氯霉素抗性融合蛋白报告系统的建立与验证
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摘要 利用氯霉素乙酰基转移酶 (CAT) N 端融合了可溶性蛋白细胞所表现出的氯霉素抗性高于 不溶性蛋白这一特点 ,建立了一种能在大肠杆菌中方便地检测到目的蛋白可溶性的报告系统 。 以 pM al2p2X高效表达载体为基础 ,采用 PCR法扩增 CAT基因 ,并通过引物向 CAT中引入所需的 多克隆位点 、终止密码子及 linker,将扩增得到的 CAT片段插入到 pM al2p2X中 ,构建 pCAR 报道 质粒并作测序鉴定 ; PCR分别扩增 IGF1、IL 23、Trx基因 ,连接到 pCAR 载体上 ,导入大肠杆菌原核 表达系统中进行诱导表达 , SDS2PAGE分析 、氯霉素抗性试验对表达目的蛋白的可溶性和表现出 的氯霉素抗性的相关性加以验证 。结果显示用该载体表达的重组蛋白的可溶性与氯霉素抗性具 有很强的相关性 。本报告系统能通过直观的平板氯霉素抗性高低正确指示位于 CAT N 端的目的 蛋白的可溶性 ,为其在生物工程和蛋白质构象相关疾病研究等领域的应用打下了基础 。 关键词 氯霉素乙酰基转移酶 蛋白质折叠 可溶性 原核表达 报告系统
收稿日期 : 2005205227 修回日期 : 2005207225 3 电子信箱 : aiewang@ sina. com
见报道。本研究旨在利用报告蛋白 CAT活性与目的蛋 白溶解性之间的这种相关性 ,选择另外一种高效表达载 体 pMal2p2X构建 pCAR 报告系统 ,并验证其对蛋白的折 叠状态能否进行正确的指示 ,希望通过这样一个简便、通 用 、快捷的遗传筛选模型不但能对蛋白折叠进行定性 、定 量分析 ,而且能为以蛋白聚集为靶点的蛋白折叠相关疾 病的诊治提供一个稳定的平台 。
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中国生物工程杂志 China B iotechnology
Vol. 25 No. 11 2005
压恒流电泳仪 DF2C、B io2RAD 垂直电泳仪 、B io2RAD 水 平电泳仪和国产 Q / YS00229恒温水箱等 。 1. 2 方 法 1. 2. 1 CAT基因的克隆和 pCAR、pCAR ( + )质粒的构 建 设计扩增 CAT的 3条上游引物 P1、P3、P4,一条下 游引物 P2,其中 P1 包括一个 Kpn I位点 ,一段柔性的 linker编码序列及 CAT N 端的 5个氨基酸编码序列 ;下 游引物 P2包括 H ind III、Pst I位点及 CAT C 端的 6 个 氨基酸编码序列 。以含有 CAT基因的质粒 pGEM 2T2 CAT为模板 , P1、P2 为引物进行 PCR 扩增 ,向 CAT基 因两端分别引入 Kpn I、linker和 H ind III酶切位点 。以 P1、P2扩增产物作为模板 ,用 P3 和 P2 引物再次扩增 CAT基因 , 通过 P3 在其上游引入 N de I位点 , 同时在 N de I和 Kpn I之间插入 3 个终止密码子 ( TAA、TAG、 TGA ) ,以保证没有外源基因插入时 ,任何位置的起始 转录在 CAT上游都会被终止 ,从而可以消除没有外源 基因时单独转录 CAT造成的氯霉素抗性背景 。以 P3 和 P2引物扩增的经测序鉴定正确的 CAT基因经 N de I 和 H ind III酶切后插入到载体 pMal2p2X 相应位点 ,构 建阴性对照质粒 pCAR。 P4只在上游引物中引入 N de I 位点 ,不加终止密码子 ,以质粒 pGEM 2T2CAT为模板 , P4、P2为引物扩增的 CAT基因 ,经 N de I和 H ind III酶 切后插入到载体 pMal2p2X 相应位点 ,构建阳性对照质 粒 pCAR ( + ) ,该表达载体中 CAT基因单独表达后所 表现的氯霉素抗性可认为是蛋白完全溶解状况下氯霉 素抗性的 阈值 。引 物 序列 分 别 为 : 上 游引 物 P1: 5′2
2 结 果
