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发布日20070423期栏目化药药物评价>>化药质量控制标题抗生素微生物检定方法学验证中的常见问题分析作者审评三部部门正文容审评三部审评五室英摘要：本文对抗生素微生物检定法中的管碟法在方法学验证中的常见问题如线性与围中溶液浓度与直径的关系、精密度的测定方法等进行了分析，归纳其错误的问题，给出了正确的操作方法。
关键词：抗生素微生物检定法多组分抗生素方法学验证抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生素测定方法。
自20世纪40年代建立至今，在各国药典中被普遍采用。
虽然伴随着HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品种的效价已被化学分析法所取代，但由于①微生物检定法可直观、特异地反映出抗生素品种的抗菌活性；②多组分抗生素由于结构与不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、含量和生物活性间的关系；③许多抗生素品种由于各种原因如无特征紫外吸收等，目前没有适当的化学分析方法表征其活性，故抗生素微生物检定法目前在各国药典中仍占有重要的地位，且短期化学分析法不可能完全取代微生物检定法。
中国药典2005年版仍采用抗生素微生物检定法中的管碟法测定其效价，目前申报已有国家标准的该类制剂较多，在质量研究中存在诸多问题，现就常见的问题加以分析，希望对注册申请人有所帮助。
一、方法的建立1、供试品与标准品的同质性抗生素微生物检定法的原理以供试品与标准品同质为前提，方法建立前，首先应确定供试品与标准品是否同质，包括化学结构、所含组分及组分比例的一致性，对于制剂还要考虑辅料的影响是否造成供试品与标准品不同质。
2、培养基、试验菌、缓冲液和培养条件的选择可参照中国药典建立，在此不再赘述。
3、检定方法的确定可采用一剂量法（标准曲线法）、二剂量法及三剂量法等。
一般确定线性与围采用一剂量法（标准曲线法），常规含量测定采用二剂量法，标准品标定采用三剂量法。
4、抗生素溶液的稳定性选定的品种可参照中国药典现行版附录抗生素微生物检定法的品种，若溶剂和缓冲液与其不同，应考察抗生素储备溶液和测定溶液在室温、40℃和不同pH值缓冲液中，以及放置不同时间的稳定性，以确定抗生素储备溶液和测定溶液的存放时间和条件。
抗生素微生物检定管碟法在中国药典中的应用及操作要点录入时间:2010-11-18 10:29:10 来源：青岛海博抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。
各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。
管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。
管碟法的操作步骤：1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。
2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。
4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。
5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。
6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。
7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。
第9卷第3期延安大学学报（医学科学版）Vol.9No.3 2011年9月Journal of Yanan University（Med Sci）Sep.2011管碟法对抗生素药品效价的微生物检定王新霞1，宋雪玲2（1.延安大学附属医院；2.延安市药品检验所，陕西延安716000）摘要：目的减少实验过程中外界因素与人为因素给试验带来的误差，提高管碟法测定抗生素效价的准确性。
方法按药典操作步骤逐步分析，规范操作，并提出合理的解决方案。
结果得到清晰、圆整的抑菌圈。
结论可以提高测定结果的准确性。
关键词：抗生素效价；生物检定法—管碟法；抑菌圈中图分类号：R917文献标识码：A文章编号：1672－2639（2011）03－0058－01抗生素是医疗上广泛使用的药品［1］。
由于抗生素药品的医疗作用主要是它的抗菌效力，利用抗生素对细菌（霉菌）的杀死或抑制的程度，作为客观指标来衡量抗生素的效力。
根据此原理，设定了抗生素效价的生物检定法—管碟法。
