青链霉素混合液(100×)使用说明

青蒿素类药物对结肠腺癌细胞LS174T的细胞毒作用目的考察青蒿素（ART）、双氢青蒿素（DHA）及蒿甲醚（AM）对结肠腺癌细胞LS174T增殖的影响，为建立青蒿素类药物自身诱导代谢机制的体外研究体系奠定基础。

方法采用噻唑蓝（MTT）法检测不同浓度药物、分别作用不同时间后对细胞增殖的抑制情况，计算抑制率并求得半数抑制浓度（IC50）。

结果抑制率均随药物浓度的增大和时间的延长而增加，ART作用24、48、72 h对LS174T的IC50分别为> 240.00 μmol/L、> 240.00 μmol/L、211.18 μmol/L，DHA 对LS174T的IC50分别为91.46、80.45、45.60 μmol/L，AM对LS174T的IC50分别为> 320.00、262.90、163.93 μmol/L。

结论3种药物对LS174T增殖的抑制程度不同，但均呈浓度依赖性和时间依赖性。

标签：噻唑蓝；青蒿素；双氢青蒿素；蒿甲醚；LS174T青蒿素（ART）是一种含独特内过氧桥结构的倍半萜内酯，由我国科学工作者从菊科植物黄花蒿中提取分离。

对其进行结构改造得到一系列衍生物，其中双氢青蒿素（DHA）是除ART外其他衍生物在体内的活性代谢产物[1]。

蒿甲醚（AM）是ART的醚类衍生物，其抗疟作用强于ART，不良反应轻微，且具有退热效应[2]。

ART类药物是目前唯一一类未产生明显耐药性的抗疟药，因而广泛用于疟疾特别是恶性疟疾的治疗，此外还有抗炎、抗肿瘤、抗心律失常、抗病毒、免疫抑制、抗血吸虫等药理作用[2-3]。

噻唑蓝（MTT）法是一种检测细胞存活和生长的方法，该法灵敏度高，重复性好，操作简便、经济、快速[4]。

本课题采用MTT法测定上述3种药物对结肠腺癌细胞LS174T增殖的影响，观察不同浓度药物以及作用不同时间的细胞毒作用。

实验结果将为后期从基因水平阐释ART类药物对CYP3A4和CYP2B6转录调节作用提供参考浓度，同时也为研究ART类药物抗癌活性提供依据。

细胞融合一、实验材料手术剪，镊子，离心机，蜡盘等。

二、实验所配试剂1640基础培养液：取一包1640干粉，溶于1000 mL双蒸水中，慢慢加入2.5 g NaHCO3，0.22 μm滤膜过滤除菌，分装，4℃冰箱保存备用。

青链霉素溶液（100×）：取青霉素100万单位和链霉素1 g，无菌溶于100mL已灭菌的三蒸水中，0.22 μm滤膜过滤除菌，1 mL/管分装，-20℃冻存备用。

1640完全培养液：向1640基础培养液中加入10％的小牛血清和1%青链霉素溶液（100×）（为养成良好的操作习惯，建议不加最好），摇匀，4℃冰箱保存备用。

HT培养液：在100 mL含15%血清的1640完全培养液中加入1 mL 100×的HT溶液，摇匀，4℃冰箱保存备用。

HA T培养液：在100 mL含15%血清的1640完全培养液中加入2 mL 50×的HA T溶液（使用前HA T有部分白色沉淀应充分混匀），摇匀，4℃冰箱保存备用。

GNK溶液：准确称取KCL 0.4g ，NaCL 8g ，Na2HPO4·2H2O 1.77g(Na2HPO4·12H2O 3.56g)，NaH2PO4·H2O 0.69g(NaH2PO4·2H2O 0.78g)，酚红0.01g，葡萄糖2g，加DDW 定容至1000mL，调节pH 值至7.2，115℃高压灭菌，4℃保存备用。

三、实验步骤1.免疫小鼠选择6-8周龄的Balb/c雌性小鼠进行免疫，免疫剂量50μg/只，皮下注射。

免疫程序如下：首次免疫：100μL抗原+100μL弗氏完全佐剂/只加强免疫：100μL抗原+100μL弗氏不完全佐剂/只，于首免后2周后进行。

共免疫3次，每次间隔2周。

第二次免疫后的第十天断尾采血（一般尾部采血4μL，溶于200μL PBS混匀备用）检测效价，如果效价很低或没有效价，建议直接放弃，不用继续再免疫。

细胞融合一、实验材料手术剪，镊子，离心机，蜡盘等。

二、实验所配试剂1640基础培养液：取一包1640干粉，溶于1000 mL双蒸水中，慢慢加入2.5 g NaHCO3，0.22 μm滤膜过滤除菌，分装，4℃冰箱保存备用。