2. 1 pCAR、pCAR( + )质粒的构建和鉴定 2. 1. 1 PCR 扩增 CAT 以含 CAT的质粒为模板 ,分别 以 P1 / P2和 P4 / P2这 2对引物扩增 CAT基因 。产物经 1. 5%琼脂糖凝胶电泳 ,可见约 660bp 的特异性扩增条 带 (图 1) 。纯化回收 P1 / P2 扩增的 PCR 产物 ,以该产 物为模板 , P3 / P2 为引物 ,对 CAT基因作再次扩增 ,获 得引入 N de I、Kpn I、H ind III酶切位点的 PCR 产物 ,纯 化回收该产物 。 PCR 产物均经测序作进一步鉴定 ,序 列测定结果证实与预期一致 。 2. 1. 2 pCAR、pCAR ( + ) 质粒的构建 用 N de I和 H ind III双 酶 分 别 消 化 引 物 P3 / P2、P4 / P2 扩 增 出 的 CAT片段和 pMal2p2X 载体 ,琼脂糖凝胶电泳鉴定后 , 纯化回收大 、小片段 。将回收的 CAT与载体酶切产物 进行连接 ,转化 E. coli DH5α,涂平板后培养过夜 。
2005, 25 (11)
王爱娥 等 :氯霉素抗性融合蛋白报告系统的建立与验证
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图 1 CAT PCR扩增产物的 琼脂糖凝胶电泳分析
F ig. 1 Iden tif ica tion of the CAT PCR product by agarose gel electrophoresis
M: DL2 000 Marker; 1: Negative control; 2: PCR p roduct
中国生物工程杂志 China B iotechnology, 2005, 25 (11) : 31～36
氯霉素抗性融合蛋白报告系统的建立与验证
ห้องสมุดไป่ตู้
王爱娥 13 张睢扬 1 董书魁 2 梅开城 1 马建新 1 王东霞 1 王 英 1
(1 中国人民解放军第二炮兵总医院呼吸内科 北京 100088 2 中国人民解放军第二炮兵总医院检验科 北京 100088)
蛋白质重组表达过程中常见的问题就是异常折叠和 以包涵体形式聚集沉淀 ,给研究和应用带来了诸多不便。 如何使包涵体重新折叠成具有天然构象的蛋白 ,是基因 工程和蛋白质工程亟待解决的问题 [1] 。尽管一些蛋白质 的可溶性可以通过改变纯化程序或溶剂条件得到提高 , 但仍有许多蛋白质由于三维结构和氨基酸序列的特点不 能以可溶性表达 ,要得到这些蛋白的可溶性表达产物也 许只能通过突变改变它们的序列来实现 。通过改变特定 蛋白的一个或几个残基从而显著提高其体外溶解性的例 子有很多 ,然而 ,确定哪个突变能够提高蛋白质的可溶 性 ,尤其在结构未知的情况下 ,非常困难。如果能将任何 特定蛋白质的可溶性突变体从随机突变程序所产生的巨 大突变体库中筛选出来 ,那么就有可能找到许多不同蛋 白质的可溶性形式。所以 ,一个好的筛选系统至关重要。 鉴于报告基因氯霉素乙酰基转移酶 ( CAT)具有 N 端融 合了可溶性蛋白细胞所表现出的氯霉素抗性高于不溶性 蛋白这一特点 ,Maxwell等 [2 ]曾利用质粒 pDW 239构建了 pCFN1氯霉素融合蛋白表达系统 ,该系统可以通过高浓 度氯霉素抗性平板在大肠杆菌内很容易地将 H IV 整合 酶的一个结构域可溶性突变体筛选出来 。国内这方面鲜
1 材料与方法
1. 1 材 料 1. 1. 1 菌株及质粒 E. coli DH5α、BL21 (DE3)由本室 保存 。含 CAT、IGF1、IL 23、Trx 基 因 的 质 粒 pGEM 2T2 CAT、pGEM 2T2IGF、pGEM 2T2IL 23、pGEM 2T2Trx由本室构 建并保存。pMal2p2X购自 New England B iolabs Inc. 。 1. 1. 2 酶及试剂 限制性内切酶 、T4 DNA 连接酶 、 DL2 000 marker 购 自 TaKaRa 公 司 和 New England B iolabs, pfuE、TaqE购自上海生工生物工程技术服务有 限公司。 IPTG、质粒快速提取试剂盒购自 Promega公司。 1. 1. 3 主要仪器 Sigma 3K12 离心机 、Beckman GS2 15R 离 心 机 、Sigma 112 离 心 机 、Perkin elmer DNA thermal cycler 480、Cole2Parmer Instrument Co. 超声破碎 仪 、Mettler AZ260 电子天平 、TH28821台式摇床 、国产恒
