木质素降解菌Ceriporiopsis subvermispora的研究进展

生物降解木质素研究新进展张辉1,戴传超2,朱奇1,杨启银2　(1.聊城大学生命科学学院,山东聊城252059;2.南京师范大学生命科学学院,江苏南京210097)摘要　对降解木质素的微生物种类、木质素降解酶的理化性质、营养调控、分子生物学研究和应用方面的研究进展进行了综述。

关键词　木质素;生物降解;木质素降解酶;分子生物学;应用中图分类号　Q948.12+.3 文献标识码　A 文章编号　0517-6611(2006)09-1780-05R esearch Advances in the Biodegrad ation of LigninZH ANG H ui et al　(Sch ool of Life Science,Liaocheng University,Liaocheng,Shand ong252059)Abstract　Research advances in the biodegradation of lignin including lignin2degrading m icroorganisms,physical and chem ical characters of enzym es,nu2 trition regulation of producing enzym es,m olecular biological research and application of lignin2degrading enzym es were reviewed in the paper.K ey w ords　Lignin;Biodegradation;Lignin2degrading enzym es;M olecular biology;A pplication 木质素是由苯丙烷单元通过醚键和碳碳键连接而成的聚酚类三维网状高分子芳香族化合物,结构复杂,分子量大,是自然界中仅次于纤维素的最为丰富的有机物。

嗜热厌氧细菌Caldicellulosiruptor bescii降解木质纤维素研究进展储引娣;苏小运【摘要】As a gram-positive anaerobic bacterium isolated from hot spring,Caldicellulosiruptor bescii has strong ability in degrading lignocellulose. It can rapidly grow on a variety of model plant cell wall polysaccharide compounds such as the crystalline cellulose avicel,xylan or even on unpretreated lignocellulose such as switchgrass as sole carbon source. Moreover,this bacterium has an unusual ability of anaerobic degradation of lignin. The genomic annotation showed that most of the proteins encoded by this bacterium were multivariate bi-functional enzymes,i.e.,the N-terminal and C-terminus of the polypeptide chain were glycoside hydrolases of different families,with 2-3 carbohydrate binding domains. The genes encoding enzymes of degrading cellulose were concentrated in a plant cell wall polysaccharide degradation gene cluster,such ascellulase/xylanase,cellulase/mannanase,cellulase/xyloglucanase,etc. The xylanase of C. bescii belonged to the GH10 family,whose specificity of the enzyme was broad,and the homology of the amino acid sequence was between 18.7% and 59.5%. The genus Caldicellulosiruptor evolved a series of mechanisms that allowed glycoside hydrolyses to absorb better to substrates,bacteria and lignocellulose, thereby facilitating the enzymatic hydrolysis of lignocellulose. There were 12 proteins containing SLHdomain,and the newly discovered adhesion protein Tāpirin in C. bescii may be involved in the absorption and utilization of lignocellulose. In this paper we review the current progresses in exploring the genome of C. bescii for novel glycoside hydrolases targeting plant cell wall and the associated molecular mechanisms,which are of great significance for the design and optimization of efficient and multi-function lignocellulose degradation enzymes.%嗜热厌氧菌Caldicellulosiruptor bescii具有强大的木质纤维素降解能力,能以多种模式植物细胞壁多糖如微晶纤维素Avicel和木聚糖,甚至未经预处理的木质纤维素如柳枝稷作为唯一碳源快速生长,该菌还具有少见的厌氧降解木质素的能力.对基因组注释发现,该菌所编码的蛋白大多为多结构域双功能酶,即在多肽链的N端和C端分别是不同家族的糖苷水解酶,间隔以2-3个碳水化合物结合结构域.该菌降解纤维素相关的酶基因多集中于一个植物细胞壁多糖降解利用的基因簇,例如纤维素酶/木聚糖酶、纤维素酶/甘露聚糖酶和纤维素酶/木葡聚糖酶等.C.bescii 的木聚糖酶主要属于GH10家族,该家族的酶底物特异性较为宽泛,氨基酸序列的同源性在18.7%-59.5%间.Caldicellulosiruptor属细菌进化出了一系列的机制使得糖苷水解酶和底物、细菌和木质纤维素能更好的吸附在一起,从而有利于木质纤维素的酶解.C.bescii有12个含SLH结构域的蛋白,以及新发现的黏附蛋白Tāpirin,可能参与了木质纤维素的吸附与利用.综述了近年来对C.bescii降解植物细胞壁的糖苷水解酶的基因资源挖掘方面和降解分子机制方面的研究进展,对高效、多功能高效木质纤维素降解酶的设计和优化具有积极的意义.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2017(033)010【总页数】7页(P33-39)【关键词】木质纤维素;嗜热厌氧菌;糖苷水解酶;生物燃料【作者】储引娣;苏小运【作者单位】中国农业科学院饲料研究所,北京 100081;中国农业科学院饲料研究所,北京 100081【正文语种】中文石油和天然气等化石能源消耗量巨大，与国民经济各行各业息息相关，但由于其不可再生的缺陷，使得化石能源逐渐枯竭。

