拟南芥核苷磷酸化酶基因的组织表达及其T-DNA 插入突变
体鉴定
徐文晶;程玉祥
【摘要】To explore information and physiological function of nucleoside phosphorylase genes,by using PCR method,the authors examined gene expression of nucleoside phosphorylase in different tissues of model plant arabidopsis, and further screened T-DNA-inserted mutants of these genes. Results:Transcriptional expression of At4g28940 and At4g28940 is high in root tissues ,and slight transcript levels are detected in other tissues ,while At4g24350 gene expression is low in various tissues .After the identification of T-DNA insertion and transcriptional levels of the
genes ,the knockout mutants of At4 g28940 and At4 g24350 have been attained in this study .%为探明植物核苷磷酸化酶家族基因信息及生理功能，采用 PCR 扩增的方法，研究了模式植物拟南芥核苷磷酸化酶家族基因在不同组织中的表达，并对其核苷磷酸化酶基因 T-DNA 插入突变体进行鉴定。结果表明：
At4g24340和 At4g28940基因在根组织中大量转录表达，其他组织均微量检测到转录表达；At4g24350在各个组织中均有少量转录表达；经 T-DNA 插入结合转录表达鉴定，At4g28940和 At 4g24350基因为敲除突变体。
【期刊名称】《贵州农业科学》
【年(卷),期】2015(000)001
【总页数】4页(P16-19)
【关键词】拟南芥;核苷磷酸化酶;突变体
【作者】徐文晶;程玉祥
【作者单位】东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040【正文语种】中文
【中图分类】S503.52
核苷磷酸化酶(Nucleoside phosphorylase，NP)是核苷酸补救合成途径的代谢酶[1]。嘌呤核苷磷酸化酶(PNP，EC 2.4.2.1)是核苷磷酸化酶家族的一个小亚家族，在无机磷酸存在下其可逆地催化核苷或脱氧核苷糖苷键断裂，生成嘌呤碱和一磷酸核糖或脱氧核糖[2-3]。嘌呤核苷磷酸化酶在医学上的研究报道较多，其缺乏症患者通常存在严重的免疫缺陷和神经系统功能障碍，还会引起血内尿酸不足，家族性痉挛性截瘫，脑血管病变导致的中风，多灶性白质脑病等[4-8]。植物中也存在核苷磷酸化酶，拟南芥叶绿体多核苷磷酸化酶(cpPNPase)参与r RNA和m RNA的3′末端的成熟[9-10]。然而，对于植物中核苷磷酸化酶生理功能人们了解甚少。最近有研究报道[11]，毛果杨基因组中存在13个NP-like基因，可能是一类营养储存蛋白。基于笔者实验室前期研究与分析推断，毛果杨部分核苷磷酸化酶很可能和次生细胞壁代谢与修饰相关。然而，在杨树中无法获得这些基因敲除的多重突变体用于其遗传功能鉴定。对毛果杨13个NP-like基因在拟南芥数据库BLASTP中同源检索，仅得到At4g24340、At4g24350和At4g28940同源对应基因，且目前未见这些基因的T-DNA插入突变体的相关报道。为此，笔者等选择易于获得家族基因多重突变体的模式植物拟南芥，分析其At4g24340、At4g24350和
At4g28940基因的组织表达模式，并筛选、鉴定其T-DNA插入突变体，以期为
下一步研究植物的核苷磷酸化酶的功能奠定基础。
1.1 试验材料
1.1.1 拟南芥野生型拟南芥均为Columbia型，购自ABRC(Ohio State University，USA)。
1.1.2 T-DNA插入株系 At4g28940基因的T-DNA插入株系为SALK_149317 C
和SALK_018193 C，At4g24350基因的T-DNA插入株系为SALK_072656 C，At4g28940基因的T-DNA插入株系为CS491284，均购自ABRC(Ohio State University，USA)。
1.1.3 主要试剂植物基因组DNA快速提取试剂盒、pBIOZOL Reagent和Silica Bead DNA Gel Extraction Kit，分别购自百泰克、BioFlux和Fermentas公司；pMD18-T载体、Taq DNA聚合酶和PrimeScript RT reagent Kit With gDNA
反转录试剂盒，购于TaKaRa公司；引物由Invitrogen公司合成。
1.2 植物基因组 DNA、总 RNA的提取及cDNA的合成
1) 植物基因组DNA的提取。参照试剂盒说明书进行。
2) 植物总RNA提取及cDNA合成。植物材料经过液氮速冻、研碎至粉末，用4℃预冷的pBIOZOL试剂悬浮粉末后移入1.5 mL离心管，具体步骤参照pBIOZOL Reagent说明书进行。总cDNA合成采用Primescript RT reagent Kit with gDNA eraser试剂盒。
1.3 引物设计序列及PCR扩增
SALK和CS株系插入T-DNA左臂端鉴定引物分别为LBb1:5’-GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3’和LBb3:5’-TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCTCGATACAC-3’。
基因引物为SALK_149317C-LP:5’-TCATACCCTAAGGTTTACTGAGT-3’和RP:5’-TATTTTGGGGTCAACTTACTCAC-3’；SALK_018193C-LP:5’-
GATAAATAATTGCTTCTCCTTCA-3’和RP:5’-TGAATCACAATGTTAGAAACGTG-3’；SALK_072656C-LP:5’-GAGCTATACAACATACTGATTAG-3’和RP:TTGTCACGGGTTCGTTGATATGA；CS491284-LP:5’-GCCATGCTTATCACGTGTGTATT-3’和RP:5’-CAGACTTAAGCTATAGAACAACC-3’。
基因转录表达半定量分析的引物为At4g24340-LP∶5’-GGCTTCCATGGATCACAATCATT-3’和RP∶ 5’-AAGGATGCGTAGGATCGAGTCT-3’；At4g24350-LP: 5’-GTCTAGAGACGAGAAGCACGTG-3’和RP:5’-CAATGACCGTCACGAGACCGAT-3’；At4g28940-LP: 5’-GATTGGCGACGTCACTATTCCT-3’和RP: 5’-GCGTGCAAGTTTCAAGTAGGAC-3’。
PCR扩增为20 μL体系：13 μL水，2 μL dNTP (2 mM)，2μL 10×Buffer，1.0
μL Taq DNA聚合酶，上下游引物各0.5 μL和1.0 μL模板。PCR反应程序：预变性95℃ 3 min，变性95℃ 30 s，转录表达引物及T-DNA鉴定引物退火温度分别为59℃和62℃，32次循环。
1.4 At4g24340、At4g24350和At4g24340基因的组织表达特性及T-DNA插入突变体鉴定
1) 组织表达特性。提取野生型拟南芥不同组织的总RNA，以合成的总cDNA为模板进行定量PCR扩增。
2) 插入突变体鉴定。提取待鉴定的植株基因组DNA作为模板，分别使用LP和RP、LP和LBb1(或LBb3)、LBb1(或LBb3)和RP 3对引物进行PCR扩增，进行
T-DNA插入突变体的鉴定；将上述T-DNA引物与基因引物PCR扩增的片段从琼脂糖中回收，连接到pMD18-T载体上，选择有插入片段的克隆进行测序，以确
定T-DNA的插入位置。
