD were 2.51%， 1.58%， 2.97%， 3.20%，n=6），respectively. There was no statistical significance in the content determination of 4 components between 2 kinds of methods （P>0.05）. CONCLUSIONS：Using prepared reference extract of S. japonica as reference，established method is simple and reproducible，and can be used for simultaneous determination of 4 components in S. japonica and quality control of S. japonica decoction piece.KEYWORDS Sophora japonica；Reference extract；Preparation；HPLC；Flavonoids；Content determination對照提取物是三大类中药标准物质（中药化学对照品、对照药材、对照提取物）之一，为非单体成分的对照物[1-3]。