1基本原理管碟法是利用抗生素在琼脂培养内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
管碟法的特点是灵敏度高，能直接显示抗生素的抗菌效价，但操作步骤多，试验过程长。
影响试验结果的因素较多，需要从各个环节加以严格控制试验条件。
本文就对试验中各项影响因素的控制加以讨论。
2影响因素2.1抑菌圈圈正的控制在某些情况下，抑菌圈出现破裂，呈椭圆形，卵圆形等不正常形状，其原因［2］可能如下：（1）在滴加抗生素溶液至小管时，抗生素溶液从小管口或毛细滴管口溅出落在琼脂培养基表面上。
防止方法：毛细滴管内不得有气泡，毛细滴管口避免太细，毛细滴管离小管口距离不要太高，适当调节，使液滴下滴时不致溅出。
（2）小管两端面不够平，使抗生素溶液漏出，破坏了均匀扩散现象。
必须使用加工相同的小钢管。
如都用二端面平面的，或都使用二端面圆的。
（3）玻璃双碟、小钢管、钢管放置器被微量抗生素（或其他杀菌剂）污染，使抑菌圈破裂。
中国药典2005版收载的抗生素品种特点和新技术新方法的应用【摘要】本文对中国药典2005版收载的抗生素品种与中国药典2000版进行了比较，并对这些抗生素品种的特点及采用的新技术、新方法进行了初步的归纳总结。
中国药典2005版（以下简称CP2005）于2005年7月1日正式执行，这版药典总的来说在品种的收载情况和对已有品种的技术要求方面，均较CP2000有了较大的变化。
下面笔者通过资料的收集、比较，对CP2000、CP2005收载的抗生素在品种收载情况及新技术的应用情况作一小结。
1、CP2005抗生素收载品种的主要变化CP2005新增加76个抗生素品种及制剂，其中18个为喹诺酮类抗生素。
具体为：甲磺酸培氟沙星（原料、片剂、胶囊、注射液、粉针），氟罗沙星（原料、片剂、胶囊），氧氟沙星（胶囊、眼膏、滴眼剂、滴耳剂），环丙沙星，依诺沙星，诺氟沙星乳膏，司帕沙星（原料，片剂，胶囊），头孢地尼（原料、胶囊），头孢替唑钠（原料、粉针），头孢硫醚（原料、粉针），吉他霉素（原料、片剂），麦白霉素（原料、片剂），硫酸小诺霉素（原料、片剂、注射液、口服溶液），硫酸依替米星（原料、注射液、粉针），更昔洛韦（原料、粉针、注射液），利巴韦林（口服溶液、含片、胶囊、片剂、粉针、注射剂），阿昔洛韦（片剂、胶囊、乳膏、咀嚼片、颗粒剂、滴眼剂、粉针），泛昔洛韦（原料、片剂、胶囊），伐昔洛韦（原料、片剂、胶囊），阿奇霉素（分散片、颗粒），罗红霉素（分散片、干混悬剂），琥乙红霉素（分散片、胶囊），克拉霉素（颗粒），盐酸米诺环素（原料、片剂、胶囊），盐酸柔红霉素（原料、粉针），卞星青霉素（原料），青霉素V钾（胶囊），美罗培南（原料、粉针），替硝唑（原料、胶囊、注射液），氟康唑（片剂），穿琥宁（原料、粉针），硫酸多粘菌素B（原料、粉针）。
从收载的品种和剂型看，基本体现出这几年抗生素申报情况。
例如，这几年申报量较大的品种有：甲磺酸培氟沙星、头孢地尼、更昔洛韦、阿昔洛韦、泛昔洛韦、伐昔洛韦、阿奇霉素、盐酸米诺环素、穿琥宁等。
Ⅱ-ⅪA抗生素微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效性）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
第一法：管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
菌悬液的制备枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液：取枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。
用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）悬液：取短小芽孢杆菌［CMCC（B）63202］的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液：取金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
临用时，用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液：取藤黄微球菌［CMCC（B）28001］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面，用培养基Ⅲ或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
大肠杆菌（Escherichia coli）悬液：取大肠杆菌［CMCC（B）44103］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。
啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）悬液：取啤酒酵母菌（ATCC 9763）的V号培养基琼脂斜面培养物，接种于Ⅳ号培养基琼脂斜面上。
◇药品检验◇浅谈抗生素微生物检定———管碟法操作注意要点任董春(安徽金蟾生化股份有限公司中心化验室,淮北 235000) 抗生素管碟测定法是利用抗生素在摊布特定实验菌的固体培养基内呈球面形扩散,形成含一定浓度抗生素球形区,抑制了实验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
根据抗生素在一定浓度范围内,对数剂量与抑菌圈直径(面积)呈线性关系,比较标准品与供试品两者对接种的实验菌产生抑菌圈的大小,计算出供试品的效价。
本文根据实践工作经验,对抗生素效价检定操作过程中应注意的要点作一总结简述。
1 称量1.1 标准品与供试品的称量最好一次称取,不得将已取出的标准品或供试品倒回原容器内,标准品称量不可少于20mg ,一般为50mg 以下。
取样后立即将称量瓶或适宜的容器及被称物盖好,以免吸水。
1.2 吸湿性较强的样品,在称量前1～2h ,更换天平内干燥剂。
1.3 称量样品的容器重量最大不超过10g 。
称量标准品与供试品应用同一天平及砝码。
称量前被称的样品应放在干燥器内至少30min ,从冰箱取出的样品必须先在室温放置,使其温度与室温平衡后,才可称量。
2 稀释2.1 粉末状或结晶的供试品,第一步稀释应用容量瓶以消除体积上的误差。
稀释至5×102～1×103U ・L -1的溶液,以后的逐步稀释,也要用容量瓶稀释,并不超过3步。
2.2 每次吸取溶液用密刻度玻璃吸管,量取溶液前要用被量液流洗吸管2～3次。
吸取溶液后,用滤纸将外壁多余液体擦去,然后再从起始刻度开始放溶液。
注意放溶液时,吸管不要倾斜。
2.3 稀释供试品与标准品用的缓冲液,应用同一瓶内的缓冲液,以免因p H 或浓度不同而影响抑菌圈的生长与圆整。
2.4 与标准品所用的溶剂量及溶解时间等应尽量一致。
稀释时每次加液至容量瓶近刻度前,稍放置片刻,待瓶壁的液体完全流下,再准确补加至刻度。
2.5 用于稀释的刻度吸管和容量瓶,必须经过标定。
3 双碟的制备3.1 用水平仪检查效价测定操作台面是否水平,设法调整使其达到水平。
05版药典微生物限度检查法操作要点林丽英05版药典微生物限度检查法与以往药典的最大不同就是多了方法验证。
由于以前版本的药典没有要求对检验方法进行必要的验证，所以大家都觉得不好理解、不好难操作。
为了更好执行05版药典，现根据我的理解，对药典上的各种检验方法在验证时的操作要点与大家作个探讨。
一、验证的目的由于制剂在投料和加工过程中，或有抑菌成份存在，或由于各种成份相互作用的结果，将可能对某些类型的微生物的检出产生影响。
对所建立的微生物限度检查法进行验证的目的，就是要对每个样品使用适宜的检验方法，顺利的检出样品中污染的各种类型的菌。
细菌计数验证所用的菌株：大肠埃希菌[CMCC（B）44102]：代表革兰阴性菌；金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]：代表革兰阳性球菌；枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]：代表革兰阳性杆菌；霉菌计数验证所用的菌株：白色念珠菌[CMCC（F）98001]：代表酵母菌；黑曲霉[CMCC（F）98003：代表霉菌；由于每个菌株代表不同类型的菌，所以只有这五个菌株的回收率均达到要求，才表明样品中污染的各种类型的菌都可能检出来，否则，所得的结果是不能真实地反映样品的污染情况的。
菌液的制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时。
上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～l00cfu的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5~7天，加入3~5ml 0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，吸出胞子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每lml含孢子数50～l00cfu的孢子悬液。
二、方法的验证所有验证方法的操作均应在阳性接种间。
抗生素的生物效价测定法(管碟法)work Information Technology Company.2020YEAR抗生素的生物效价测定法测定抗生素效价的方法比较多，一般可以分为物理学方法、化学方法、生物学方法、和两种方法配合等四大类，可根据具体情况选择使用。
生物学方法以抗生素的杀菌力作为衡量效价的标准，其原理恰好和临床应用于的要求一致这是它的优点；又其灵敏度较高，需用检品的量较小，也是其它方法所不及的。