3) 插入纯合突变体的目标基因转录分析。提取待鉴定植株的总RNA，分别合成总cDNA，再进行半定量RT-PCR扩增。
2.1 At4g24340、At4g24350和At4g24340基因的组织表达
从图1看出，At4g28940和At4g24340基因在根组织中大量转录表达，其他组织均微量检测到转录表达；At4g24350在各个组织中均有少量转录表达(图1)。表明，At4g28940和At4g24340基因在根组织中特异地高丰度表达。
2.2 At4g24340、At4g24350和At4g28940基因T-DNA插入突变体的鉴定
从图2可知，在SALK_149317C的2个植株中，基因引物均未扩增出目标带，提示被T-DNA所插入，进一步用基因引物与T-DNA引物扩增出目标带，表明T-DNA插入在该基因的区域，并且这2个植株均是T-DNA插入纯合体(图2a)。同理，SALK_018193 C、SALK_072656 C和CS491284株系的6个植株都是T-DNA插入纯合体(图2b-d)。从图3看出，经过测序，SALK_149317 C为反向T-DNA插入突变体，SALK_018193C为正向T-DNA插入突变体，插入位点分别在At4g24340第1内含子113 bp处和第5内含子27 bp处；SALK_072656C则为反向T-DNA插入，插入位点在At4g24350第5外显子118 bp处；
CS491284为反向T-DNA插入突变体，插入位点在At4g28940的5’UTR上，距起始密码子上游54 bp处。
2.3 T-DNA插入纯合突变体的目标基因转录
从图4可知，在At4g28940基因T-DNA插入纯合体SALK_149317C和SALK_018193C中，未检测到该基因的转录，而野生型则正常转录表达。表明，SALK_149317C 和SALK_018193C是At4g28940基因的敲除突变体，分别命名为at 4g24340-1 和at4g24340-2。同样，SALK_072656C是At4g24350基因的敲除突变体，命名为at4g24340-1。然而，CS491284正常转录表达，应不是
At4g 28940基因的敲除突变体，命名为at4g28940-1。
1) 核苷磷酸化酶广泛存在于哺乳动物和细菌中，在核苷酸补救合成途径中起到关
键作用。在植物中，还没有证据表明核苷磷酸化酶在核苷补救途径中具有代谢功能[7]。研究结果显示，拟南芥基因组中只有3个嘌呤核苷磷酸化酶的推测基因
At4g24340、At4g24350和At4g28940，数量较少，At4g28940和
At4g28940基因在拟南芥根组织中特异地高丰度表达，推测其很可能参与根的形成，但还需要以后研究中的遗传学证据证实。
2) 在SALK_149317C的2个植株中，基因引物均未扩增出目标带，提示被T-DNA所插入，进一步用基因引物与T-DNA引物扩增出目标带，表明T-DNA插
入在该基因的区域，并且这2个植株均是T-DNA插入纯合体。同理，
SALK_018193C、SALK_072656C和CS491284株系的6个植株都是T-DNA插
入纯合体。经过测序，SALK_149317C为反向T-DNA插入突变体，
SALK_018193C为正向T-DNA插入突变体，插入位点分别在At4g28940第1内含子113 bp处和第5内含子27 bp处；SALK_072656C则为反向T-DNA插入，插入位点在At4g24350第5外显子118 bp处；CS491284为反向T-DNA插入
突变体，插入位点在At4g28940的5’UTR上，距起始密码子上游54 bp处。3) 突变体材料是一种通过反向遗传学策略鉴定基因的功能。本研究中筛选、鉴定
了拟南芥At4g24340、At4g24350和At4g28940核苷磷酸化酶基因T-DNA插
入突变体，得到目的基因完全敲除的纯合突变体at4g24340-1、at4g24340-2和at4g24350-1。然而，由于CS491284株系正常转录表达，应不是At4g28940
基因敲除突变体，命名为at4g28940-1。At4g24340 和At4g24350基因突变体都没有出现根器官生长缺陷的表型，可能与这两个基因高度同源相关。后续工作将构建拟南芥核苷磷酸化酶小家族基因的多重突变体，用于其遗传功能的鉴定。
*通讯作者：程玉祥(1972-)，男，教授，从事树木分子遗传与育种研究。E-mail: *********************.cn
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[1] Lewkowicz E, Iribarren A. Nucleoside phosphorylases [J]. Current Organic Chemistry, 2006,10(11):1197-1215.
[2] Pugmire M J, Ealick S E. Structural analyses reveal two distinct families of nucleoside phosphorylases [J]. Biochemical Journal, 2002,361 (1):1-25.
[3] Bzowska A, Kulikowska E, Shugar D. Purine nucleoside phosphorylases: properties, functions, and clinical aspects [J]. Pharmacology Therapeutics, 2000, 88(3): 349-425. [4] Cohen A, Grunebaum E, Arpaia E, et al. Immunodeficiency caused by purine nucleotide phosphorylase deficiency [J]. Immunology and Allergy Clinics of North America, 2000, 20(1):143-159.
[5] Al-Saud B, Alsmadi O, Al-Muhsen S, et al. A novel mutation in purine nucleoside phosphorylase in a child with normal uric acid levels [J]. Clinical Biochemistry, 2009,
42(16/17):1725-1727.
[6] Tabarki B, Yacoub M, Tlili K, et al. Familial spastic paraplegia as the presenting manifestation in patients with purine nucleoside phosphorylase deficiency [J].Journal of Child Neurology,2003,18(2):140-141.
[7] Tam D A Jr, Leshner R T. Stroke in purine nucleoside phosphorylase deficiency [J]. Pediatric Neurology, 1995,12(2):146-148.
[8] Parvaneh N, Ashrafi M R, Yeganeh M, et al. Progressive multifocal leukoencephalopathy in purine nucleoside phosphorylase deficiency [J]. Brain Development, 2007, 29(2): 124-126.
[9] Germain A, Herlich S, Larom S, et al. Larom S,Mutational analysis of Arabidopsis chloroplast polynucleotide phosphorylase reveals roles for both RNase PH core domains in polyadenylation, RNA 3'-end maturation and intron degradation [J]. The Plant Journal,2011 ,67(3):381-394.