紫外诱变筛选高效木质素降解菌株的研究随着人们对环境保护的要求越来越高，环境污染也成为了一个严重的问题。

木质素是造纸工业废水、生活污水、城市垃圾、农业废物和林业废弃物等生物质残渣中的主要成分，对水资源和环境造成很大的污染。

因此，研究木质素的高效降解机制和菌株，是解决木质素污染的重要途径之一。

本文旨在通过紫外诱变筛选高效木质素降解菌株，探究其降解机制，为解决木质素污染提供一定的理论指导和实践指导。

一、实验原理1.菌种：本实验选用的木质素降解菌株为白腐菌Trametes sp.，在常规培养基下培养并筛选。

2.诱变：通过紫外线照射，诱发白腐菌Trametes sp.的基因突变和突变体的产生。

3.筛选：将紫外线诱变后的白腐菌Trametes sp.转移到含木质素的固体培养基中，筛选木质素降解能力强的菌株。

4.鉴定：通过形态学、生理生化和分子生物学等多种方法对获得的菌株进行鉴定。

二、实验步骤1.白腐菌Trametes sp.的预处理：将白腐菌Trametes sp.预处理于常规培养基上，培养2-3天，并用生理生化方法鉴定其特性。

2.紫外诱变：将预处理的白腐菌Trametes sp.接种在固体VEG培养基中，分别用白炽灯、荧光灯和紫外线照射4h，10h和24h。

用各种灯光下的非照射组作为对照组。

3.筛选：将诱变后的白腐菌Trametes sp.转移到含木质素的固体培养基中，在37℃下静置，观察其生长情况和木质素的降解情况。

4.分离：在含木质素的固体培养基中，挑选降解效果较好的白腐菌Trametes sp.菌株进行单菌落分离。

5.鉴定：通过形态学、生理生化和分子生物学等方法鉴定单菌落的特性，并筛选出木质素降解能力强、生物学特性优良的菌株进行进一步研究。

三、实验结果1.诱变后的白腐菌Trametes sp.生长情况在不同光照下有明显差异。

其中以荧光灯照射24h的白腐菌生长情况较好，而荧光灯照射4h的白腐菌生长情况较差，且繁殖速度缓慢。

2000年 12月河南农业大学学报Dec.　2000第34卷　第4期Journal of Henan Agricultural University V ol.34N o.4文章编号:1000-2340(2000)04-0349-06木质素生物降解研究进展吴坤,张世敏,朱显峰(河南农业大学生物工程学院,河南郑州450002)摘要:评述了木质生物降解的最新研究进展,主要包括木质素的生物降解机制、降解木质素的微生物种类及其产生的相关酶类、微生物的代谢调控和分子生物学.此外,对木质素降解生物的实际应用和应用前景也进行了评论.关键词:木质素;生物降解;秸杆;白腐真菌;环境保护中图分类号:Q591.4 文献标识码:AR ecent research advances on the lignin biodegradationW U K un1,ZH ANG Shi2min2,ZH U X ian2feng2(C ollege of Biological Engineering,Henan Agricultural University,Zhengzhou450002,China)Abstract:A review is given of the m ost recent research advances on the lignin biodegrading,including the mechanism of the lignin2biodegrading,ligninolytic organisms and the Enzymes they secrete,regulation and control of the microbe metabolism and m olecular biology.Finally the practical utilization and the prospects of lignin2biodegrading are dis2 cussed.K ey w ords:lignin;biodegradation;straw;white2rot fungi;environmental protection 绿色植物占地球陆地生物量的95%,其化学物质组成主要是木质素、纤维素和半纤维素,它们占植物干重的比率分别为15%～20%,45%和20%[1].农作物秸杆是这类生物质资源的重要组成部分,全世界年产量为20多亿吨,而我国为5亿多吨.但是,要充分、有效地利用这类资源却相当困难,这是由于秸秆产量随季节变化,且量大、低值、体积大、不便运输,大多数动物都不能消化其木质纤维素,自然降解过程又极其缓慢,导致大部分秸秆以堆积、荒烧等形式直接倾入环境,造成极大的环境污染和浪费.存在于秸秆中的非水溶性木质纤维素很难被酸和酶水解,主要是因纤维素的结晶度、聚合度以及环绕着纤维素与半纤维素缔合的木质素鞘所致.木质素与半纤维素以共价键形式结合,将纤维素分子包埋在其中,形成一种天然屏障,使酶不易与纤维素分子接触,而木质素的非水溶性、化学结构的复杂性,导致了秸秆的难降解性.所以,要彻底降解纤维素,必须首先解决木质素的降解问题.因此,秸秆利用的研究从过去的降解纤维素的研究转向了木质的降解研究,作者对此进行了综述.1　木质素的结构特点木质素是由苯丙烷单元(θ—Cα—Cβ—Cγ)通过醚键和碳碳键联接的复杂的无定形高聚物,难以被酸水解,是天然高聚物中最难搞清楚的一个领域.其原因有两个方面,一是木质素的结构单元之间除醚键联接外还有C-C键;另一方面是不可能把整个木质素分子以其完整状态分离出来[2].典型木质素是由松柏醇(C oniferyl alcohol),芥子醇(Sinapyl alcohol)和对—香豆醇(p2C oumaryl alcohol)这3种不同的醇作为先体结构物质组成基本的结构单元,这些木质素结构单元常常以它们的糖苷形式贮存在细胞中,一旦需要合成木质素,它们便从这些糖苷中释放出来.这些木质素结构单元之间主要是通过醚收稿日期:2000-06-14基金项目:国家科委生物工程中心“九五”攻关项目(962C01202201)作者简介:吴坤(1963-),男,河南平舆人,河南农业大学副教授,在读博士,从事食品加工方面的研究. 350河　南　农　业　大　学　学　报第34卷键和碳碳键的方式联接.醚键包括酚醚键、烷醚键和二芳醚键.在酚醚键中愈创木基2甘油2β2芳基醚键(β2024)数量最多,占酚醚键的1/2左右,其次是愈创木基2甘油2α2芳基醚键(α2024).而木质素的C 2C 键的连接类型主要有β25,β2β,β21,β22和525等形式(图1).图1　木质素C 2C 键的连接类型2　木质素降解微生物的种类在自然界中,能降解木质素并产生相应酶类的生物只占少数.