抗生素的生物效价测定法，常用的有稀释法、比浊法和扩散法（或称渗透法）。
稀释法这一方法是用培养基将检品抗生素稀释到各种浓度，并依次分装到一系列的容器内，再加入等量“试验菌种”菌种菌液，并放在37 ℃保温箱内培养一定时间，观察何种稀释度适能抑制细菌的生长，该稀释度即为测定终点（或以细菌生长所引起的PH改变及溶血现象等生化反应作为测定终点），再与同样处理的标准抗生素的终点作比较，即可求得检品的效价。
这种方法可以使用液体培养基，也可以使用固体培养基。
所用的材料及培养基都必须严格无菌，并要注意无菌操作。
由于测定终点是以有无细菌生长来判断的，因此所得结果公是一个范围。
比浊法原理及操作大致与稀释法相同。
比浊法也是将不同量的检品及标准品分别加入培养基中，观察其对“试验菌种”的效应——即细菌生长所引起的混浊。
这一方法和稀释法的区别有二：a.比浊法的稀释间隔的密度比较近，准确度高一些；b.比浊法不以细菌有无生长的区分为终点，而是将标准品浓度和细菌生长所引起的混浊度求得一定的比例，再由检品的细菌生长混浊度推算检品的效价。
这一方法易受杂质的影响，并且不适用于有色或混浊的检品。
扩散法使用固体培养基，在培养基凝固以前将“试验菌种”混合进去，在这样备妥的培养表面，可以用种种设计使检品液或含有抗生素的物质与有菌种的培养基接触。
经过培育后，由于抗生素向培养基中扩散，凡抑菌浓度所能达到之下细菌不能生长因而形成透明的抑菌范围，此种范围一般都呈圆形，称为“抑菌圈”。
发布日20070423期栏目化药药物评价>>化药质量控制标题抗生素微生物检定方法学验证中的常见问题分析作者审评三部部门正文内审评三部审评五室刘英容摘要：本文对抗生素微生物检定法中的管碟法在方法学验证中的常见问题如线性与范围中溶液浓度与直径的关系、精密度的测定方法等进行了分析，归纳其错误的问题，给出了正确的操作方法。
关键词：抗生素微生物检定法多组分抗生素方法学验证抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生素测定方法。
自20世纪40年代建立至今，在各国药典中被普遍采用。
虽然伴随着HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品种的效价已被化学分析法所取代，但由于①微生物检定法可直观、特异地反映出抗生素品种的抗菌活性；②多组分抗生素由于结构与不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、含量和生物活性间的关系；③许多抗生素品种由于各种原因如无特征紫外吸收等，目前没有适当的化学分析方法表征其活性，故抗生素微生物检定法目前在各国药典中仍占有重要的地位，且短期内化学分析法不可能完全取代微生物检定法。
中国药典2005年版仍采用抗生素微生物检定法中的管碟法测定其效价，目前申报已有国家标准的该类制剂较多，在质量研究中存在诸多问题，现就常见的问题加以分析，希望对注册申请人有所帮助。
一、方法的建立1、供试品与标准品的同质性抗生素微生物检定法的原理以供试品与标准品同质为前提，方法建立前，首先应确定供试品与标准品是否同质，包括化学结构、所含组分及组分比例的一致性，对于制剂还要考虑辅料的影响是否造成供试品与标准品不同质。
2、培养基、试验菌、缓冲液和培养条件的选择可参照中国药典建立，在此不再赘述。
3、检定方法的确定可采用一剂量法（标准曲线法）、二剂量法及三剂量法等。
一般确定线性与范围采用一剂量法（标准曲线法），常规含量测定采用二剂量法，标准品标定采用三剂量法。
4、抗生素溶液的稳定性选定的品种可参照中国药典现行版附录抗生素微生物检定法的品种，若溶剂和缓冲液与其不同，应考察抗生素储备溶液和测定溶液在室温、40℃和不同pH值缓冲液中，以及放置不同时间的稳定性，以确定抗生素储备溶液和测定溶液的存放时间和条件。
2005年版《中国药典》抗生素品种高效液相色谱法的增修订情况简介余立（北京药检所）一、 概述2005年版《中国药典》中收载的抗生素品种共有284个，其中使用了HPLC法的品种有205个，约占70%。
用于检测的项目有：鉴别、有关物质检查、组分测定、含量均匀度和含量测定。
与2000年版《中国药典》相比，2005年版《中国药典》抗生素品种对HPLC法的使用在应用范围上有所扩大。
2005年版《中国药典》抗生素品种中有41个2000年版《中国药典》原有品种在鉴别项中增加了HPLC法，替代了原来专属性不强的项目，有效减少了不同药品具有相同鉴别反应现象的几率。
比如：红霉素硫酸显色→HPLC青霉素钠、钾酶灭活→HPLC依诺沙星丙二酸＋醋酐显色→HPLC绝大多数新增品种在鉴别项中选用了HPLC法，如新增的沙星和头孢类品种。
有39个2000年版《中国药典》原有品种将含量测定方法由微生物效价检定法、UV法、电位滴定法等专属性不强的方法改用了HPLC 法，使降解产物、辅料不再干扰对主成分的测定，高科技造假物也不能鱼目混珠了。