[10] Germain A, Kim S H, Gutierrez R, et al. Ribonuclease II preserves chloroplast RNA homeostasis by increasing mRNA decay rates, and cooperates with polynucleotide phosphorylase in 3′end maturation [J]. The Plant Journal, 2012,72(6):960-971.
[11] Pettengill E A,Pettengill J B,Coleman G D.Elucidating the evolutionary history and expression patterns of nucleoside phosphorylase paralogs(vegetative storage proteins)in Populus and the plant kingdom [J].BMC Plant Biology,2013,13(8):118-135.
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拟南芥（Arabidopsis thaliana），是一种广泛分布于亚洲、欧洲以及北非地区的小型开花植物。从分类地位上讲，它属于十字花科(Brassicaceae) 鼠耳芥属(Arabidopsis)。作为近年来最为广泛应用的模式植物，拟南芥在分子遗传学、植物学以及农业科学的研究中发挥了重要的作用，被称为植物中的果蝇，是目前公认的五大模式生物之一。拟南芥基因组测序已于2000年由国际合作完成，也是第一种完成全基因组测序和分析的植物。 拟南芥是二年生草本植物，高7～40厘米。基生叶有柄呈莲座状，叶片倒卵形或匙形；茎生叶较小，无柄，披针形或线形。叶片表面覆盖有单细胞表皮毛。总状花序顶生，花朵直径约3mm，花瓣4片，白色，匙形。长角果线形，长0.5～2厘米，每个含20～30粒种子。根分为主根和侧根，可容土壤细菌共生。春型拟南芥萌发后3周左右就可开花，能在6周内完成一个世代。严格自花传粉（图1）。 拟南芥生活史与一般的开花植物无异：减速分裂形成的大小孢子分别形成雌雄配子体，即胚囊和花粉。胚囊经过双受精的过程，受精卵与受精极核分别发育成胚和胚乳。 2拟南芥研究的主要策略 在拟南芥研究中，使用最多的是遗传学研究策略，包括正向遗传学和反向遗传学。正向遗传学遵循的是从突变体表型分析到基因功能认识的思维方式，它首先关注的是具有某种缺陷的突变体。譬如，如果要研究与植物抗旱机理有关的基因调控过程，可以先用化学、物理或者生物的方法将野生型拟南芥诱变，然后在干旱胁迫的条件下进行突变体的筛选。如果在诱变群体后代中出现了对干旱条件反应不同于野生型的个体(例如比野生型更加抗旱或者不抗旱的植物)，这种个体就是突变体。这种植物对干旱的不同反应可能就是因为突变体中某一个基因遭破坏后所造成，而这个基因必定与植物的抗旱机制有关。 在得到了这样的一个突变体之后，可以对其中的突变基因进行定位和克隆。在获得了基因序列后，可以更深入地了解这个基因的功能，并分析它是以何种形式影响了植物的抗旱途径以及与抗旱途径中其他相关基因的关系。 对正向遗传学来说，突变表型是所有研究工作的起点。如果一个基因突变之后没有显著的表型改变，那它的突变体也就很难在筛选过程中被发现。因此，正向遗传学不适用于研究这类基因。事实上，拟南芥中有许多基因都存在功能上的冗余性，即某些基因在功能上可以部分互相替代，其中一个基因的突变往往不会产生十分明显的表型变化。这些基因在蛋白质序列上也往往会存在着很高的同源性，通常把它们称为一个基因家族。据估计，拟南芥有65% 的基因可以归并到某个家族中[9]，这意味着相当一部分基因可能无法通过正向遗传学来揭示它们的主要功能，需要反向遗传学的介入。 反向遗传学是在已知某个特定基因序列的前提下去探索这个基因的功能。例如，可以利用已知的基因序列构建该基因的反义RNA 或者双链RNA 结构，用这样的构建去转化野生型植物。这种构建在植物中有可能干扰其内源基因的表达，甚至干扰该基因所在的家族基因的表达。根据一些基因受到干扰后出现的表型，可以推测这个基因或者与其同源的基因的功能。此外，反向遗传学研究还可以用在不同时空表达的启动子来驱动已知序列基因的表达，研究该基因过量表达或者时空异位表达时的植物表型，推测该研究基因的功能。 3拟南芥研究的一些重要发现 鉴于拟南芥在遗传操作上所具有的优势，它广泛应用于植物整个生命活动各个过程的研究，取得了一系列重要发现。在植物形态建成研究中，经典的例子是花发育的ABC 模型[10~12](图1)。在结构上，拟南芥的花与大多数开花植物相似，由四轮基本的花器官组成：从外向里分别为花萼、花瓣、雄蕊及雌蕊。ABC 模型中的A、B、C 分别指的是控制不同花器官发育的三大类基因，其中A类基因决定了花萼的特征；A类+B类基因共同作用决定了花瓣特征；B 类+C 类基因共同作用决定了雄蕊特征； C 类基因单
拟南芥谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶缺陷型突变体的特征描述 使用基于转基因的筛选，我们之前分离出一些蛋白质输入叶绿体有缺陷的拟南芥突变体。定位克隆其中的一个位点，CIA1，显示出CIA1编码谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶2 （A Tase2），是负责嘌呤从头合成第一个关键步骤的三个同工酶之一。CIA1突变体有正常的绿色子叶，但却有微小和白化或淡绿色的马赛克叶子。添加AMP而不是细胞分裂素或NADH 到植物液体培养基，部分补充了突变体的表现型。ATase1和ATase2都位于叶绿体上。ATase1的过量表达充分补充了ATase2缺陷型的表表型。也获得了一个T-DNA插入敲除A Tase1的突变体。突变体与野生型无法区分。一个敲除cia1/ATase1的双突变体与cia1有相同的表型，说明ATase1和ATase2之间至少有一部分基因冗余。Cia1突变体的特征描述显示出突变体叶子有略小的细胞尺寸但只有野生型叶子细胞数量的一半。这一表型确定嘌呤从头合成在细胞分裂中的作用。Cia1突变体分离出的叶绿体输入蛋白质的效率比野生型叶绿体少50%。添加ATP和GTP到分离出的突变体叶绿体不能恢复输入效率。我们可以得出结论嘌呤从头合成不仅对细胞分裂重要，而且对叶绿体的生物合成也很重要。 嘌呤环的从头合成是植物生长和发育所必需的。主要的产物，AMP和GMP，都是DNA和RNA的结构单位。AMP，当转化为ATP后，是多种细胞过程的主要能量来源。一些重要的辅酶，如NAD和FAD，也来自相同的途径。在热带固氮豆科植物的根瘤中，如大豆和豇豆，这一途径在初级氮代谢中也起到了主导作用。嘌呤生物合成途径中酶的活性与其他组织相比大大增强。因此，大部分植物嘌呤生物合成的研究都使用这些豆科植物的根瘤作为材料，集中于嘌呤生物合成在氮同化中的功能。