猪细小病毒感染与疫苗免疫猪鉴别诊断的研究

ＩＮＳＰＥＣＴＩＯＮ　ＡＮＤ　ＱＵＡＲＡＮＴＩＮＥ　ＳＣＩＥＮＣＥ　检验检疫科学Ｖｏｌ．１７ Ｎｏ．３ ２００７年第３期好表达了Ｎ蛋白，为进一步研制出ＥＣＶ诊断试剂盒奠定了基础。

虽然，马冠状病毒病不属于世界动物卫生组织（ＯＩＥ）规定的一、二类传染病，但其危害依然存在，国外也有该病的报道［１，２］　。

目前，姜炎、顾炳泉等人建立了有效的ＲＴ－ＰＣＲ诊断方法［８］，可以检测马的粪便和病料中ＥＣＶ。

本研究用现代生物技术，通过原核和真核系统分别表达了ＥＣＶ－Ｎ抗原，能从免疫学水平对ＥＣＶ检测，为将来建立一种特异快速的ＥＣＶ诊断方法提供了技术，具有良好的应用前景。

参考文献［１］　Ｇｕｙ　Ｊ　Ｓ，Ｂｒｅｓｌｉｎ　Ｊ　Ｊ，Ｂｒｅｕｈａｕｓ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ａ　ｄｉａｒｒｈｅｉｃ　ｆｏａｌ［Ｊ］．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９７５，３８（１２）：４５２３～４５２６．［２］ Ｈｕａｎｇ　Ｊ　Ｃ　Ｍ，　ＷｒｉｇｈｔＳＬ，　Ｓｈｉｐｌｅｙ　Ｗ　Ｄ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ－ ｌｉｋｅ　ａｇｅｎｔ　ｆｒｏｍ　ｈｏｒｓｅｓ　ｓｕｆｆｅｒｉｎｇ　ｆｒｏｍ　ａｃｕｔｅ　ｅｑｕｉｎｅ　ｄｉａｒｒｈｅａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．ＶｅｔＲｅｃ，１９８３，１１３：２６２～２６３．［３］顾炳泉，张常印，李建，等．马冠状病毒研究进展［Ｊ］．检验检疫科 学，２００５，１５（２）：６０～６２．［４］　顾炳泉，南京农业大学硕士论文．２００６．［５］　萨姆布鲁克（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．），等著．分子克隆实验指南［Ｍ］．黄培 堂等译．北京：科学出版社，２００２，第三版．［６］　许金俊，秦爱建，刘岳龙，等．奶牛γ－干扰素基因克隆及其在大 肠杆菌中表达［Ｊ］．扬州大学学报（农业与生命科学版），２００３，２４ （１）：５～９．［７］孔桂美，许金俊，秦爱建，等．重组鸡γ－干扰素在昆虫细胞中的 高效表达［Ｊ］．微生物学报，　２００５，４５（５）：６９７～７１１．［８］　姜焱，顾炳泉，张常印，等．马冠状病毒检测试剂盒的研制［Ｊ］． 动物医学进展，２００５，２６（８）：９８～１００．猪细小病毒感染与疫苗免疫猪鉴别诊断的研究李红超１，２，卿柳庭２，周 锐２，金梅林２（１．番禺出入境检验检疫局，广东番禺，５１１４００；２．华中农业大学动物医学院，湖北武汉，４３００７０）摘 要：采用大肠杆菌表达的猪细小病毒非结构ＮＳ１蛋白为抗原，建立了ＰＰＶ－ＮＳ１－ＥＬＩＳＡ。

通过检测９１份健康猪血清确定其阴、阳性界限为０．２３，以传统的ＨＩ作标准，该方法有高特异性（１００％）、高敏感性（８８％）、高精确度（９０％）。

批内、批间重复试验的变异系数均低于１０％。

该方法只与ＰＰＶ感染猪的血清反应，与ＰＰＶ灭活苗免疫猪的血清不反应，与猪生殖与呼吸综合症病毒（ＰＲＲＳＶ）、伪狂犬病毒（ＰＲＶ）、口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）、弓形虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、衣原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、胸膜肺炎（ＡＰＰ）阳性血清无交叉反应。

证明ＰＰＶ－ＮＳ１－ＥＬＩＳＡ检测方法能够区分ＰＰＶ感染猪和灭活苗免疫猪。

关键词：猪细小病毒；非结构蛋白 ；ＥＬＩＳＡ中图分类号：Ｓ８５２．６１ 前言猪细小病毒病是因感染猪细小病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，　ＰＰＶ）所致，是导致猪ＳＭＥＤＩ综合症的主要疾病之一。

ＰＰＶ主要引起猪繁殖障碍，还可致皮炎和腹泻，与２型圆环病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ　ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　２，　ＰＣＶ　２）协同感染是导致断奶仔猪多系统衰竭综合症（ｐｏｒｃｉｎｅｐｏｓｔｗｅａｉｎｇ　ｍｕｌｉｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｗａｓｔｉｎｇ　ｓｙｎｄｏｍｅ，　ＰＭＷＳ）的主要原因之一。