同时对于某些品种也简化了实验操作，缩短了检验时限，降低了对实验者操作技能的要求。
比如：克拉霉素、罗红霉素由微生物效价→HPLC甲砜霉素/肠溶片/胶囊由电位滴定法→HPLC氯霉素/滴耳液由UV→HPLC大多数的新增品种在含量测定中选用了HPLC法，如：几乎所有的新增喹诺酮类和头孢类品种。
2005年版《中国药典》抗生素品种中有61个原有品种用HPLC 法增订了有关物质，其中有22个品种是从原来量加和较为困难的TLC法转用HPLC法的，还有30个增订品种的有关物质检查项选用了HPLC法另外，2005年版《中国药典》抗生素品种中有15个品种的组分测定采用了HPLC法。
二、色谱系统适用性试验的变化趋势HPLC法虽然是药物分析中定性、定量的一个很好的方法，但是色谱系统的有效性是其能否圆满完成使命的保证。
色谱系统的有效性通常是通过系统适用性试验来检验的。
抗生素微生物检定标准操作规程1 简述抗生素微生物检定法系在适宜条件下，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
依试验设计原理不同，可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法。
后二者被列为抗生素微生物检定的国际通用方法。
中国药典也采用这两种方法。
抗生素微生物检定管碟测定法系琼脂扩散法，是利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
此法系根据抗生素在一定浓度围，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
抗生素微生物比浊法是将一定量的抗生素加至接种有试验菌的液体培养基，混均后，经培养，测量培养基浊度。
此法系根据抗生素在一定的浓度围，其浓度或浓度的数学转换值与试验菌生长产生的浊度（浊度与细菌群体质量及细菌细胞容积的增加之间存在直接关系）之间存在线性关系而设计，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，计算出供试品的效价。
抗生素效价以“单位（u）”或“微克（µg）”表示。
抗生素管碟测定法2 仪器与用具2.1 操作室光线明亮，操作室应分为两部分，彼此分开，其中一部分为一般操作室，一部分为半无菌操作室。
半无菌操作室应设有紫外线灭菌灯，并附设空气净化（空气净化级别为100级～10，000级）及空调设备，控制室温在20～25℃之间，达到无菌或半无菌状态。
操作台应稳固，台面用玻璃板，并用水平仪调节至水平。
注意操作，避免室抗生素污染。
2.2 双碟径约90mm，高16～17mm硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡。
碟底平度检查，可将双碟放在水平台上，下垫一白纸，碟加水2～3ml，再滴加蓝墨水，观察蓝色深浅是否一致。
用过的双碟经高压灭菌倒出培养基后，置清洗液中浸泡过夜，冲洗，沥干，至150℃～160℃干热灭菌2小时或高压121℃蒸气灭菌30分钟，备用。
管碟法测定抗生素效价中的影响因素分析及对策添加时间：2005-04-14 作者:唐靓, 盛清, 朱染枫所属类别:学术科研/药品电话:单位:Email:联系地址:关键字:管碟法；抗生素；效价；抑菌圈摘要:摘要: 目的提高管碟法测定抗生素效价的准确性。
方法按操作步骤逐步分析，并提出合理的解决方案。
结果减少外界因素与人为因素给试验带来的误差。
结论可以提高测定结果的准确性。
正文:Abstract: OBJECTIVE To improve the veracity of antibiotics titer evaluation by cylinder-plate method. METHOD According to the process of test, analyze the test and offer a proper measure to avoid influencing factors. RESULTS Reduce the errors caused by environmental and artificial factors. CONCLUSION This can improve the veracity of test results.Key words: cylinder-plate method; antibiotics; titer; bacterial inhibition ring管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。
但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。