木质素的完全降解是真菌、细菌及相应微生物群落共同作用的结果,其中真菌起着主要作用.降解木质素的真菌根据腐朽类型分为:白腐菌———使木材呈白色腐朽的真菌;褐腐菌———使木材呈褐色腐朽的真菌和软腐菌.前两者属担子菌纲,软腐菌属半知菌类.白腐菌降解木质素的能力尤于其降解纤维素的能力,这类菌首先使木材中的木质素发生降解而不产生色素.而后两者降解木质素的能力弱于其降解纤维素的能力,它们首先开始纤维素的降解并分泌黄褐色的色素使木材黄褐变,而后才部分缓慢地降解木质素.白腐菌能够分泌胞外氧化酶降解木质素,因此被认为是最主要的木质素降解微生物[3,4]. 目前,研究最多的白腐菌有:黄孢厚毛平革菌(Phanerochete chrysosporium )、彩绒草盖菌(Coridus ver si 2color )、变色栓菌(Thametes ver sicolor )、射脉菌(Phlebia ra 2diata )、凤尾菇(Pleurotus pulmononanus )、朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus )等[3,4,5].这些菌多属于担子菌亚门,无隔担子菌亚纲、无褶菌目的多孔菌科.王佳铃等曾评述过1981～1995年间研究报道过的主要高产漆酶白腐真菌(表1)[6].表1　主要的高产漆酶微生物属　名 菌　种　名Polyporus P.ver sicolor ,P.hir sutus ,P.anceps ,P.sanguineus Coriolus (C.ver sicolor ),(C.hir sutus ),C.consor Pleurotus P.ostreatus ,P.sajor 2caju ,P.erynigii ,P.pulmonarius Lentinus L.edodes ,L.tigrinus Pycroporus P.cinnabarinus ,P.sanguineus ,P.coccineus Polystictus P.ver sicolor ,P.sanguineus Ganoderma G.luciolum ,G.valesiocim other s Agaricus bisporus ,Botrytis cinera ,Panus tigrinus ,Irpex lacuts ,Daedalea flavida ,Fomes annos ,Rhizoctonia practicola ,Neurospora crassa ,Lenzites be 2tulina ,Sporotrichum pulerulentum ,Pholiota mutabilis ,Schinus molle ,Sterumpurpureum ,Coprinus congregatus ,Cerrena unicolor ,Ceriporiopsis subvermis 2pora ,Bjerkaradera adusta ,Poliporus pinsitus ,Dichomitus sgualenss ,Pyricu 2laria oryzae ,Fyathus bulleri 褐腐菌的软腐菌中的有些种类也可以分泌一些降解木质素的酶类,但它们分解木质素的能力不是很强,因此,研究报道较少.降解木质素的原核生物以放线菌为主,如链霉菌属(Streptomyces )、节杆菌属(Arthrobaeter )、小单孢菌属(Micromonospora )和诺卡氏菌(Nocardia )等.细菌中有厌氧梭菌(Clostridum xylanoyticum )、假单孢菌(P seudomonas )、不动杆菌(Acineto 2bacter )和芽孢杆菌(Bacillus )等原核生物对于在土壤中木质素的转化和降解具有重要作用,但土壤中木质素的降解据报导是土壤微生物区系多种类型微生物协同进行的结果,而且进程缓慢,单一微生物纯培养的商业用途前景不很清晰,且这类原核生物的多酚氧化酶是胞内酶,这也决定了其在木质素降解菌的研究中处于一个相对从属的地位[5]. 此外,很多植物病原微生物如Rhizoctonia s olani ,R.praticola 等也具有分解木质素的能力,但这类微生物在处理秸秆上的应用前景不大.在木质素降解微生物中,研究得最多最彻底和最具应用前景的是黄孢原毛平革菌.这种微生物的特点第4期吴坤等:木质素生物降解研究进展351 是培养温度高(37℃左右),无性繁殖迅速,菌丝生长快且分泌木质素降解酶能力强,它已经成为研究白腐真菌的一种模式微生物.它的培养条件、代谢调控、分子生物学和遗传学及其在生产实践上的应用等均已被研究的相当仔细[5～8].3　木质素降解酶的种类及特性目前,关于木质素降解酶的研究工作主要集中在白腐菌所产生的酶系.研究得较多,并认为最为重要的木质素降解酶有3种,即木质素过氧化物酶(Lignin peroxidases/LiP)、锰依赖过氧化物酶(Manganese perxi2 dases/MnP)和漆酶(Laccase).LiP,MnP和Laccase只是分别代表一系列的同功酶.但各种微生物所产生的酶的种类和一些理化特性是有所不同的.其中LiP是第一个从黄孢原毛平革菌发现的木质素降解酶,以后又分别从射脉菌,彩绒革盖菌,变色栓菌中发现.Laccase没有在黄孢原毛平革菌中发现,而在Phlebia,Tram2 etes,Coriolus等菌中发现[7～9].木质素的降解酶系是非常复杂的一个体系,很多问题至今还不十分清楚.除了上述3种重要的酶外,其它的一些酶如芳醇氧化酶(AAO)、酚氧化酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶及一些还原酶、甲基化酶和蛋白酶等都参与或对木质素的降解产生一定的影响.LiP和MnP都是带有糖基的胞外血红素蛋白.又称血红素过氧化物酶(Heme Peroxidase),它们在反应中从苯酚或非酚类的苯环上夺取一个电子而使后者形成一个阳离子基团,从而导致木质素分子中主要键的断裂.LiP主要是氧化苯酚使之成为苯氧残基.MnP主要是从Mn2+和H2O2的氧化中得到Mn3+,然后Mn3+氧化苯酚使之成为苯氧残基.而每种酶在木质素降解中的具体作用还不甚清楚[5～7,9].漆酶(Laccase)是含铜的多酚氧化酶,主要来源于生漆和真菌.由于Laccase的含糖量高,难得到X2衍射分析用的漆酶单晶,它的三维空间结构尚不清楚.但已经证实,漆酶中的铜离子在催化氧化反应中起决定作用.根据磁学和光谱性质可将漆酶中的4个铜离子分为3类:Ⅰ型Cu2+和Ⅱ型Cu2+各1个,是单电子受体,呈顺磁性,可以用核磁共振控测;Ⅲ型Cu2+2个,是双电子受体,反磁性,用核磁共振不能检测.