猪细小病毒疫苗研究进展
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吕建强等:诺细 、痈毒疫苗研究进展
猪细小病毒疫苗研究进展
吕建强,陈焕春 ,赵傻龙
(华中农业大学畜牧兽医学院,湖北武汉430g?0)
中圈分类号:¥852.659.2+¥858.292 文献标识码:A 文章编号:tO07—5038(2002)01 003l一距
摘要:猪细小病毒是 I起猪繁殖障碍的主要
病原之一,在世界范围内造成了巨大的经济损
失。本文就常规疫苗、免疫程序及新型疫苗的研
究作了综述,特别是猪细小病毒VP2基因在基
因工程疫苗及核酸疫苗方面的应用前景的介
绍,对其深入的研究甚有参考价值
关键词:猪细小病毒;疫苗
自l966年发现和证实猪细小病毒(porcine par—
vovirus,PPV)的存在及致病性以来,国内外学者对其
进行了广泛深入的研究,发现其为单链线状DNA病
毒,对外界理化因素具有很强的抵抗力,主要引起怀孕
母猪流产,产死胎,胎儿术乃伊化等,在世界范围内广
泛分布,给养猪业造成了巨大的经济损失。同其它许多
病毒病的防制一样,该病也主要以免疫预防为主,由于
PPV血清型单一及其高免疫原性,使得疫苗接种成为
控制PPV感染的一种行之有效的方法,本文就其疫苗
研究综述如下:
1弱毒疫苗
最早发现和应用于临床的是PPV NADL一2弱毒
株,该毒株是将PPV强毒在实验室利用细胞培养连续
传代5O次以上致弱的,分子生物学研究证实,该毒株的
基因组比强毒株PPV NADL一8在VP2基因上少300
bp一 。临床实验证实,血清学阴性的怀孕母猪口服或鼻
内接种NADL一2株,尽管有病毒血症存在,却不引起胎
儿感染;若将该毒株经子宫内接种,可引起胎儿感染,从
而导致繁殖障碍 日本学者Fujisakl等将PPV野毒在
猪肾细胞上低温(30℃)连续传54代,产生了HT变异
株,该毒株接种猪后不产生病毒血症,但能诱导产生高
滴度的抗体和较强的免疫力 。]。在此基础上,Akihiro
等将HT株在猪肾细胞上培养并用紫外线照射后传代,
获得了安全性更好的HT—SK—C株,利用设毒株生产的
弱毒疫苗已在日本商品化。我国学者对PPV弱毒苗也
进行了研究,蒋玉雯等从广西初产母猪所产死胎脏器
中,分离出一株PPV自然弱毒株。用该毒檬接种PPV
收稿日期}2001—06—18 *通讯作者
作者筒介:吕建强(1975一),男,华中农业太学畜牧兽医学院动
轴病毒室在读博士。 HI抗体阴性的4月龄猪和怀孕l4~23 d的后备母猪,
结果不产生病毒血症,母猪分娩正常,所产小猪吃奶前
HI抗体阴性。另外,免疫的怀孕母猪用强毒株攻击后
49 d剖杀,胎儿发育正常,胎心采血HI抗体阴性,取胎
儿脏器进行组织培养也未分离出病毒,而对照猪攻毒
后产生了病毒血症并导致繁殖障碍,从胎儿脏器中分
离出PPV: 。尽管已有多株弱毒疫苗在临床上应用.