CCCAA GCTTGCCTGCA GGTCGACTCA TTACGCCCCGCCC TGCCACTG ∃ 3′。 1. 2. 2 其它基因的克隆及重组表达质粒的构建 分 别以含 IGF1 ( insulin2like growth factor1类胰岛素生长因 子 1)基因 、白细胞介素 3 ( IL 23)基因 、硫氧还蛋白 ( Trx) 基因 的 质 粒 pGEM 2T2IGF1、pGEM 2T2IL 23 和 pGEM 2T2 Trx为模板以 P5 / P6、P7 / P8、P9 / P10 为引物 , PCR 扩增 相应目的基因 ,在目的基因两侧分别引入 N de I和 Kpn I 酶切位点 。以 N de I和 Kpn I分别酶切扩增得到的目的 基因和已经构建的表达载体 pCAR ,连接转化 ,经 PCR 和酶切鉴定正确的重组质粒分别命名为 p IGF12CAR、
p IL 232CAR 和 pTrx2CAR。各引物序列分别为 : 上游引 物 P 5 : 5 ′2 AAACATATGGGTCCAGAAACTCTGTGTG G23′,下游引物 P6: 5′2GGGGGTACCAGCAGATTTAGCC GGTTTCAGCGG23′,上游引物 P7: 5′2GGGAATTCATAT GAGCCGCCTGCCCGTCCTG ∃ 3′,下游引物 P8: 5′2GG GGTACCAAATAGCGCGAGGCTCAAAGT23′, 上 游 引 物 P9: 5′2GGGAATTCATATGAGCGATAAAATTATTCAC23′, 下游引物 P10: 5′2GGGGTACCCGCCAGGTTAGCGTCGA GG23 ′。 所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公 司合成 ,使用前配成 0. 5μmol/L 浓度的工作液 。 1. 2. 3 PCR 扩增 扩增体系参照文献 [ 3 ] ,扩增条件 : 95℃变性 5m in; 94℃ 45 s, 60℃ 45 s, 72℃ 60 s, 30 个循 环 ; 72℃延伸 5m in。 1. 2. 4 重组质粒的诱导表达 重组表达质 粒 转化 E. coli BL21,挑取单菌落 ,接种于氨苄抗性 LB 培养基 中 37℃摇菌过夜 ,按 2%接种量接种于同样抗性的 LB 培养基中 ,摇菌培养至 OD600 = 0. 4 ～0. 6,加入 IPTG使 其终浓度为 1mmol/L , 30℃诱导培养 4 ～6h 后 ,离心收 集菌体 ,超声破菌后离心 ,分别取破碎总产物 、上清和 沉淀进行 SDS2PAGE。 1. 2. 5 氯霉素抗性梯度平皿实验 氯霉素抗性梯度 平皿实验参照 M axwell等 [2 ]实验方法 。 此外 , DNA 提取 、纯化回收 、限制性酶切 、连接 、转 化 、感受态制备 、质粒提取 SDS电泳等分子生物学操作 均参照文献 [ 3 ]和相应试剂盒说明书进行 。
收稿日期 : 2005205227 修回日期 : 2005207225 3 电子信箱 : aiewang@ sina. com
见报道。本研究旨在利用报告蛋白 CAT活性与目的蛋 白溶解性之间的这种相关性 ,选择另外一种高效表达载 体 pMal2p2X构建 pCAR 报告系统 ,并验证其对蛋白的折 叠状态能否进行正确的指示 ,希望通过这样一个简便、通 用 、快捷的遗传筛选模型不但能对蛋白折叠进行定性 、定 量分析 ,而且能为以蛋白聚集为靶点的蛋白折叠相关疾 病的诊治提供一个稳定的平台 。
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中国生物工程杂志 China B iotechnology
Vol. 25 No. 11 2005
压恒流电泳仪 DF2C、B io2RAD 垂直电泳仪 、B io2RAD 水 平电泳仪和国产 Q / YS00229恒温水箱等 。 1. 2 方 法 1. 2. 1 CAT基因的克隆和 pCAR、pCAR ( + )质粒的构 建 设计扩增 CAT的 3条上游引物 P1、P3、P4,一条下 游引物 P2,其中 P1 包括一个 Kpn I位点 ,一段柔性的 linker编码序列及 CAT N 端的 5个氨基酸编码序列 ;下 游引物 P2包括 H ind III、Pst I位点及 CAT C 端的 6 个 氨基酸编码序列 。