研究嘌呤生物合成在正常植物生理或非固氮植物中的作用一直相对较少。 植物细胞中嘌呤生物合成的位置依然有争议，途经中的植物酶与在大肠杆菌中表达的相似，除了每种植物酶有一个被推测为作为细胞器定位信号的N-末端延长。根瘤的分馏法研究指出这一途径位于叶绿体。然而，最近的报道指出这一途径存在于线粒体和叶绿体或在细胞质中。 谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶（PRPP）（EC 2.4.2.14）催化嘌呤从头合成的第一个关键步骤，转化5-磷酸-（α）1-焦磷酸盐为5-磷酸-（β）1-胺。它受到反馈调节，并形成嘌呤从头合成的限速步骤。尽管它很重要，研究它在植物体内生长和发育的功能一直缺失。而且，在拟南芥中，这个酶由一个家族的三个基因编码。三个同工酶功能的关系也是未知的。在这篇文章中，编码同工酶的这三个基因称为ATase1（At2g16570）、ATase2（At4g34740）和ATase3（At4g38880），部分编码ATase1和A Tase2的cDNA也从幼龄花芽的cDNA文库中分离到。A Tase1在根和花中表达，A Tase2在根、叶和花中表达，ATase3在拟南芥基因组测序中发现并在长角果、茎生叶和根中以非常低的水平表达。 叶绿体中的大部分蛋白质由核基因组编码，在细胞质中合成作为N-末端延伸较高分子质量的前体，称为转运肽。输入这些蛋白质到叶绿体需要转运肽和叶绿体膜上的易位子复合物。易位子复合物位于外膜上的，称为Toc蛋白（易位子在叶绿体外膜），那些位于内膜的称为Tic蛋白（易位子在叶绿体内膜）。另外，输入也需要ATP和GTP。这些双嘌呤核苷酸在叶绿体蛋白输入中的确切功能仍然不清楚。然而，已经显示出ATP水解是前体蛋白结合然后易位跨过膜所必须的。酸解GTP类似物可以完全阻止前体结合叶绿体。而且，外膜易位子三个核心组分中的两个负责叶绿体蛋白输入的是GTPase，进一步突显出GTP在输入过程中
广东省天河区重点高中2018高考生物一轮复习专项检测试题39 1.高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是 A．将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中 B．将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上 C．将转基因植物叶片接种到无菌培养基上 D．将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上 【答案】C 【解析】植物组织培养中的外植体必须在严格的无菌环境中进行培养，而且操作的各环节都要注意严格灭菌，必须无菌操作，C对；葡萄酒的制作原理是利用酵母菌无氧发酵时产生酒精，在无氧条件下，大部分微生物都不能生存，随着发酵的进行，酒精度增大，也有杀菌的作用；而制作腐乳时，主要是将毛霉等微生物接种在豆腐上，此过程的加盐、加卤汤等操作均有一定的杀菌作用；选择培养基只能允许目的菌生长，会抑制其他杂菌生长，因此不是严格无菌操作时A、B、D选项的情况下比C选项的受影响要小。 【试题点评】本题考查对传统发酵技术的应用、微生物的培养和植物培养技术中无菌操作的掌握。重点要求考生熟悉相应操作过程中的注意事项，这种类型的题目考查的内容相对固定，重点放在细节，难度中等。 2.已知甲种农作物因受到乙种昆虫危害而减产，乙种昆虫食用某种原核生物分泌的丙种蛋白质后死亡。因此，可将丙种蛋白质基因转入到甲种农作物体内，使甲种农作物获得抗乙种昆虫危害的能力。 回答下列问题： （1）为了获得丙中蛋白质的基因，在已知丙种蛋白质氨基酸序列的基础上，推测出丙中蛋白质的序列，据此可利用方法合成目的基因。获得丙中蛋白质的基因还可用、方法。 （2）在利用上述丙中蛋白质基因和质粒载体构建重组质粒的过程中，常需使用 酶和。 （3）将含有重组质粒的农杆菌与甲种农作物的愈伤组织共培养，筛选出含有丙种蛋白质的愈伤组织，由该愈伤组织培养成的再生植株可抵抗的危害。 （4）若用含有重组质粒的农杆菌直接感染甲种农作物植株叶片伤口，则该植株的种子（填“含有”或“不含”）丙种蛋白质基因。 【答案】 （1）基因化学基因文库PCR（每空2分，共8分，其他合理答案也给分） （2）限制 DNA连接（每空1分，共2分） （3）乙种昆虫 （4）不含（3分）。
拟南芥突变体的相关研究 遗传学 摘要：本文列举了利用正向遗传法对拟南芥突变体的筛选、遗传群体的初步遗传群体及初步遗传图谱的构建和基因的图位克隆、遗传分析及相关基因的功能分析的流程，为拟南芥的研究提供更明确更清晰的思路。 关键词：拟南芥突变体；筛选；图位克隆；功能分析 1 拟南芥突变体的筛选 拟南芥是十字花科拟南芥属植物，近年来拟南芥以其个体小、生长周期短以及基因组小等特点而成为分子遗传学研究的模式植物。拟南芥的另一优点是很容易被诱变，目前已从拟南芥中分离得到了几千种突变体，这些突变体的获得为揭示植物生长发育规律起了非常重要的作用。拟南芥突变体的筛选已成为许多重要理论问题得以解决的前提，而筛选方法是突变体筛选成败的关键。这里拟南芥耐低钾突变体的筛选为例，介绍一种简单、灵敏、通用的拟南芥突变体的筛选方法。 1.1植物材料诱变 以拟南芥为材料，诱变方法如下：称取250mg(约5000粒）野生型种子置于50ml烧杯内并加入25ml重蒸水，搅拌30分钟；在4℃，下放置12小时后，把种子转移到盛30ml100mmol/L 磷酸缓冲液（PH6.5）的100ml三角瓶中，加入0.2%（V / V）的甲基磺酸乙酯（EMS），封 口后放在水浴（25℃）振荡器上振荡12h。然后用50ml蒸馏水漂洗种子4次，每次15min。将漂洗好的种子置于4℃下春化3天后种植。 1.2诱变植株培养 将经EMS诱变处理后的拟南芥种子（M1）播种于1/4Hoagland 营养液浸透的混有蛭石的营养土中，然后覆膜保湿。18-22℃、光照强度120umol/m2s-1、光周期16h/8h条件下培养，待种子成熟后分行采收种子。 1.3 突变体的筛选 拟南芥种子用0.5 %（v/ v）次氯酸钠加0.1%（v/ v）Tri-tonX-100表面消毒10分钟，再用无菌水冲洗3遍。接种前种子与0.4%（w/ v）低熔点琼脂糖混和，然后用吸管将种子吸出，成行地涂于MS培养基上；将培养皿置于4℃冰箱春化48小时，之后转入光照培养，培养皿垂直放置。培养箱温度22℃，连续光照，光强30umol/ m2s-1。 在确定的选择压力下，利用根弯曲方法对M2代进行筛选，将筛选得到的可能突变体再