根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。
1. 实验器材的准备1.1 实验器材的选择试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。
微生物检验规程1.实验注意事项1.1无菌操作要求1.1.1 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。
1.1.2专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。
1.1.3 接种样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。
1.1.4 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。
1.1.5 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。
1.1.6 接种样品、转种细菌必须在酒精灯旁操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞（即硅氟胶塞）都要通过火焰消毒。
1.1.7 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处。
1.1.8 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。
1.2无菌间使用要求1.2.1 无菌间内应保持清洁，工作后用消毒溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。
1.2.2无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。
1.2.3处理和接种样品时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。
1.3消毒灭菌要求1.3.1灭菌前准备（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。
（2）装培养基的三角瓶，内容物不应超过总体积的2/3（例如500mL的三角瓶最好装300～350mL培养基，以防再次加热融化时爆沸）。
（3）无菌室内使用的毛巾、脱脂棉球用纸包裹，进行湿热灭菌。
1.3.2装放（1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。
浅谈抗生素管碟测定法的操作要点
舒畅;韩立;崔清兰;刘占通
【期刊名称】《河南畜牧兽医》
【年(卷),期】2007(028)05S
【摘要】管碟测定法是根据抗生素在一定浓度范围内的对数剂量与抑菌圈的直径（面积）呈线性关系的原理，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价的一种方法。
由于抗生素药品的主要医疗作用是抗菌，管碟法是以抗生素对细菌或霉菌的抗菌能力作为客观指标来衡量抗生素的效力，其原理恰好与临床应用的要求一致，能直接反映出抗生素对微生物（细菌、霉菌）的杀灭或抑制能力。
此方法自20世纪40年代建立至今，在各国药典中被普遍采用。
【总页数】2页(P39-40)
【作者】舒畅;韩立;崔清兰;刘占通
【作者单位】河南省兽药监察所,河南郑州450002
【正文语种】中文
【中图分类】S816.73
【相关文献】
1.高分子聚合物研究与中国药典2005年版β-内酰胺类抗生素高分子聚合物修订情况及操作要点 [J], 袁雯玮
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抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。
各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。
管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。
管碟法的操作步骤：1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。
2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。
4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。
5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。
6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。