青链霉素溶液（100×）：取青霉素100万单位和链霉素1 g，无菌溶于100mL已灭菌的三蒸水中，0.22 μm滤膜过滤除菌，1 mL/管分装，-20℃冻存备用。

1640完全培养液：向1640基础培养液中加入10％的小牛血清和1%青链霉素溶液（100×）（为养成良好的操作习惯，建议不加最好），摇匀，4℃冰箱保存备用。

HT培养液：在100 mL含15%血清的1640完全培养液中加入1 mL 100×的HT溶液，摇匀，4℃冰箱保存备用。

HAT培养液：在100 mL含15%血清的1640完全培养液中加入2 mL 50×的HAT溶液（使用前HAT有部分白色沉淀应充分混匀），摇匀，4℃冰箱保存备用。

GNK溶液：准确称取KCL 0.4g ，NaCL 8g ，Na2HPO4·2H2O 1.77g(Na2HPO4·12H2O 3.56g)，NaH2PO4·H2O 0.69g(NaH2PO4·2H2O 0.78g)，酚红0.01g，葡萄糖2g，加DDW 定容至1000mL，调节pH 值至7.2，115℃高压灭菌，4℃保存备用。

三、实验步骤1.免疫小鼠选择6-8周龄的Balb/c雌性小鼠进行免疫，免疫剂量50μg/只，皮下注射。

免疫程序如下：首次免疫：100μL抗原+100μL弗氏完全佐剂/只加强免疫：100μL抗原+100μL弗氏不完全佐剂/只，于首免后2周后进行。

共免疫3次，每次间隔2周。

第二次免疫后的第十天断尾采血（一般尾部采血4μL，溶于200μL PBS混匀备用）检测效价，如果效价很低或没有效价，建议直接放弃，不用继续再免疫。

流感病毒分离标准操作规程(SOP)病毒分离分离病毒是诊断病毒性疾病最常用,并且高度敏感的方法之一。

分离出的病毒须经免疫学、基因分析或电子显微镜等进一步鉴定确诊。

病毒可长期保存,亦可用来作抗原性、基因特性或药物敏感性等分析。

病毒分离亦受一定限制。

目前用于分离病毒的组织细胞种类有限,每种细胞只能用来分离培养一或数种病毒。

MDCK(狗肾细胞)是目前用于分离培养流感病毒最常用的细胞系。

分离流感病毒最常用的活体是鸡胚,目前有些实验室用MDCK细胞代替鸡胚分离培养流感病毒。

由于MDCK细胞属肿瘤细胞系,故用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。

各实验室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒,不应放弃用鸡胚分离病毒的方法。

流感病毒细胞分离标准操作规程材料:1、细胞瓶或细胞管培养成片的MDCK细胞2、TPCK处理胰酶(牛胰腺来源XIII型)Sigma Cat. # T-86423、HEPES 缓冲液, 1 M 母液GIBCO BRL Cat. # 15630-0234、D-MEM培养基,GIBCO BRL Cat. # 11965-0925、青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素G; 10,000 μg/ml 硫酸链霉素) ,GIBCO BRL Cat. # 15140-0236、牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液,GIBCO BRL Cat. # 15260-0117、放置于2ml wheaton 小瓶中的临床样品8、T-25培养瓶用于病毒培养,(组织培养管也可被应用,若样本量大的话应选用培养瓶,细胞数量按规定调整。

)9、1ml 滴管10、10ml 滴管培养基和试剂的准备:(建议:要求经常检查试剂使用的有效期)500 ml D-MEM液中加入:青、链霉素母液5 ml (终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 100 μg/ml 链霉素) 牛血清白蛋白12.5 ml (终浓度: 0.2 %)HEPES缓冲液12.5 ml (终浓度: 25 mM)病毒生长液:每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶(母液浓度为2mg/ml )使TPCK-胰酶的浓度为2 μg/ml。