插入诱变在拟南芥基因克隆中的应用 摘要随着各种基因克隆方法的建立,克隆的拟南芥基因越来越多,其中转座子标签和T-DNA插入诱变克隆的拟南芥基因的数目最多,插入诱变已成为克隆和鉴定很多重要植物基因的方法。 突变体在农业发展中起着重要作用,如苹果、玫瑰等许多园艺植物品种就是自然突变(芽变)经无性繁殖产生的。人们一直利用物理或化学诱变剂诱使植物大量变异,获得植株突变体。植物学家也利用这些突变体鉴定与克隆目的基因。插入诱变剂包括转移DNA(T-DNAs)和转座成分(转座子),是植物分子生物学家克隆基因最普遍使用的诱变剂,这些诱变剂既能使基因失活,又可重获植物基因组DNA,这个过程就是众所周知的基因标签,它不但能验证突变的目的基因对植物生物化学与发育过程的重要性,而且克隆相关基因的方法较为简便,不需了解目的基因产物或在基因组中位置。本文讨论插入诱变及拟南芥突变体基因的克隆。 1拟南芥遗传特性 与烟草等易于基因标签的物种比,拟南芥更适合于植物遗传研究。拟南芥矮小(株高为25~40cm),不需太大的生长空间;生长间期短(6~7周);自花授粉;结实率高(每株有5000~10000粒种子)等特性都有利于遗传分析。最重要的是,拟南芥基因组较小(120000kb)和少量分散的重复DNA有利于功能基因的标签,分离基因的工作量少。另外,拟南芥是一种开花植物,具有典型的植物细胞生理和发育过程,通常可假定拟南芥基因在其它大部分高等植物上具有相似的功能。2T-DNAs在拟南芥基因克隆中的应用土壤根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefacien)的转移DNA的T-DNA,是Ti质粒上能够诱导肿瘤的DNA片断。片断两端为25bp 的边界重复序列,当农杆菌侵染时,该片断转移到植物细胞并整合进基因组中。该过程能否诱导突变,插入T-DNA中的基因和突变体共分离,要看T-DNA整合到基因组中的位置(基因或非编码的DNA中)。 T-DNA插入诱变在拟南芥(Arabidopsis)中应用最为成功,在已报道的20000多转化体中克隆了20多个基因。此外,T-DNA插入诱变还应用于烟草(Nicotiana)、矮牵牛(petunia)和蕃茄(Lycopersicon),但目的是研究外源基因表达而不是诱导插入突变。据Koncz等人调查,T-DNA转化的烟草(Nicotiana)有30%的T-DNA插入到具有转录活性的DNA区域[1],但至今没有分离出一个T-DNA标签的烟草基因。A·thaliana是唯一用T-DNA标签克隆基因较多的物种。T-DNA转化要建立组织培养和整株培养技术,然而针对拟南芥建立的大部分组织培养转化系统,并不是直接用于插入突变。结果,转化群体内除插入突变外,还有体细胞突变,这些突变体不能被T-DNA标签。尽管T-DNA插入诱变有这个缺点,并未限制用组织培养转化T-DNA来分离基因,今后将会有更多基因从组织培养建立的转化群体内分离[2]。目前,已分离的T-DNA标签基因大多利用整株转化系统[3]。种子浸染转化的5000个整株转化体与组织培养转化的1340株转化体的突变类型及表型频率比较,这两个群体的突变谱和变异频率极为相似,如植株大小变异、缺陷型胚乳和色素突变体。种子转化群体育性低的突变体比率(1·1%)比组织培养高(0·36%),由于存在体外变异的可能性,这个百分率比期望的百分率值要高。总的来说,这两个不同转化方式的突变频率和突变谱相类似。但整株转化T-DNA插入转录活性单位的频率相对组织培养转化要高,种子转化群体被标签的突变体比例(40%)比组织培养(10%)大[4]。 拟南芥基因组上T-DNAs饱和有利于分离拟南芥所有基因。已证实拟南芥基因组长大约为120000kb,每个转化体插入基因组中的T-DNA平均数目为1·5个[5]。70%的T-DNAs或T-DNA标签的突变体图谱表明,在基因组水平,T-DNA随机分布在拟南芥的5条染色体上[6]。在一个基因内,T-DNA的插入似乎也是随机的。在已鉴定的20多个T-DNA标签的突变体中,T-DNA的插入似乎也是随机的。在已鉴定的20多个T-DNA 标鉴的突变体中,T-DNA随机插入内含子、外显子及基因的3′端与5′端。通过对不同位点突变频率的检查,也没有发现T-DNA突变热点。20多个T-DNA标签克隆的拟南芥基因基因内含子数目平均6~7个,所有内含子与外显子的平均长为4·0Kb,这个长度不包括基因的5′区和3′区,该基因3′区或5′区如被T-DNA 插入,也导致表型不同。因此,理论上用T-DNA饱和诱变克隆所有拟南芥基因,将需要65—70000个转化体(90—100000插入片断)来分离基因,而且每一个基因有一个插入片断的概率为95%。分离T-DNA标签的植物基因技术有:(1)构造突变体基因组文库,用与T-DNA左边或右边同源的序列筛选[7],(2)质粒解救:利用E.coli中选择分子标记和T-DNA的复制起始位点分离T-DNA与植物基因的连合体[8],(3)利用左边或右边序列设计引物反向PCR(IPCR)[9],(4)使用巢式边界特异引物和随机简并引物的热非对称(tail)-PCR,Liu等使用了RB(右边)引物和3个巢式简并引物,在获得的190个转化体中,克隆了183个转化体的T-DNA侧翼植物DNA[6]。
拟南芥基因敲除技术及其在生物学研究中的 应用 随着人们对基因的研究深入，越来越多的基因工程技术也被发明和应用。其中，基因敲除技术是一种被广泛应用于研究中的基因工程技术。本文将着重介绍拟南芥基因敲除技术及其在生物学研究中的应用。 一、拟南芥基因敲除技术的原理 拟南芥是一种小型的模式植物，其基因组很小，拟南芥的基因组序列已经被完 全解析，因此拟南芥成为了许多基因工程实验室中重要的研究对象。基因敲除技术是通过建立一种催化剂，使其针对目标基因进行靶向破坏，进而实现基因的失活。在拟南芥中，基因敲除技术主要通过两种方法实现：T-DNA插入和CRISPR-Cas9 编辑。 T-DNA插入是一种利用土壤杆菌将外来基因转移到植物中的技术。在T-DNA 插入的过程中，外源DNA序列会随着T-DNA一同插入到目标基因中，进而导致 该基因的表达或结构的改变。对于T-DNA插入技术，其主要通过三个步骤实现： 选择适当的T-DNA载体，由Agrobacterium mediating将载体导入到拟南芥中，最 后通过筛选得到T-DNA插入后的植株。 CRISPR-Cas9技术是当前最热门的基因编辑技术之一。该技术通过利用Cas9 蛋白切割DNA，配合CRISPR的引导RNA实现靶向打靶。在拟南芥中，利用CRISPR-Cas9进行基因编辑的主要流程为：确定目标基因，设计和构建CRISPR-Cas9系统，完成转化、筛选和鉴定，在检测到特定基因的敲除效果后，观察所得 到的表型差异。利用CRISPR-Cas9进行基因编辑相对来说比较快捷和精确，它还 可以用于研究基因并预测基因功能等方面。 二、拟南芥基因敲除技术在生物学研究中的应用
项目编号 东北农业大学大学生科技创新基金 申请书 项目名称：拟南芥AtbZIP1转录因子基因At5g49540 的突变体鉴定 项目主持人：李松 所在学院：生命科学学院 研究起止时间：2008年11月1日至2009年11月1日 东北农业大学教务处制