但是由于PPV强毒株的大量存在,人们对病毒重组及
弱毒返强的担心一直使弱毒苗的应用受到一定限制
2灭活疫苗
2.1单价灭活疫苗
自l976年国外就有关于PPV灭活疫苗的研究报
道,并于80年代在美国、澳大利亚、法国等国家普遍应
用。在我国,潘雪珠等研制成功PPV灭活疫苗之后.韩
孝成等、肖驰等、邬捷等、吕建强等也先后研制出PP\
灭活疫苗。PPV灭活疫苗的研制中,应用的灭活剂响
福尔马林、 丙内酯( PL)、AEI(N一乙酰乙烯亚胺)以
及BEI(二乙烯亚歧)等 Fujisaki用福尔马林灭活病毒
制成的疫苗,免疫动物诱导产生了较高的抗体滴度.但
保护效果不理想;潘雪珠比较了福尔马林和AEI的灭
活效果,证实AEI优于福尔马林+Joo等用 丙内酯灭
活的疫苗,可使猪产生的抗体至少持续4十月以
上Ⅱ 。免疫佐剂是影响PPV灭活疫苗效果的重要因
素,Moliter等比较了l3种不同佐剂用于PPv灭活疫
苗的效果,结果发现5O 氢氧化铝胶,顺丁烯乙酰
(EMA)、CP一20961(Avridin),油水乳剂及dimethyl—
dioctadecy]一ammonium bromide(DDA)作佐剂的疫
苗,均诱导猪产生了高滴度的抗体,而用油佐剂、SDS、
L 121、氢氧化铝和油乳剂混合物、SDS和氢氧化铝混
合物作佐剂的疫苗产生的抗体滴度均较僻 。目前在
PPV灭活苗的制备中,经常采用的佐剂是氢氧化铝和
油水乳剂。
2.2灭活二联疫苗
PRV.PPV和JEV病均是引起母猪繁殖障碍的主
要疾病,研制出灭活多联疫苗可以简化免疫程序.降低
临床应激反应,适合规模化养猪业的发展趋势。Men—
geling等将通过细胞培养增殖的PPV和PRv,用AEI
在37℃灭活后混合,加入l0 的Al(OH)3制成灭活
二联疫苗用于免疫预防试验。l6头后备母猪进行两次 维普资讯 http://www.cqvip.com 32 动物医学进展2002年第23卷第1期(总第】】7期)
免疫,问隔期为2周,8头母猪在妊娠后9周用PRV
攻击,8头母猪在妊娠后6周用PPV攻击,然后分别在
第13周和12周宰杀.观察保护情况。结果发现.1 6头
母猪均未发生繁殖障碍,趴胎儿体内未检出PRV和
PPv 对免疫母猪的血清学检测结果证实,经二次免疫
后,母猪的PRV中和抗体和PPV HI抗体滴度.与采
用单苗免疫的抗体水平相当或稍商.从而说明PRV—
PPV灭活二联疫苗具有良好的免疫保护作用一 。井出
诚弥等曾用PPV和JEv二种病毒的弱毒疫苗混合后
免疫母猪,产生的PPV和JEV抗体水平分别与相应
单苗的相同。国内邬捷等用PPV灭活苗与JEV灭活
苗混合或同时免疫后备母猪均取得了满意的效果。姜
天童等利用幼龄胎猪生产PPV、利用小鼠增殖JEV
后,分别灭活制成灭活二联疫苗,通过二联苗和单联苗
比较试验显示,二联苗与两种单苗免疫猪产生的PPV
和JEv抗体水平无显著差异一 1。_。以上试验均证实两
种病毒抗原同时刺激机体没有相互干扰作用。
3 PPV疫苗的免疫程序
在早期的研究报告中,PPV疫苗的免疫均为间隔
2~3周二次注射,随着疫苗生产工艺的改进,许多学
者发现一次免疫注射也能达到良好的效果,免疫后的
后备母猪在妊娠40 d时用强毒攻击,可以获得完全保
护 此外,Edwards等认为PPV疫苗只能用于没有母
源抗体的猪,因为在田间条件下母源抗体可能在不同
程度上干扰疫苗的效果。Paul等发现猪群在接种PPV
灭活苗时,母源抗体水平低的猪与血清学阴性猪的免
疫应答完全一样,而中等水平的母源抗体对疫苗免疫
有轻微干扰作用.高效价抗体对疫苗有明显干扰作
用ll 。吕建强等进行了PPV母源抗体对灭活疫苗免