Ⅰ型Cu2+呈蓝色,在λ614nm处有特征吸收峰;Ⅱ型Cu2+为非蓝色,没用特征吸收峰;Ⅲ型Cu24+是偶合的离子对(Cu2+…Cu2+),在λ330nm处有宽的吸收峰[6,7,9,10].漆酶在木质素降解过程的机制和作用至今人们还不完全清楚.作为一种多酚氧化酶,它可催化氧化酚类或芳胺类等多种底物的氧化作用.氧化酚或芳胺先失去一个电子生成自由基,后者发生一系列非酶反应,氧化成醌,在有O2存在时,还原态漆酶被氧化,O2还原成水.底物自由基不稳定,可进一步发生键的断裂或生成,导致裂解或聚合反应.因此,底物分子可进一步聚合生成复杂的产物,也可催化芳香环支链Cα2 Cβ键断裂[6,7,10,11].G A LI ANO等发现,当Laccase和MnP分别单独存在时,都不能有效地降解木质素,而2种酶同时存在时则木质素得到有效的降解,这表明2种酶在催化木质素生物降解反应中具有协同作用.此外还发现在反应中加入其它的酶,如葡萄糖氧化酶时,可显著提高木质素的降解程度.他们认为,这是由于Laccase既有解聚,又有聚合木质素的能力,加入葡萄糖氧化酶可通过其还原Laccase氧化多酚产生的醌等阻止木质素的聚合作用,从而提高Laccase的降解能力[6].确定每一种酶在木质素降解过程中的作用和功能是困难的,因为至少目前木质素被微生物所产生的单一胞外酶彻底、完全地催化解聚和降解的情况还没被发现.每一种白腐真菌所产生的都不只是一种能降解木质素的酶,在缺陷任一种酶的体系中木质素仍能够较好的降解,而这些酶之间又相互作用和影响,使其存在于一个协同作用体系中.虽然现在已能用14C标识的合成木质素来研究木质素降解酶在木质素降解中的作用机理,但由于木质素的结构复杂,木质素的彻底降解需依赖微生物区系中多种微生物在较长时间内相互交替的生长繁殖才能完成.4　木质素的降解微生物的酶活性调控机理在白腐菌产酶的培养方式上,研究最多的是液体培养.国内外曾利用多种不同有机、无机或复合碳源和氮源来研究它们对微生物的木质素降解能力和产酶能力的影响.还研究了碳源或氮源限制对它们的影响.结果表明,碳源和氮源是微生物降解木质素和产酶的一个极为重要的影响因素[6～18]. 352河　南　农　业　大　学　学　报第34卷 在用不同的单糖、双糖作碳源的矿质培养基培养豹斑革菌时,用麦芽糖生物的生长量最高.在标准培养条件下,以葡萄糖作对照,甘露糖和麦芽糖使MnP 活性分别增2倍和318倍.酵母汁、牛肉膏等复合氮有利于LiP 活性的提高,而甘氨酸、柠檬酸铵、乙醇胺等则抑制LiP 的生成和活性[6～9].黄孢原毛平革菌等白腐菌的木质素降解和木质素降解酶的产生是发生在氮源或其它营养被消耗的次级代谢过程中.而细菌则与之相反,高浓度的有机或无机氮源都不能抑制木质素降解,所产生的过氧化物酶也具有与生长相联和不受高水平氮抑制的特点.我国学者李越中等曾对黄孢原平革菌合成木质素过氧化物酶的营养调控进行过较为详细的研究报道(表2、表3)[19].表2　不同碳源对黄孢原毛苹革菌木素酶活力的影响碳源/(2g ・L -1)酶活力/(U ・L -1)碳源/(2g ・L -1)酶活力/(U ・L -1)三碳糖　蕈糖26512　甘油12613非还原性三糖戊醛糖　D 2松三糖7518　D 2核糖16810　上述糖等比混合40010　D 2木糖22713吡喃型戊聚糖　L 2阿拉伯糖12211　木聚糖1216己醛糖呋喃型己聚糖　D 2葡萄糖32412　葡糖4613己酮糖吡喃型己聚糖　L 2山梨糖10110　糊精42914脱氧己糖　可溶性淀粉4211　D 2岩藻糖　0　微晶纤维素17216　L 2岩藻糖17618　地衣多糖19317　鼠李糖　412　海带多糖16412还原二糖其他　纤维二糖28616　葡甘聚糖2915非还原二糖　果胶14714　D 2松二糖　0　麸皮浸汁(1%)25618　蔗糖5417表3　不同氮源对黄孢原毛平革菌酶活力的影响氮源 菌丝重/mg 酶活力/(U ・L -1)无机氮　NH 4NO 3141223711　(NH 4)2S O 4141328316　(NH 4)2HPO 417119810　尿素19120有机氮　乙醇胺20110　丙烯酰铵181524718　石酸铵131735016　柠檬酸铵16190　甘氮酸21140　L 2谷氨酸201325715复杂氨　酵母浸汁181338912　牛肉膏201743619 注:氮源质量浓度为12mm ol ・L -1. 有些微量元素对于白腐菌相关酶类的产生是有较大影响的.漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,因此,Cu 对于漆酶的产生和酶活性是相当重要的.Mn 对LiP 和MnP 都具有重要的作用,对漆酶的影响也是显著的.BI NNARME 等认为,Mn 2+对LiP 有抑制作用,而对MnP 则有诱导作用,其作用的大小与Mn 2+的浓度及添加时间有关. C.subuermispora 在Mn 2+浓度为11×10-6m ol ・L -1时,木质素矿化速率最大,而MnP 和Laccase 的活性在410×10-6时最高.不添加Mn 2+可使Agaricus campestris 的Laccase 活性显著降低,但Mn 2+对其影响是以Cu 2+的存在为前提,如果没有Cu 2+存在,那么Laccase 的活性则与Mn 2+浓度无关且酶活性始终很低.有报道,高浓度的Mn 2+会提高Phlebia breispora 的Laccase 活性,但对Dichomitus 来说,Laccase 活性都不受Mn 2+的影响. 结构和木质素有关的低分子芳香化合物或木质素降解的碎片化合物,可诱导Laccase 产生并提高其酶产量,这类化合物如香草酸、藜芦醇、愈创木酚、吐温、甲苯胺等.在豹斑革耳菌上还发现了专一的MnP 诱导物32甲基苄醇.培养温度、通气状况,pH 值乃至环境湿度等,也是影响木质素降解酶产生的因素.如黄孢原毛平革菌的最适生长温度为37℃,最适产酶温度为30℃.豹斑革耳菌增加通气可使木质素矿化率有所提高,而对于Phlebia radiata 来说,通氧则抑制其酶活性.培养温度和pH 值对Laccase 的影响因具体菌种而异,不同的菌种有不同的适宜培养温度和pH 值.5　木质素降解的分子生物学特性黄孢原毛平革菌(P.chrysosporium )已演变成为白腐真菌研究的模式生物,因此,有关这类微生物的研究中,对P.chrysosporium 的研究是最为详细的,当然,在分子生物学领域的研究也不例外[7].511　基因组在P.chrysosporium 菌丝体细胞中,可以随机分散多个细胞核,担孢子则含有2个等同的核.有性孢子的形成可以是同宗配合或异宗配合.黄孢原毛平革菌ME 2446菌株基因组大小估计为414×107bp ,其中20%～30%是线粒体和核糖体DNA ,其担孢子呈现染色体长度多态性.