项目名称 拟南芥AtbZIP1转录因子基因At5g49540 的突变体鉴定 研究起止时间2008.11~2009.11 申请金额1000元 项目主持人 姓名李松学号A09060068所在学院生命科学学院所学专业生物技术学生类别二年级年级班级生物技术 指导教师 （1） 姓名才华职称讲师 所在学院生命科学学院研究领域植物基因工程 指导教师 （2） 姓名纪巍职称助教 所在学院生命科学学院研究领域植物基因工程 项目组成员姓名刘维学号A0960072 专业班级生技062 姓名肖松学号A09060086 专业班级生技062 姓名王鹏姬学号A09060080 专业班级生技062 姓名卢清瑶学号A09060073 专业班级生技062
一、项研究的目的意义、国内外研究概况、主要创新之处 1．研究的目的意义 基因功能的主要研究方法包括：(1)克隆相关基因，进行异体超表达研究(Meyer 等2000，2004；Schulze等2003); (2)利用T-DNA插入突变技术，获得目的基因敲出突变体(Bouche 和Bouchez 2001；Parinov和Sundaresan 2000)，再通过筛选出的纯合突变体，研究目的基因的功能(Meyer等2004)。与前者相比，后者具有许多优势(Meyer 等2004)，已成为反向遗传学研究的主要手段(Bouche和Bouchez 2001；Parinov和Sundaresan 2000)。 bZIP类转录因子普遍存在于动植物及微生物中，是植物中一类很大的转录因子家族，在拟南芥中就有75个家族成员，在植物生长发育以及抗逆境胁迫的过程中起到重要的作用。本研究利用已购买的拟南芥AtbZIP1基因的突变体作为实验材料，利用“三引物法”在DNA水平上对突变体进行插入纯合鉴定；在此基础上，对插入纯合的突变体，提取其RNA并进行RT-PCR，在RNA水平上鉴定T-DNA插入是否抑制了AtbZIP1基因的表达，最终获得不表达AtbZIP1基因的拟南芥突变体。本研究可为利用突变体进行功能互补研究AtbZIP1基因的功能提供突变体材料，进而为研究AtbZIP1转录因子在植物生长发育以及抗逆境胁迫的过程中所起的作用奠定基础。 2．国内外研究概况 1)突变体鉴定的方法的研究现状 反向遗传学研究的首要条件是获得大量基因敲除突变体，建立一套快速、可靠的T-DNA插入突变体鉴定方法对其进行鉴定很重要。目前，鉴定方法主要有2种(https://www.doczj.com/doc/2c19384941.html,/tdnaprimers.html): “三引物法”和“双引物法”。 “三引物法”的原理如图1 所示，即采用三引物(LP、RP、LB)进行PCR 扩增。野生型植株(wild type, WT)目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA 插入，所以其PCR 产物仅有1 种，分子量即从LP到RP的大小; 纯合突变体植株(homozygous lines, HM)目的基因的两条染色体上均发生T-DNA 插入，而T-DNA 本身的长度约为17 kb，过长的模板会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP (或RP)为引物进行扩增的产物，分子量即从LP 或RP 到T-DNA 插入位点的片段的长度再加上从LB 到T-DNA载体左边界的片段的长度;杂合突变体植株(heterozygous lines, HZ)只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA 插入，所以PCR 扩增后可同时得到
拟南芥突变体的鉴定 摘要在真核细胞的细胞核中，基因组DNA缠绕在组蛋白上，形成核小体的结构。核心组蛋白的末端会发生一系列翻译后水平上的共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和ADP－核糖基化等。这些共价修饰在染色质的结构与功能及基因的转录调控方面起着重要的作用。组蛋白的甲基化发生在赖氨酸和精氨酸位点，这些位点的甲基化参与异染色质形成，X染色体失活和基因转录的激活与沉默等许多重要的生物学功能。早先认为组蛋白上的甲基化是不可逆的。然而近年来在哺乳动物和酵母中相继发现了许多组蛋白去甲基化酶。其中最大的一个基因家族是包含有JMJC结构域的组蛋白去甲基化酶家族。在植物中还没有报道有组蛋白去甲基化酶。我们通过基因组注释以及序列比对从拟南芥中鉴定出21个编码包含有JMJC结构域蛋白的基因。并从SALK突变体库中筛选鉴定了相应的T-DNA插入突变体。利用分子标记，我们筛选出了37个纯合T-DNA插入株系。给我们以后分析这些基因在植物生长发育中所起的作用打下了坚实的基础。 关键词组蛋白密码, 甲基化，去甲基化，T-DNA插入突变体 1 背景介绍 1.1 “组蛋白密码”理论与表观遗传学 在真核细胞的细胞核中，基因组DNA与组蛋白和非组蛋白相互结合，构成遗传信息的物质载体——染色质。染色质由其基本单位核小体重复连接而成，每个核小体包含一个组蛋白八聚体（H2A/H2B-H3/H4-H3/H4-H2A/H2B）和围绕其上的两圈超螺旋DNA（146KB），核小体之间通过不同长度的超螺旋DNA和H1组蛋白前后相接。组蛋白八聚体的成员作为核小体的基本组成元件，在所有真核生物中高度保守。尽管核心组蛋白均具有一个三螺旋的结构严整的组蛋白折叠区，其两个末端却没有形成固定结构。然而，这些末端却会发生一系列翻译后水平上的共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和ADP－核糖基化等。这些共价修饰在染色质的结构与功能及基因的转录调控方面起着重要的作用（1，2）。 针对在组蛋白中存在的广泛修饰作用，Allis及其同事在2000年提出“组蛋白密码”假
2022-2023学年山东省青岛市莱西市一中高三12月月考生物试题 1.研究发现，COP膜泡运输是内质网和高尔基体之间物质转运机制之一。内质网驻留蛋白 是指经核糖体合成、内质网折叠和组装后，留在内质网中的蛋白质。内质网驻留蛋白的羧基端有一段特殊的信号肽，若内质网驻留蛋白被意外包装进入COPⅡ转运膜泡，会从内质网逃逸到高尔基体，此时高尔基体顺面膜囊区的信号肽受体就会识别信号肽并与之结合，将整个蛋白质通过COPI转运膜泡送回内质网。下列叙述正确的是（） A．内质网和高尔基体在结构上通过COP转运膜泡建立联系 B．如果内质网驻留蛋白上缺乏信号肽，该蛋白质不可能被分泌到细胞外 C．信号肽与信号肽受体识别与结合的过程说明细胞间存在信息交流 D．内质网驻留蛋白的合成和转运需要高尔基体的加工 2.为探究细胞降解或修复细胞核中错误折叠蛋白的机制。研究者在细胞中表达了一个融合 蛋白L-G，该蛋白分布在细胞核中，其中L是受热胁迫易错误折叠的部分，G是能发出绿色荧光的热稳定的部分。观察其在不同条件下的分布情况，结果如图所示。下列说法错误的是（） A．融合蛋白在细胞质合成后通过核孔进入细胞核 B．正常温度和热胁迫条件融合蛋白均发绿色荧光 C．图中虚线所示位置为该细胞的细胞膜 D．核仁可能具有修复或降解错误折叠蛋白的功能 3. NO3-和NH4+是植物利用的主要无机氮源，NH4+的吸收由根细胞膜两侧的电位差驱动， NO3-的吸收由H+浓度梯度驱动，相关转运机制如图。铵肥施用过多时，细胞内NH4+的浓度增加和细胞外酸化等因素引起植物生长受到严重抑制的现象称为铵毒。下列说法正确的是（）