7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。
8、抑菌圈的测量：抑菌圈测量仪的使用，每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。
手工测量：游标卡尺9、结果的可靠性检验及效价测定：抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结果。
操作要点第一步一般应制成500或1000单位/毫升的溶液，以后逐步稀释至供试浓度的溶液，稀释步骤应为3～4步。
溶解：对于需用乙醇溶解的样品，由于溶解样品时所用乙醇量较大，加灭菌水后溶液放热，因此需充分摇匀后加灭菌水至接近容量瓶刻度，待冷至室温后再稀释至刻度。
标准品溶液与供试品溶液浓度的比值D应控制在±5%以内，以保证两者浓度的偏差在一定范围内。
试验菌的菌龄对抑菌圈有一定影响。
故检定时应保持菌种及菌液的新鲜。
一般菌种一月转种一次，冰箱冷藏保存。
对易变异的菌株，如藤黄微球菌等在制备菌悬液前进行单菌分离；其他菌株可半年分离一次。
试验菌传代最好不超过5次，以防止菌种老化变异。
芽孢杆菌培养物用灭菌水洗下后，应在65℃加热30分钟，使菌体的菌龄一致，用革兰氏染色，应有芽孢85%以上。
加入菌悬液的体积，一般不少于0.3ml，并且不大于上层培养基体积的2%。
如果加入菌悬液的体积过小，则在同次实验中，不同次加入菌悬液的体积相差较大，造成实验误差；如果加入菌悬液的体积过大，则会使上层培养基变稀，并且因菌悬液的温度较低，加至培养基中可能造成培养基结块，影响测定结果。
对于加入菌悬液体积的控制，可通过调节菌悬液的浓度来实现。
在制备菌层培养基时，将菌液加入菌层培养基后，立即充分摇匀，但应避免产生气泡。
加入芽孢悬液时，菌层培养基的温度为65℃，对非芽孢悬液时，菌层培养基的温度一般为48～50℃。
放置孵箱培养时排放应不得超过三层，避免因培养温度不均匀而导致各双碟中抑菌圈大小不一。
抗生素原料药：不含辅料的药物制剂原料，一般其效价以纯度（u/mg或µg/mg）表示。
检验时，可参考该品种的药品标准纯度限度规定或厂方提供的纯度估计效价，取样试验，如估计效价与实际效价相差较远时，即测定所得效价超出估计效价的±10%时，则重新估计效价，再做准确测定。
粉针剂：指注射用无菌粉末或冻干品，用西林瓶橡胶塞铝盖封装或熔封在安瓶内，一般测定其纯度（u/mg或µg/mg）或整瓶效价。
取装量差异项下的内容物，称取适量（50mg以上，根据标示量及平均装量折算估计效价，并按估计效价及量瓶体积计算取样量），置量瓶中，加标准中规定的溶剂溶解，稀释，测定，计算出1mg的效价单位数，再根据平均装量及标示量计算平均每瓶的百分含量。
水针剂（注射液）：即抗生素的灭菌水溶液，标示量一般按每毫升含效价单位计。
效价测定时，量取平均装量项下的内容物或5～10支的内容物，混匀，用干燥的刻度吸管吸取一定量的供试品，将吸管外壁用滤纸拭净，再弃去多余的溶液，使供试品至吸管刻度，沿量瓶颈部内壁缓缓流入已盛有一定量溶剂（以免抗生素结晶析出）的量瓶内，混匀，继续加溶剂至刻度，摇匀，再量取适量稀释至规定的浓度。
素片、薄膜衣片：称取20片的总量，求出平均片重，研细混匀后，精密称取适量（约相当于1片的重量或根据标示量按平均片重及所用量瓶体积折算取样量），置量瓶中，用标准中规定的溶剂溶解，并稀释至刻度，摇匀。
再量取适量稀释至规定浓度。
注意点：研磨时应注意环境干燥，可在干燥操作柜内操作，研磨要迅速，避免吸湿，因片剂内含辅料较多，辅料可能漂浮于溶液表面，稀释时量取供试溶液应读取辅料下层的溶液切面；如沉淀较多，须待其下沉后再量取上层液；有些辅料吸附抗生素，应加以注意。
为节约供试品，可与重量差异检查结合进行。
糖衣片、肠溶片：取标准中规定的片数，置于乳钵中，研细，分次加入规定的溶剂，研磨使其溶解，将研磨液转移至瓶口放有小漏斗的量瓶中，量瓶体积根据供试品标示量、所取片数及抗生素储备液浓度（一般为1000单位/ml）选定，用规定溶剂稀释至刻度，摇匀，静置，使辅料下沉而抗生素已溶解在溶液内，精密吸取量瓶中的上层液适量，作进一步稀释。
个别品种标准如同时收载了糖衣片和薄膜衣片，可能规定薄膜衣片也取整片制备供试溶液。
胶囊剂：取装量差异项下的内容物，混合均匀，研细，根据平均装量，精密称取约相当于1粒胶囊的量或按标示量、量瓶体积及抗生素储备液浓度等计算的取样量，置于量瓶中，加规定的溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，如供试品含有较多的辅料，则照片剂项下的方法进行。
颗粒剂、干混悬剂：取装量差异项下的内容物，混匀，根据平均装量，精密称取约相当于1袋（包）的量或按标示量、量瓶体积及抗生素储备液浓度等计算的取样量，置于量瓶中，加规定的溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