第4期吴坤等:木质素生物降解研究进展353 512　相关的基因家族51211　LiP　现在已知编码P.chrysosporium LiP的至少10个相近基因的家族,定名从lip A至lip J.从其它真菌如Trametes ver sicolor,Bjerkandera adusta和Phlebia adusta中也克隆出了几个LiP基因.LiP基因序列是高度保守的,其氨基酸序列有53%～9819%的相似性.每个LiP基因编码一个由22～28个残基的引导肽的343～345个氨基酸的成熟蛋白质产物.成熟蛋白质的分子量为36360～36607,表现分子量38000～43000,表现分子量的6%～13%推测为糖基部分.lip编码区含有大约60%～65%G+C,而非编码区G+C大约为44%～49%.P.chrysosporium lip均含有8个或9个内含子排列,每个大小为49～78bp.已测序的lip基因的5′端非编码区包含一个T AT A框(-66～-81bp)和一个C AAT顺序(-107～-228bp)的调节序列.51212　MnP　和LiP一样,MnP同功酶也是由多基因编码的.菌株OG C101的MnPⅠ编码一个357个氨基酸的成熟蛋白及一个21个氨基酸的导肽.它也具有糖基化位点,因此MnP也是糖蛋白.MnPⅠ的内含子为6个,大小在57～72bp之间;MnPⅡ的内含子为7个,大小在50～55bp之间.mnp 5′非翻译区包括一个T AT AA单元(-81bp)及3个反向CC AAT单元.51213　Laccase　漆酶也是由一个结构相近的基因家族所编码,目前至少有17个真菌的Laccase基因已经被克隆和测序,如Rhivoctonia solani,Trametes villosa,Agericu bisporus,Neurospora crassa,Coriclcls hir sutus,Cry2 phonectria parasitica,Aspergillus nidulan和Pleurctus ostleatus等.总的来说,在2个真菌Laccase之间的顺序等同性较低,但在铜结合区保守性却很高[9,20～24].513　相关基因的表达木质素降解酶基因的转录和翻译情况比较复杂,如菌株BK M2F21767LiP基因的转录明显地受C,N水平的调节,而MnP的产生赖于Mn的浓度,且Mn的调节是在转录水平上的.漆酶的表达调节在种间有显著的不同[7,9,20～24].在异源表达上,总的来说表达水平均不是太高.但是,一个构巢曲霉(Aspergillus nidulan)漆酶基因在米曲霉(A.aryzae)上的重组和成功表达,已使这个重组菌株用于实际的商业生产.6　木质素的生物降解的应用木质素的生物降解目前成功地用于生产实践的实际应用尚不多见,但在有些方面的研究已经显现出诱人的前景.1)造纸工业　分解木质素的酶类在造纸工业上的应用有两个方面,一是用改造旧的造纸工艺,用于生物制浆、生物漂白和生物脱色.黄孢原毛平革菌和P.brevispora等在国外已经得到成功利用.如用P.brevis2 pora进行生物制浆预处理可降低47%的能耗并增加了纸浆的张力,但它们的木质素降解率和产酶量都还是极为有限的,处理时间过长,距大规模推广应用尚有一定的距离.二是木质素分解菌或酶类用于造纸废水的处理,这方面的国内外研究报告已有很多且已取得了一定的实效[9].2)饲料工业　木质素分解酶或分解菌处理饲料可提高动物对饲料的消化率.实际上,木素酶和分解菌的应用已经突破了秸秆仅用于反刍动物饲料的禁地,已有报道饲养猪、鸡的实验效果.目前,以木素酶、纤维素酶和植酸酶等组成的饲料多酶复合添加剂已达到了商品化的程度.3)发酵与食品工业　木质纤维素中木质素的优先降解是制约纤维素进一步糖化和转化的关键,已有很多实验偿试使用秸秆进行酒精发酵或有机酸发酵,但看来这还有很长的路要走.在食品工业如啤酒的生产中,可使用漆酶等进行沉淀和絮凝的脱除,使酒类得到澄清.4)生物肥料　传统上曾使用高温堆肥的办法来使秸秆转化为有机肥料,但这些操作劳动强度大,近年来不为农民所欢迎.最近,秸秆转化为有机肥料的简单而行之有效的办法是秸秆就地还田.但是,还田秸秆在田间降解迟缓并带来了一系列的耕作问题,而解决这些问题的关键是加速秸秆的腐熟过程,因此,以白腐菌为代表的木质素降解微生物为这种快速腐熟提供了理论上的可能性.在国内,已有几家科研单位在进行相关的研究与探索.5)环境保护[2,6,9,25]　降解木质素的主要酶系是过氧化物酶系,它们作用于底物的机制是夺取电子和自由基的形成,这些特点决定了它们的底物非专一性,即它们的底物不是一种而是一类或几类有机化合 354河　南　农　业　大　学　学　报第34卷物.以漆酶为例,它是含铜的多酚氧化酶,它的底物涵盖了多种芳胺、酚类、二茂铁及共衍生物.季立才等人最近又确证了40多个漆酶的新发现底物,如1152萘二胺、1152二氨基蒽醌、邻和对乙酰氨基苯酚、22氨基242硝基苯酚、32氨基242羟基苯磺酸、32羟基242氨基萘磺酸、原儿苯酸硝类、茜素红、茜素紫、醌茜素、苏木精等.鉴于木质素降解菌和它们产生的相关酶类对多种有机化合物的降解能力,因此它们也是化工废水处理研究最为活跃的领域之一,这方面已不乏成功的范例.另外,在国外,黄孢原毛平革菌已被成功地用于有机氯农药污染土壤的生物修复.参考文献:[1]　CRAWFORD R L.Lignin biodegradation and trans formation[M].New Y ork:John Wiley&S ons,Inc,1981.[2]　HIG UCHI T.Lignin biochemistry:biosynthesis and biodegradation[J].W ood Sci T echnol,1990,24:23-63.[3]　BUSWE LL J A,ODIER E.Lignin biodegradation[J].CRC Crit Rev Biotechnol,1987,6:1-60.[4]　KIRK T K,FARRE LL R L.Enzymatic“combustion”:The microbial degradation of lignin[J].Ann Rev M icrobiol,1987,41:465-505.[5]　管莜武,张甲耀,罗宇煊.木质素降解酶及其调控机理研究的进展[J].上海环境科学,1998,17(11):46-49.[6]　王佳玲,余惠生,付时雨,等.白腐菌漆酶的研究进展[J].微生物学通报,1998,25(4):233-235.[7]　MICH AE L H G,A LIC M.M olecular biology of the lignin2degrading Basidiomycete Phanerochaete chrysosporium[J].M icrobiol Rev,1993,57(3):605-622.