A．NH 4+通过AMTs进入细胞消耗的能量直接来自ATP B．NO 3-通过SLAH3转运到细胞外的方式属于被动运输 C．铵毒发生后，增加细胞外的NO 3-会加重铵毒 D．载体蛋白NRT1.1转运NO 3-和H +的速度与二者在膜外的浓度呈正相关 4.为研究在盐胁迫条件下，不同红光（R）与远红光（FR）比值（R：FR）的光环境对番茄 生长的影响，研究人员以番茄幼苗为材料，采用营养液水培方法，在盐胁迫 （100mmol·L-1NaCl）下设置不同红光与远红光处理，T1（R：FR=7.4）、T2（R： FR=1.2）、T3（R：FR=0.8），以正常营养液栽培（R：FR=7.4）为对照（CK），测得相关数据，结果如下表所示。下列有关叙述正确的是（） 不同光环境对盐胁迫下番茄幼苗生长的影响
遗传学实验报告 拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 一、实验目的： 1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能 2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。 二、实验原理 1、拟南芥（Arabidopsis thaliana） 十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。 ➢植株形态个体小，高度只有30cm左右； ➢生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右； ➢种子多，每株可产生数千粒种子； ➢形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养； ➢遗传转化简单，转化效率高； ➢基因组小，只有5对染色体，125MB； ➢在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。 2、突变体 突变体是遗传学研究的最重要材料。 突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。 拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。 由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。 3、T-DNA插入突变原理 T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA 区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。 除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。 4、T-DNA插入突变体PCR鉴定 图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计
姓名系年级学号日期 科目遗传学实验题目模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 摘要： 农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体。本次实验意在对模式植物拟南芥T-DNA插入突变体进行鉴定。实验中用到的主要实验方法有：CTAB法提取拟南芥基因组DNA、PCR扩增目的基因片段、琼脂糖凝胶电泳分离核酸。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。DNA经EB染色，EB可与核酸结合，在紫外光激发下产生荧光。现广泛应用于核酸的研究中。 引言 Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。
T-DNA插入基因内部导致基因突变：T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。这使农杆菌Ti 质粒转化系统的应用范围受到了一定的限制。 反向遗传学研究的首要条件是获得基因敲出突变体，建立可靠、有效、方便的T-DNA插入突变体的鉴定方法。其中，“三引物法”是主要鉴定方法之一。 “三引物法”即采用三个引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR扩增产物仅有1种，电泳结果为一条大带（由LP+RP这一对引物扩增出来）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，也只能得到1种PCR扩增产物，电泳结果为一条小带（由BP+RP这一对引物扩增出来）；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增产物有2种，电泳结果为一条大带由（LP+RP这一对引物扩增出来）和一条小带（由BP+RP 这一对引物扩增出来）。电泳结果差异明显，能有效区插入突变体的类型。 此法优点是可同时鉴定出纯合突变体并确证T-DNA的插入情况。本方法操作简单，成功率高，结果可靠，适用于从大量拟南芥T—DNA插入突变体中快
石家庄市2022届高中毕业班教学质量检测（一）试题 生物 （时间75分钟，满分100分） 注意事项： 1.答卷前，考生务必将自己的姓名、考生号、考场号、座位号等填写在答题卡上。 2.回答选择题时，选出每小题答案后，用2B铅笔把答题卡上对应题目的答案标号涂黑。 如需要改动，用橡皮擦干净后，再选涂其他答案标号。回答非选择题时，将答案写在答题卡上。写在本试卷上无效。 3.考试结束后，将本试卷和答题卡一并交回。 一、单项选择题：本题共13小题，每小题2分，共26分。在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。 1.下列关于生物体中化合物的叙述，正确的是 A.纤维素由葡萄糖聚合而成，是植物细胞的能源物质 B.胆固醇参与构成动物细胞膜并参与血液中脂质运输 C.蛋白质是生物体内重要的储能物质 D.细胞中的无机盐主要以化合物的形式存在 2.一片沼泽地中含有多种微生物，下列有关叙述正确的是 A.蓝藻能进行光合作用，属于自养生物 B.酵母菌有细胞壁和拟核，属于单细胞原核生物 C.病毒的遗传物质是RNA,在活细胞内增殖 D.硝化细菌含染色质，是该生态系统的消费者 3.保卫细胞吸水膨胀使植物气孔张开。适宜条件下，制作紫鸭跖草叶片下表皮临时装片，观察蔗糖溶液对气孔开闭的影响，有关操作及观察结果如图所示。下列叙述错误的是 A.保卫细胞的吸水能力A>B B.质壁分离现象最可能出现在A的观察视野中 C.保卫细胞的细胞液浓度B>A D.推测两种蔗糖溶液浓度高低为甲＞乙 4.研究人员从菠菜中分离类囊体，将其与16种酶等物质一起用单层脂质分子包裹成油包水液滴，从而构建半人工光合作用反应体系。该反应体系在光照条件下可实现连续的CO2固定与还原，并不断产生有机物乙醇酸。下列分析正确的是 A.该反应体系中“CO2→乙醇酸”过程相当于叶绿体中的暗反应 B.该反应体系可将光能直接转化为乙醇酸中稳定的化学能 C.类囊体产生的［H]参与CO2固定与还原 D.该反应体系的光反应与叶肉细胞中光反应的场所不同 5.下列有关实验的叙述，正确的是 A.噬菌体侵染细菌实验中，T2噬菌体的DNA进入肺炎双球菌中而把蛋白质留在外面 B.蛋白质经高温变性后不能与双缩脲试剂发生作用，产生紫色反应 C.孟德尔的一对相对性状杂交实验证明了遗传因子位于染色体上 D.酵母菌无氧呼吸的产物可在酸性条件下与重铬酸钾反应，呈现灰绿色