以含有 CAT基因的质粒 pGEM 2T2 CAT为模板 , P1、P2 为引物进行 PCR 扩增 ,向 CAT基 因两端分别引入 Kpn I、linker和 H ind III酶切位点 。以 P1、P2扩增产物作为模板 ,用 P3 和 P2 引物再次扩增 CAT基因 , 通过 P3 在其上游引入 N de I位点 , 同时在 N de I和 Kpn I之间插入 3 个终止密码子 ( TAA、TAG、 TGA ) ,以保证没有外源基因插入时 ,任何位置的起始 转录在 CAT上游都会被终止 ,从而可以消除没有外源 基因时单独转录 CAT造成的氯霉素抗性背景 。以 P3 和 P2引物扩增的经测序鉴定正确的 CAT基因经 N de I 和 H ind III酶切后插入到载体 pMal2p2X 相应位点 ,构 建阴性对照质粒 pCAR。 P4只在上游引物中引入 N de I 位点 ,不加终止密码子 ,以质粒 pGEM 2T2CAT为模板 , P4、P2为引物扩增的 CAT基因 ,经 N de I和 H ind III酶 切后插入到载体 pMal2p2X 相应位点 ,构建阳性对照质 粒 pCAR ( + ) ,该表达载体中 CAT基因单独表达后所 表现的氯霉素抗性可认为是蛋白完全溶解状况下氯霉 素抗性的 阈值 。引 物 序列 分 别 为 : 上 游引 物 P1: 5′2
2 结 果
2. 1 pCAR、pCAR( + )质粒的构建和鉴定 2. 1. 1 PCR 扩增 CAT 以含 CAT的质粒为模板 ,分别 以 P1 / P2和 P4 / P2这 2对引物扩增 CAT基因 。产物经 1. 5%琼脂糖凝胶电泳 ,可见约 660bp 的特异性扩增条 带 (图 1) 。纯化回收 P1 / P2 扩增的 PCR 产物 ,以该产 物为模板 , P3 / P2 为引物 ,对 CAT基因作再次扩增 ,获 得引入 N de I、Kpn I、H ind III酶切位点的 PCR 产物 ,纯 化回收该产物 。 PCR 产物均经测序作进一步鉴定 ,序 列测定结果证实与预期一致 。 2. 1. 2 pCAR、pCAR ( + ) 质粒的构建 用 N de I和 H ind III双 酶 分 别 消 化 引 物 P3 / P2、P4 / P2 扩 增 出 的 CAT片段和 pMal2p2X 载体 ,琼脂糖凝胶电泳鉴定后 , 纯化回收大 、小片段 。将回收的 CAT与载体酶切产物 进行连接 ,转化 E. coli DH5α,涂平板后培养过夜 。
2005, 25 (11)
王爱娥 等 :氯霉素抗性融合蛋白报告系统的建立与验证
33
图 1 CAT PCR扩增产物的 琼脂糖凝胶电泳分析
F ig. 1 Iden tif ica tion of the CAT PCR product by agarose gel electrophoresis
M: DL2 000 Marker; 1: Negative control; 2: PCR p roduct
中国生物工程杂志 China B iotechnology, 2005, 25 (11) : 31～36
氯霉素抗性融合蛋白报告系统的建立与验证
ห้องสมุดไป่ตู้
王爱娥 13 张睢扬 1 董书魁 2 梅开城 1 马建新 1 王东霞 1 王 英 1
(1 中国人民解放军第二炮兵总医院呼吸内科 北京 100088 2 中国人民解放军第二炮兵总医院检验科 北京 100088)
蛋白质重组表达过程中常见的问题就是异常折叠和 以包涵体形式聚集沉淀 ,给研究和应用带来了诸多不便。 如何使包涵体重新折叠成具有天然构象的蛋白 ,是基因 工程和蛋白质工程亟待解决的问题 [1] 。尽管一些蛋白质 的可溶性可以通过改变纯化程序或溶剂条件得到提高 , 但仍有许多蛋白质由于三维结构和氨基酸序列的特点不 能以可溶性表达 ,要得到这些蛋白的可溶性表达产物也 许只能通过突变改变它们的序列来实现 。通过改变特定 蛋白的一个或几个残基从而显著提高其体外溶解性的例 子有很多 ,然而 ,确定哪个突变能够提高蛋白质的可溶 性 ,尤其在结构未知的情况下 ,非常困难。如果能将任何 特定蛋白质的可溶性突变体从随机突变程序所产生的巨 大突变体库中筛选出来 ,那么就有可能找到许多不同蛋 白质的可溶性形式。所以 ,一个好的筛选系统至关重要。 鉴于报告基因氯霉素乙酰基转移酶 ( CAT)具有 N 端融 合了可溶性蛋白细胞所表现出的氯霉素抗性高于不溶性 蛋白这一特点 ,Maxwell等 [2 ]曾利用质粒 pDW 239构建了 pCFN1氯霉素融合蛋白表达系统 ,该系统可以通过高浓 度氯霉素抗性平板在大肠杆菌内很容易地将 H IV 整合 酶的一个结构域可溶性突变体筛选出来 。国内这方面鲜