[8]　卢雪酶,李越中,王蔚,等.黄孢原毛平革菌木素过氧化物酶类在天然木素降解中作用的研究[J].菌物系统,1998,17(2):179-184.[9]　C U LLE N D.Recent advances on the m olecular genetic fungi[J].J Biotechnol,1997,53:273-289.[10]季立才,胡培植.漆酶催化氧化反应研究进展[J].林产化学与工业,1997,17(1):79-83.[11]Y OUN H,H AH Y,K ANG S.R ole of laccase in lignin degradation by white2rot fungi[J].FE MS M icrobiol Lett,132:183-188.[12]FAIS ON B D.,KIRK T K.Factors inv olved in the regulation of a ligninase activity in Phanerochete chrysosporium[J].Appl EnvironM icrobiol,1985,49(2):299-304.[13]TIE N M,KIRK T K.Lignin2degrading enzyme from Phanerochaete chrysosporium:Purification,characterization,and catalytic propertiesof a unique H H2O22requiring oxygenase[J].Proc Natl Acad Sci US A,1984,81:2280-2284.[14]FREIT AG M.,M ORRE LL J.Changes in slected activities during growth of pure and mixed cultures of the white2rot decay fungusTrametes ver sicolor and potential biocontrol fungus Trichoderma har zianum[J].Can J,1992,38:317-323.[15]SH UTT LEW ORTH K,BO LLAGJ.Production of induced laccase by the fungus Rhizoctonia practicola[J].Can J M icrobiol,1986,32:867-870.[16]ROTHSCHI L D N,LE VK OWITZ A,H ADAR Y,et al.Manganese dificiency can replace high oxygen levels needed for lignin peroxi2dase formation by Phanerochaete chrysosporium[J].Appl Environ M icrobiol,1999,65(2):483-488.[17]ORTH A,ROY SE D,TIE N M.Ubiguity of lignin2degrading peroxidases am ong various w ood2degrading fungi[J].Appl Environ M icro2biol,1993,59(12)4017-4023.[18]M AS APHY S,LE VANON D.The effect of lignocellose on lignocellulolytic activity of Puleurtus pulmonrius in submerged culture[J].Appl M icrobiol Biotechnol,1992,36:828-832.[19]李越中,高培基,王祖农.黄孢原毛平革菌合成木质素过氧化物酶的营养调控[J].微生物学报,1994,34(1):29-39.[20]LIWICKI R,PATERS ON A,M AC DONA LD M,et al.Phenotypic classes of phenoloxidase2negative mutants of the lignin2degrading fun2gus Phanerochaete chrysosporium[J].J Bacteriol,1985,162(2):641-644.[21]Y AVER D,OVER J ERO M,X U F,et al.M olecular characterization of laccase gene from the Basidiomycete cinereus and heterolog ousexpress of the laccase lcc l[J].Appl Envirom M icrobiol,1999,65(11):4943-4948.[22]GE LPKE M,M ARY M,CEREG HI NO G,et al.H om olog ous expression of recombinant lignin peroxidase in Phanerochaete chrysospori2um[J].Appl Environ M icrobiol,1999,65(4):1670-1674.[23]BERK A R,SCH NEI DER P,G O LIG HT LY E,et al.Characterization of the gene encoding on extractcellar laccase of Mecsliophthorathermophila and analysis of the recombinant enzyme expressed in Aspergillus oryzae[J].Appl Environ M icrobiol,1997,63(8):3151 -3157.[24]K O J I M A Y,TS UK UDA Y,K AW AI Y,et al.Cloning,sequence analysis,and expression of ligninolytic phenoloxidase genes of thewhite2rot Basidiomycete Coriplus hir sutus[J].J Biological Chem,1990,265(25):15224-15230.[25]季立才,王光辉,胡培植.漆树漆酶的新底物[J].自然杂志,1990,13(3):189-190.。