2023-2024学年黑龙江省大庆市四中生物高三第一学期期末统考模拟试题 注意事项 1．考生要认真填写考场号和座位序号。 2．试题所有答案必须填涂或书写在答题卡上，在试卷上作答无效。第一部分必须用2B 铅笔作答；第二部分必须用黑色字迹的签字笔作答。 3．考试结束后，考生须将试卷和答题卡放在桌面上，待监考员收回。 一、选择题(本大题共7小题,每小题6分,共42分。) 1．下列与高中生物学实验相关的叙述中，不正确的是（） A．探究温度对酶活性影响的实验，可选用新鲜的肝脏研磨液 B．鉴定DNA时，将溶解的粗提产物与二苯胺混合后进行沸水浴 C．可以采用构建物理模型的方法研究DNA分子的结构特点 D．观察质壁分离时，用一定浓度的蔗糖溶液处理黑藻的叶片 2．已知某病为伴X染色体显性遗传病，下列有关说法正确的是（） A．患者中女性多于男性，所以女性人群中致病基因的频率大于男性人群 B．若男性群体中患者的比例为3％，则女性群体中纯合子患者的比例为1．19％ C．女性患者的致病基因既可来自祖父，也可来自外祖父 D．男性患者的致病基因既可来自祖母，也可来自外祖母 3．在“制作并观察植物细胞有丝分裂的临时装片”活动中，观察到不同分裂时期的细胞如图所示： 下列叙述错误的是 A．装片制作过程中需用清水漂洗已解离的根尖便于染色 B．观察过程中先用低倍镜找到分生区细胞再换用高倍镜 C．图甲细胞所处时期发生DNA复制及相关蛋白质的合成 D．图丙细胞中的染色体数目比图乙细胞中的增加了一倍 4．鸟类的性别决定为ZW型。已知某种鸟类的眼色受两对独立遗传的基因（A、a和B、b）控制。现有甲、乙两个纯合品种，均为红色眼，根据下列杂交结果，推测杂交1的亲本基因型是（）
拟南芥SGR2基因参与叶绿素降解和衰老过程 李倩昀;许守明;马俊雅 【摘要】[Objective]To study Arabidopsis thaliana SGR2 genes involved in degradation and senescence of chlorophyll.[Method]T-DNA inser-tion mutants for SGR2 gene were got.The experiments of chlorophyll fluorescence analysis,determination of the content of chlorophyll and soluble sugar,qRT-PCR test and some other bioinformatics analysis were conducted.[Result]The chlorophyll content of the mutant leaves was less than the case in the wild-type.The soluble sugar content of the mutant leaves was more than the case in the wild-type.Expression of RBCS and CAB were down regulated.While,a transparently prolonged flowering period was observed in mutant,as compared with colo-0.[Conclusion]The results demonstrate that SGR2 gene is involved degradation and senescence of chlorophyll in A.thaliana.%[目的]研究拟南芥SGR2基因参与叶绿素降解和衰老过程.[方法]购得SGR2(stay green rice,水稻滞绿基因)基因的T-DNA插入突变体,并进行叶绿素荧光分析、叶绿素含量和可溶性总糖测定、qRT-PCR等试验以及生物信息学分析.[结果]突变体叶绿素a含量较WT(colo-0野生型)降低;可溶性糖含量高于WT;RBCS(Rubisco,核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的小亚基)和 CAB(Chl a binding protein,叶绿素a结合蛋白)基因表达下调.而突变体开花明显比野生型延迟.[结论]证明了SGR2基因参与了拟南芥叶绿素降解和衰老过程.【期刊名称】《安徽农业科学》 【年(卷),期】2018(046)008
拟南芥F-box基因At5g22700的功能初步分析 王利群;唐冬英;李新梅;段桂芳;吴丹;赵小英;刘选明 【摘要】F-box蛋白作为SCF(Skp1,Cullin and an F-box protein)复合体的成员,参与调节植物的生长发育过程.At5g22700为功能未知的F-box基因家族成员.本研究通过酵母双杂交分析At5g22700蛋白与ASK(Arabidopsis-SKP1-like)家族蛋白的相互作用,发现At5g22700蛋白的F-box结构域与ASK4蛋白相互作用.实时定量PCR分析该基因在不同组织器官中的表达,发现该基因在根和花中的表达量最高,说明At5g22700可能在根和花的发育中具有重要作用.以At5g22700基因的T-DNA插入突变体和过量表达转基因株系为材料,分析不同光照条件下幼苗的表型,发现蓝光下At5g22700过量表达转基因幼苗的主根比野生型长.这些研究结果表明,At5g22700在植物体内可能形成SCF复合体,并在植物幼苗主根伸长生长中起促进作用. 【期刊名称】《激光生物学报》 【年(卷),期】2014(023)002 【总页数】7页(P140-146) 【关键词】拟南芥;F-box基因;At5g22700;主根伸长 【作者】王利群;唐冬英;李新梅;段桂芳;吴丹;赵小英;刘选明 【作者单位】湖南大学生物学院植物基因组学与发育调控湖南省重点实验室,湖南长沙410082;湖南大学生物学院植物基因组学与发育调控湖南省重点实验室,湖南长沙410082;湖南大学生物学院植物基因组学与发育调控湖南省重点实验室,湖南长沙410082;湖南大学生物学院植物基因组学与发育调控湖南省重点实验室,湖南