1 材料与方法
1. 1 材 料 1. 1. 1 菌株及质粒 E. coli DH5α、BL21 (DE3)由本室 保存 。含 CAT、IGF1、IL 23、Trx 基 因 的 质 粒 pGEM 2T2 CAT、pGEM 2T2IGF、pGEM 2T2IL 23、pGEM 2T2Trx由本室构 建并保存。pMal2p2X购自 New England B iolabs Inc. 。 1. 1. 2 酶及试剂 限制性内切酶 、T4 DNA 连接酶 、 DL2 000 marker 购 自 TaKaRa 公 司 和 New England B iolabs, pfuE、TaqE购自上海生工生物工程技术服务有 限公司。 IPTG、质粒快速提取试剂盒购自 Promega公司。 1. 1. 3 主要仪器 Sigma 3K12 离心机 、Beckman GS2 15R 离 心 机 、Sigma 112 离 心 机 、Perkin elmer DNA thermal cycler 480、Cole2Parmer Instrument Co. 超声破碎 仪 、Mettler AZ260 电子天平 、TH28821台式摇床 、国产恒
CCCAA GCTTGCCTGCA GGTCGACTCA TTACGCCCCGCCC TGCCACTG ∃ 3′。 1. 2. 2 其它基因的克隆及重组表达质粒的构建 分 别以含 IGF1 ( insulin2like growth factor1类胰岛素生长因 子 1)基因 、白细胞介素 3 ( IL 23)基因 、硫氧还蛋白 ( Trx) 基因 的 质 粒 pGEM 2T2IGF1、pGEM 2T2IL 23 和 pGEM 2T2 Trx为模板以 P5 / P6、P7 / P8、P9 / P10 为引物 , PCR 扩增 相应目的基因 ,在目的基因两侧分别引入 N de I和 Kpn I 酶切位点 。以 N de I和 Kpn I分别酶切扩增得到的目的 基因和已经构建的表达载体 pCAR ,连接转化 ,经 PCR 和酶切鉴定正确的重组质粒分别命名为 p IGF12CAR、
p IL 232CAR 和 pTrx2CAR。各引物序列分别为 : 上游引 物 P 5 : 5 ′2 AAACATATGGGTCCAGAAACTCTGTGTG G23′,下游引物 P6: 5′2GGGGGTACCAGCAGATTTAGCC GGTTTCAGCGG23′,上游引物 P7: 5′2GGGAATTCATAT GAGCCGCCTGCCCGTCCTG ∃ 3′,下游引物 P8: 5′2GG GGTACCAAATAGCGCGAGGCTCAAAGT23′, 上 游 引 物 P9: 5′2GGGAATTCATATGAGCGATAAAATTATTCAC23′, 下游引物 P10: 5′2GGGGTACCCGCCAGGTTAGCGTCGA GG23 ′。 所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公 司合成 ,使用前配成 0. 5μmol/L 浓度的工作液 。 1. 2. 3 PCR 扩增 扩增体系参照文献 [ 3 ] ,扩增条件 : 95℃变性 5m in; 94℃ 45 s, 60℃ 45 s, 72℃ 60 s, 30 个循 环 ; 72℃延伸 5m in。 1. 2. 4 重组质粒的诱导表达 重组表达质 粒 转化 E. coli BL21,挑取单菌落 ,接种于氨苄抗性 LB 培养基 中 37℃摇菌过夜 ,按 2%接种量接种于同样抗性的 LB 培养基中 ,摇菌培养至 OD600 = 0. 4 ～0. 6,加入 IPTG使 其终浓度为 1mmol/L , 30℃诱导培养 4 ～6h 后 ,离心收 集菌体 ,超声破菌后离心 ,分别取破碎总产物 、上清和 沉淀进行 SDS2PAGE。 1. 2. 5 氯霉素抗性梯度平皿实验 氯霉素抗性梯度 平皿实验参照 M axwell等 [2 ]实验方法 。 此外 , DNA 提取 、纯化回收 、限制性酶切 、连接 、转 化 、感受态制备 、质粒提取 SDS电泳等分子生物学操作 均参照文献 [ 3 ]和相应试剂盒说明书进行 。