ＰＰＶ呈世界性分布，给全球养猪业造成巨大的、持续的经济损失［１￣３］。

接种ＰＰＶ灭活疫苗是控制ＰＰＶ感染行之有效的措施［４￣６］。

接种灭活苗免疫的猪，呈结构蛋白抗体阳性，非结构蛋白抗体阴性，用现行的血清学诊断方法不能将其与ＰＰＶ感染猪区分开来，因此，建立一个敏感性高、特异性强、简单快速、易于操作、经济适用，能区分ＰＰＶ灭活疫苗免疫猪与野毒感染猪的诊断方法有重要意义。

本研究利用大肠杆菌表达的细小病毒非结构ＮＳ１蛋白为抗原，建立了ＰＰＶ－ＮＳ１－ＥＬＩＳＡ，以区别灭活苗免疫猪和自然感染猪。

现将试验结果报告如下。

２ 材料与方法２．１ 材料２．１．１ 表达细小病毒非结构ＮＳ１蛋白的重组大肠杆菌表达细小病毒非结构ＮＳ１蛋白的重组大肠杆菌由华中农业大学卿柳庭博士构建。

２．１．２ 血清　采自华中农业大学试验猪场的健康未免疫细小病毒疫苗猪场血清９１份、阴性血清１０份、灭活疫苗免疫血清２１３份、感染阳性血清５０份由华中农业大学动物病毒室提供。

２．１．３ 试剂包被液、洗涤液、血清稀释液、底物液、终止液由华中农业大学动物病毒室配制。

２．２ 试验方法２．２．１ 细小病毒非结构ＮＳ１蛋白的表达与纯化［７］表达细小病毒非结构ＮＳ１蛋白的重组大肠杆菌. 6 .检验检疫科学　ＩＮＳＰＥＣＴＩＯＮ　ＡＮＤ　ＱＵＡＲＡＮＴＩＮＥ　ＳＣＩＥＮＣＥ２００７年第３期 Ｖｏｌ．１７ Ｎｏ．３. 7 .３７℃培养至对数生长期时ＯＤ６００＝０．６，加ＩＰＴＧ至终浓度０．４ｍｍｏｌ／Ｌ，进行３ｈ的诱导表达，８０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，收集细菌，将收集的菌体用１／１０培养液体积含１％Ｔｒｉｎｔｏｎ－Ｘ１００的缓冲液Ａ（５０ｍｍｏｌ／ｌ　Ｔｒｉｓ－ｃｌ　ｐＨ８．０，０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０，　５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ，　０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ，５％甘油）悬浮后，室温静置０．５ｈ，用超声波充分破碎。

破碎的溶液经１万ｒ／ｍｉｎ，离心１２ｍｉｎ，收集沉淀，弃上清。

沉淀用１／１０培养液体积含０．２％ＤＯＣ（脱氧胆酸钠）的缓冲液Ａ悬浮，置室温静置０．５ｈ，１万ｒ／ｍｉｎ，离心１２ｍｉｎ，收集沉淀，弃上清。

沉淀用１／１０培养液体积含０．３％十二烷基基胺酸钠的缓冲液Ａ悬浮，置室温静置１．５ｈ至包涵体完全溶解。

然后经１万ｒ／ｍｉｎ，离心１２ｍｉｎ后，弃沉淀（含细胞碎片），收集上清，加入终浓度为０．２％聚乙二醇４０００（ＰＥＧ４０００），１ｍｍｏｌ／Ｌ氧化型谷胱甘肽和２ｍｍｏｌ／Ｌ还原型谷胱甘肽，置４℃过夜，最后用１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＴＥ（ｐＨ８．０）透析２～３ｄ，每天换液３～４次。

紫外分光光度计测定蛋白浓度。

２．２．２ ＰＰＶ－ＮＳ１－ＥＬＩＳＡ方法的建立采取方阵滴定的方法取酶标板（８×１２），横排将抗原从１：１０、１：２０、１：４０稀释到１：１２８０，竖排将血清从１：１０、１：２０、１：４０直到１：３２０。

以阳性ＯＤ６３０ｎｍ值／阴性ＯＤ６３０ｎｍ值（Ｐ／Ｎ值）最大的孔所对应的抗原包被浓度和血清稀释度为最佳抗原包被浓度和血清稀释度。

ＰＰＶ－ＮＳ１－ＥＬＩＳＡ阴、阳性界限的确定：采自华中农业大学试验猪场的健康未免疫细小病毒疫苗猪场血清９１份，进行ＮＳ１－ＥＬＩＳＡ检测全为阴性，计算该９１份血清的平均值Ｘ，标准偏差ＳＤ，阴、阳性界限计算公式Ｘ　＋３ＳＤ。

２．２．３ ＰＰＶ－ＮＳ１－ＥＬＩＳＡ重复性检测取３批不同批次的抗原包被板检测８份不同ＰＰＶ－ＮＳ１抗体阴性、阳性血清，计算批间变异系数。

取同批次的抗原包被板检测８份不同ＰＰＶ－ＮＳ１抗体阴性、阳性血清，各重复检测８次，计算批内变异系数。

２．２．４ ＰＰＶ－ＮＳ１－ＥＬＩＳＡ特异性与敏感性检测用ＰＰＶ－ＮＳ１－ＥＬＩＳＡ方法分别检测细小病毒经典抗体检测方法血凝抑制试验ＨＩ测定的阴性血清１０份、感染阳性血清５０份。