量取适量稀释制成供试品溶液。
测得效价后，再根据装量差异项下的平均装量，计算出平均每袋（包）的效价，根据标示量即可算出含量。
软膏剂、眼膏剂：擦净软膏剂或眼膏剂软管的外壁，切开封口，置于干燥器内约1小时，取干燥的洁净分液漏斗，带手套操作，将膏剂软管连同内容物在天平上称重，取出，将内容物挤入分液漏斗，量约2g，再称取膏剂软管的重量，按减重法以前后称量之差计算分液漏斗内膏剂供试品的量，以不含过氧化物的乙醚或石油醚等作溶剂溶解基质，但基质中的抗生素则应不溶于或几乎不溶于该有机溶剂中，以避免提取过程中抗生素的损失。
按标准中的规定加提取溶剂至分液漏斗中，振摇，使基质溶解，用规定的缓冲溶液提取抗生素至水相中，用缓冲溶液提取3次，合并3次的提取液，置量瓶中，加缓冲溶液至刻度，依法操作，计算效价。
实验要点磷霉素钠，磷霉素钙，磷霉素氨丁三醇主要问题：抑菌圈偏小解决：1. pH9.0抗Ⅱ号培养基（pH7.8～8.0）2. 滴加药液后，室温放置1小时后，放入孵箱内培养。
3. 培养时间以24小时为宜，培养时间短，抑菌圈清晰度不好，培养24h后如抑菌圈仍不清晰，应室温放置一段时间待清晰后再测量。
啤酒酵母菌的培养主要问题：生长不良CP2005：抗Ⅴ号琼脂斜面及抗Ⅳ琼脂斜面解决：1. 采用沙氏或YPD酵母菌培养基；2. 32～35℃培养24小时沙氏培养基蛋白胨10g 葡萄糖40g琼脂13g 水1000ml调节灭菌后pH5.4～5.8YPD培养基蛋白胨10g 葡萄糖40g酵母粉5g 琼脂13g水1000ml管碟法特点：优点：基本操作和设计适用于各种抗生素，试验结果较稳定；样品用量少，灵敏度高；适合于大批样品的测定。
缺点:凡具有抗菌活性的物质都会干扰测定结果；试验过程长，需第二天才有结果；操作手工化，需熟练人员才能得到较正确的结果；受扩散因素的影响，如培养基原材料的质量，一般琼脂中的杂质可能影响扩散速度及效价强度。
管碟法抗生素效价测量管碟法抗生素效价测量 - 简介抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。
管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。
管碟法抗生素效价测量 - 原理当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。
因此，当抗生素浓度达到或高于 MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。
根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。
北京潮声公司具有同行业的领先水平。
在管碟法抗生素效价测量实验中需要注意的影响因素分析及对策如下：管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法【1】，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。
但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。
根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。
管碟法抗生素效价测量 - 实验1. 实验器材的准备1.1 实验器材的选择试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。
可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。
小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。
如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。
1.2 实验器材的清洗抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。
由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素（庆大霉素、争光霉素、链霉素等）或者被清洗用的杀菌剂（如新洁而灭、洗洁精、去污粉等）污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。
因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。
160℃干热灭菌2h 后备用。
2. 配制试验所需的样品、标准品、缓冲液与培养基2.1 样品与标准品溶液的配制标准品与样品从冰箱取出后，使与室温平衡。