摘要本文以探究高效降解木质素菌种为目标，选用普通青霉菌、向病菌、产黄青霉菌和木霉菌作为实验菌种，采用芦苇作为实验原材料。

为得到理想的降解木质素菌株，通过对4株菌种进行不同的组合，比较木质素降解率，从而确定最佳菌种组合。

然后进行混合菌种不同混合方式、不同混合比例和固液比的优化，得到最佳组合菌。

利用漆酶和木聚糖酶混合漂白纸浆，探寻生物机械浆的最佳工艺条件。

本论文研究的主要结果如下：1. 本实验通过对采取的腐朽树木根部的土样进行筛选，挑取单菌落，经过显微镜和ITS鉴定，最终得到单一菌种普通青霉菌。

2. 通过漆酶活测定，发现普通青霉菌可以产生漆酶，经过培养基成分优化，产酶最高达到55 U/mL。

该菌的液体培养产酶条件为温度30℃，pH值为6，转速为170 rpm，最高产酶酶活达到59.6 U/mL，比优化前酶活提高了12.39倍。

该菌的蛋白含量为14.67 μg/mL。

对芦苇木质素的降解率为35.25%。

3. 通过对4种菌不同组合的优化，得出ABD组合菌木质素降解率最好，ABD 组合菌在8 d、混合比例为A:B:D=1:4:16时，木质素含量为10.66%，降解率达到67.27%。

分析原因可能是跟其产酶及不同酶之间的协同作用有关，这在工业生产中减少成本投资方面有很好的利用价值。

因此，我们选择这三种组合菌作为优势菌种组合。

4. 经过对化学法漂白液成分和条件的优化，得出最佳的漂白条件为：浆浓4%，双氧水5%，EDTA 2%，氢氧化钠1%，温度60℃，处理时间为2 h。

纸浆的白度达到48.9%，相比于优化前白度（40.6%）提高了8.3% ISO。

5. 采用酶对纸浆进行漂白，通过漆酶、木聚糖酶和漆酶/木聚糖酶混合酶对纸浆预处理，可使纸浆白度达到52.1%，再次对混合比例进行优化，当漆酶：木聚糖酶=2:1时，纸浆的白度为59.6%，与未经过酶预处理的纸浆相比白度提高了7.5% ISO。