与血凝抑制试验（ＨＩ）比较来确定该ＥＬＩＳＡ诊断方法的特异性、敏感性与符合率。

该ＥＬＩＳＡ诊断方法具体的各项指标按测定物为阳性或阴性的血清组成＂血清盘＂进行比较，见表１。

被评价试剂ＥＬＩＳＡ的各项性能指标按以下分式计算：灵敏度（％）＝ａ／（ａ＋ｃ）×１００％特异性（％）＝ｄ　／（ｂ＋ｄ）×１００％符合率（％）＝（ａ＋ｄ）／（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）　×１００％此外，用ＰＰＶ－ＮＳ１－ＥＬＩＳＡ方法分别检测猪生殖与呼吸综合症病毒（ＰＲＲＳＶ）、伪狂犬病毒（ＰＲＶ）、口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）、弓形虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、衣原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、胸膜肺炎（ＡＰＰ）特异性阳性血清各１份及已知ＰＲＲＳＶ、ＰＲＶ、ＡＰＰ阳性血清各９份，观察ＰＰＶ－ＮＳ１－ＥＬＩＳＡ的特异性。

２．２．５ ＰＰＶ－ＮＳ１－ＥＬＩＳＡ的临床应用用此ＥＬＩＳＡ方法对免疫细小病毒灭活疫苗１个月后采集的２１３份血清进行检测。

进一步探讨ＰＰＶ－　ＮＳ１－ＥＬＩＳＡ能否区分ＰＰＶ灭活疫苗免疫猪和ＰＰＶ感染猪。

３ 结果与分析３．１ ＰＰＶ－ＮＳ１－ＥＬＩＳＡ检测方法的建立用表达蛋白从１：１０开始进行倍比稀释包被ＥＬＳＩＡ板，进行方阵滴定检测。

在血清稀释液中加入４％空白对照菌裂解液，以降低血清的非特异性反应。

３次方阵滴定试验的结果表明，当血清的稀释倍数为１：２０，抗原的稀释度为１：８０（ＰＰＶ－ＮＳ１蛋白含量为１μｇ／ｍＬ）时，Ｐ／Ｎ等于２２．７１４，为最大，因此，包被抗原的浓度定为１μｇ／ｍＬ，血清稀释度为１：２０，羊抗猪ＩｇＧ－ＨＲＰ的工作浓度为１：５０００。

ＰＰＶ－ＮＳ１－ＥＬＩＳＡ阴阳界线的确定：经对９１份ＰＰＶ阴性血清进行检测，求得其平均值ｘ＝０．１３７；标准偏差ＳＤ＝０．０２９９；确定阴阳性临界点为Ｘ±３ＳＤ＝０．１３７＋３×０．０２９９＝０．２３。

即待测样品的ＯＤ６３０大于０．２３则为阳性，小于或等于０．２３则为阴性。

３．２ ＰＰＶ－ＮＳ１－ＥＬＩＳＡ重复性检测通过重复性检测试验，批间重复的变异系数在２．８％～８．３％之间，批内重复变异系数在４．３％～９．６％之间，说明本ＥＬＩＳＡ方法的重复性良好。

３．３ ＰＰＶ－ＮＳ１－ＥＬＩＳＡ特异性与敏感性选择ＯＩＥ认可的检测方法：血凝抑制试验（ＨＩ）与本研究建立的ＥＬＩＳＡ诊断方法二者相比较来确定该ＥＬＩＳＡ诊断方法的诊断特异性、敏感性与符合率，见表２。

注：表中ａ为真阳性，ｂ为假阳性，ｃ为假阴性，ｄ为真阴性。

　表１ 血清盘受检试剂结果 ＋ ａ ｂ ａ＋ｂ － ｃ ｄ ｃ＋ｄ合计　ａ＋ｃ ｂ＋ｄ ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ 血凝抑制　结果 合计 ＋ －　表２ ＰＰＶ－ＮＳ１－ＥＬＩＳＡ特异性、敏感性与符合率试验ＰＰＶ－ＮＳ１－ＥＬＩＳＡ结果 ＋ ４４ ０ ４４ － ６ １０ １６ 合计 ５０ １０ ６０ 血凝抑制结果 合计 ＋ －ＩＮＳＰＥＣＴＩＯＮ　ＡＮＤ　ＱＵＡＲＡＮＴＩＮＥ　ＳＣＩＥＮＣＥ　检验检疫科学Ｖｏｌ．１７ Ｎｏ．３ ２００７年第３期此结果显示：ＰＰＶ－ＮＳ１－ＥＬＩＳＡ敏感性为：４４／５０×１００％＝８８％，特异性为：１０／１０×１００％＝１００％，符合率为：（４４＋１０）／６０×１００％＝９０％。