疫效果影响的研究,结果证实不论母源抗体水平高低
均不会明显抑制疫苗的主动免疫反应,但是具有低效
价母源抗体猪的主动免疫抗体反应规律,与具有高效
价母源抗体猪的主动免疫抗体反应规律不同。在母源
抗体滴度太于1:149 5时,灭活疫苗接种后抗体水平
先降低然后上升,升幅只有1~3倍}而母源抗体小于1
#25.6时.主动免疫抗体持续上升,母源抗体阴性的
猪抗体增幅最大。根据PPV的流行病学特点,仔猪吃
奶后2~3 d即可在血液中检测到母源抗体,井于8~
14 d达到高峰,母源抗体可持续20 ̄24周,因此PPV
疫苗的免疫接种时间应选择在20周左右
4新型疫苗展望 ‘
尽管PPV的弱毒苗和灭活苗在猪细小病毒病的
预防控制中起到了十分重要的作用,但是各种疫苗均
有不同程度的缺陷和不足,如弱毒疫苗发生重组及毒
力返强的潜在威胁,以及灭活疫苗免疫效果不稳定等。
因此,寻找和发展更为安全有效的疫苗一直是猪细小 病毒病免疫预防研究的主题
4.1基因工程亚单位疫苗
Martinez等将PPV vP2基因克隆到杆状病毒表
达系统中,并成功地在昆虫细胞中高效表达.表达的
VP2多肽能自我装配成类病毒粒子(Virus—Like Parti—
ties,VLPs).用其免疫母猪能诱导产生免疫应答u :
尽管未见有关设种疫苗进一步研究和应用的撤导,但
是VP2基因在体外表达的蛋白能自我包装成类病毒
粒子的特性,为重组多价亚单位疫苗的研究打下厂基
础。
4.2基因工程多价亚单位疫苗
Sedlik等将PPV VP 和包含淋巴细胞脉络丛脑
炎病毒(LCMv)的l18—132位氨基酸的抗原决定簇区
相连,然后克隆于杆状病毒表达载体PACYM,转染表
达PPV:vP 一LCMv蛋白.利用该重组蛋白免疫鼠可
以诱导强烈的CTL反应,在体内持续时间长达9个
月,并可抵抗致死量的LcMV攻击 之后,Sedlik又将
LCMv的CD8 T细胞抗原决定簇多肽共价结合于1
Ⅻn的脂质微球上.与上述表达的PPV:VP 一I CM\ 蛋
白一起进行了免疫小鼠的比较,结果发现二者都能诱
导产生很强的CD8 T细胞反应。但是PPV:VPr
I CMV携带的抗原量比脂质体微球少10O倍时,诱导
的cTL活性们比脂质体微球诱导的CTL活性高6
倍,并且只有PPV:VP:一LcMV免疫的小鼠能抵抗致
死量的LcMV的攻击“ “一 Richard等用pPV VP!
共价结合乙肝病毒HBSAg的抗原决定簇区多肽,然
后免疫小鼠诱导产生了很强的针对插人的HBSAg决
定簇的T细胞反应,井能抵抗己肝病毒的致死性攻
击。这些结果均说明PPV VP2类病毒粒子.作为一种
抗原的转运载体具有很大的潜在价值,并为进行多价
重组疫苗的研究创造了良好的条件。
PRV和PPV在临床上经常混合感染的现象已有
报导+因此研制出这二种病毒的重组疫苗对生产实践
也具有重要意义。PRV属于疱疹病毒科a疱疹病毒砸
科的猪疱疹病毒I型.该病毒基因组是双链线状的
DNA.大小约为1 50 khp,含有多个可缺失的非必需基
因,插人外源基因容量可达2O kbp 易于进行基因操
作,因此具有作为病毒载体的必要条件 迄今为止.国
内外用PRV作基因表达载体己成功表达了1O多种外
源目的基因 如z【】I等最早实现了病原保护性抗原基
因在伪狂犬病毒中的表达,他们将猪瘟病毒(HCV)的
囊膜蛋白基因EI插人到gG启动子的下游,构建厂几
株表达E1的重组伪狂犬病毒;将这些重组病毒进行动
物试验,结果接种重组病毒的猪均能产生对HCV
PRV的高滴度中和抗体.并可保护猪免受PRV、HCV
的强毒攻击 一
国内.王家富等构建了携带猪瘟病毒 维普资讯 http://www.cqvip.com