6. 通过对漂白废水的检测，用酶漂白可以降低废水中的COD Cr值，同时还可以使pH变为弱碱性。

关于利用微生物用于木质纤维素生物质转化为燃料乙醇的研究进展综述摘要：木质纤维素生物质是一种廉价、易得的可持续发展的潜在新能源材料，随着能源危机的加剧，由木质纤维素生物质转化为燃料乙醇成为开发新能源的一个新突破口。

国内外近年来在这个领域都有很多研究成果。

本文就微生物在木质纤维素生物质转化为燃料乙醇的预处理、水解中的应用作出综述，分析了现在木质纤维素生物质转化为燃料乙醇要想实现产业化所遇到的问题，并提出几条对策。

关键词：木质纤维素、燃料乙醇、发酵、纤维素酶、研究进展随着现代工业与经济的发展，能源需求日益增加。

特别是石油能源，由于人类社会的不断开采，石油资源目前面临着枯竭的危险。

据2010年11月8号《环境科学与技术杂志》发表的研发报告显示，以当前的使用速度，化石燃料原料将在2050年前枯竭，而石油开采量下降10%～15%足以令发达工业国家的经济完全瘫痪1。

这就意味着，要想保证人类社会的继续发展，寻求清洁、可持续的新能源已经成为了人类一项必须要完成的任务。

因此，越来越多的国家已将生物质能源产业作为国家的一项重大战略推进，纷纷投入巨资进行生物质能源的研发。

20世纪70年代石油危机以来，一些国家开始尝试利用生物质资源生产液体燃料2。

继美国和巴西用玉米和甘蔗生产燃料乙醇成功后，欧盟、日本、加拿大、印度等国家和地区也先后加大用粮食制备燃料乙醇的投入，2006年，仅美国由玉米淀粉生产乙醇的产量就达到了50亿加仑3。

然而，随着随着世界耕地面积的缩小和人口数量的急剧增多，世界粮食价格也在近年出现大幅攀升。

如何寻求价格低廉且来源广泛的替代原料来生产燃料乙醇，成为了发展生物质能转化为乙醇新能源亟待解决的问题。

木质纤维素生物质如农林牧业加工废弃物，是可再生、价廉易得和来源丰富的资源和能源。

全球每年光合作用的产物高达1500-2000亿吨，其中80%以上为木质纤维素生物质(如秸秆、草类、树木等)4。

利用木质纤维素生物质生产乙醇不仅有利于环境保护和资源再利用，而且可减少温室气体的排放和缓解化石能源的危机，因此成为了一条解决新能源问题的新途径，其研究得到了世界各国的大力支持，并且也取得了很多阶段性的进展。

收稿日期:2003-02-09作者简介:王海磊(1978-),男,硕士;李宗义(1942-),男,教授,河南师范大学生命科学学院,研究方向:环境微生物学。

基金项目:河南省科技攻关项目(001200217)文章编号:1008-9632(2003)05-0009-03三种重要木质素降解酶研究进展王海磊,李宗义(河南师范大学生命科学学院,新乡 453002)摘 要:就三种重要木质素降解酶:LiP 、MnP 和漆酶在自然界的分布,化学组成、结构特征、降解机制、分子生物学等进行综述,并探讨了其作用协同性。

关键词:木质素过氧化物酶;锰过氧化物酶;漆酶;中图分类号:Q936文献标识码:A木质素是造纸工业排放黑液C OD 和色度形成的主要原因,其结构是由甲氧基取代的对-羟基肉桂酸聚合而成的异质多晶三维多聚体,分子间多为稳定的醚键、C-C 键,是目前公认的微生物难降解芳香化合物之一。

自1934年Boruff 和B uswell 首次发现能降解木质素的微生物种群,人们对木质素的生物降解进行了大量研究,1983年和1984年发现了木质素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP),由日本吉田首次在生漆中发现的漆酶(Laccase),也始终引起着人们的关注。

这三种酶被公认为是木质素重要的降解酶。

本文就三种木质素降解酶的最新研究进展进行综述,尝试为造纸废水的生物降解提供一些参考。

1 木质素过氧化物酶(LiP)1 1 分布及种类LiP 是第一个从黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysospo rium )发现的木质素降解酶,在木质素降解中起关键性作用。

LiP 的产生菌在自然界分布相当广泛,许多腐朽木材的白腐菌、褐腐菌都可以产生LiP,主要产生菌见表1。

表1 Li P 的主要产生菌属名菌种名Trametes T.gibbosa ,T.versicolorPhlebia P.bre vispora ,P.radiata ,P.oc hrace o fulva,P.t reme llosa ,P.adustaCoriolus C.consors , C.hi rsutusOthersBj e rkande ra adusta ,Chrysonilia sito phila,Chrysospo rium pruinosum,Coriolopsis occ identalis,Phe llinus pini,Pol yporus ostrei formis,Phanerochaete chrysos porium ,Strepto myce s viridosporu ,Pleurotus ostreatus ,Junghuhunia se parabalima ,Fomes lignosus1 2 结构及特点LiP 代表一系列含Fe 3+、卟啉环(IX)和血红素附基的同工酶,由不同微生物产生的酶的种类和理化性质各不相同。