β-巯基乙醇诱导大鼠骨髓基质细胞神经细胞蛋白的表达

诱导剂对工程菌表达重组目的蛋白的影响_百替生物诱导剂对工程菌表达重组目的蛋白的影响摘要：观察诱导剂对工程菌发酵及重组目的蛋白表达的影响，从而选取最佳诱导表达条件。

本文主要阐述了几种诱导剂对工程菌发酵菌体密度以及重组目的蛋白表达量的影响，分析了不同诱导剂诱导表达重组蛋白的特点及存在的问题。

同时着重介绍了阿拉伯糖做为诱导剂对重组目的蛋白表达量的影响，研究得到工程菌发酵的最优条件，为阿拉伯糖作为诱导剂最终应用于重组基因工程药物的工业化生产提供了有益的参考和借鉴。

关键词：IPTG;乳糖；阿拉伯糖；诱导；发酵近年来，重组大肠杆菌的高密度发酵是现代基因工程产品大规模生产的重要技术。

采用高密度发酵技术，提高菌体的发酵技术，提高菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率，不仅可以减少培养体积、优化下游分离提取，还可以缩短生产周期、降低生产成本，从而极大地提高在市场上的竞争力。

然而在研究高效发酵过程中，人们往往会遇到表达效率难以得到最大限度的提高与产率较低等问题。

在众多影响因素中，诱导剂对于外源基因高效、稳定的表达起着非常重要的作用。

由于Lac启动子是使用最早、研究最详细的启动子之一，所以目前用于诱导重组蛋白表达的诱导剂主要是IPTG和乳糖，而对阿拉伯糖诱导重组蛋白表达的研究尚少。

但有文献报道,Lac启动子的控制很不严密,在无诱导剂IPTG 的情况下可有较高的表达。

而阿拉伯糖(Ara)启动子是一个控制较严密且具较高表达水平的启动子将得到普遍应用。

1、操纵子类型及调控类型原核生物基因表达调控主要发生在转录水平上，转录调控的基本单元是操纵子。

1.1操纵子的概念根据操纵子学说，很多功能上相关的结构基因在染色体上串连排列，由一个共同的控制区来操纵这些基因的转录。

包含这些结构基因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子。

1.2乳糖操纵子——可诱导负调控乳糖操纵子的结构：由启动子（P）、操纵基因（O）、调节基因、结构基因所组成。

操纵基因I编码一个可扩散的分子,引起基因的阻遏。

EPO促进大鼠脊髓损伤后内源性神经干细胞增殖的实验研究的开题报告一、研究背景与意义：脊髓损伤是一种严重的神经系统损伤，目前仍没有有效的治疗方法。

内源性神经干细胞（NSCs）在成年动物脊髓中存在，能够分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等成分，具有重要的再生潜能。

因此，寻找能够促进NSCs增殖与分化的治疗方法，对于脊髓损伤的治疗尤为重要。

EPO（人类促红细胞生成素）是一种内源性角蛋白质，已被证明能促进神经细胞的增殖和分化，减轻脊髓损伤的后果。

然而，EPO是否可以促进大鼠脊髓损伤后NSCs的增殖，尚未得到完全证实。

因此，本研究旨在探究EPO是否能够促进大鼠脊髓损伤后NSCs的增殖与分化。

二、研究方法：1.建立脊髓损伤的大鼠模型选取SD大鼠，采用影响法建立脊髓损伤模型。

2.NSCs的分离和培养通过玻璃棒摇匀轻抚方法，从大鼠脊髓中分离出NSCs，并进行原代培养。

采用胶质细胞培养基添加EGF和FGF2等方法，进行NSCs的进一步培养。

3.实验分组将实验大鼠随机分为对照组和EPO处理组，每组n=8。

4.给药方法对照组注射生理盐水，EPO处理组注射EPO，剂量为1000U/kg一日，连续注射7天。

5.检测指标采用光镜和电镜分别观察大鼠脊髓和NSCs的形态结构。

同时，采用免疫荧光方法检测Nestin蛋白、β-tubulin-III和GFAP的表达水平。

使用Western blot方法检测PCNA和Ki-67的表达水平。

三、研究意义通过本研究，可以探究EPO在大鼠脊髓损伤后人NSCs的增殖与分化方面的潜在作用。

该研究结果有望为脊髓损伤的治疗方法提供新的思路和策略。

4×蛋白上样缓冲液（含β-巯基乙醇）使用说明货号：P1016规格：10ml保存：2-8℃保存，自发货之日起至少3个月有效。

产品简介：本产品适用于SDS-PAGE(SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)时作蛋白质上样用。

其主要成份为SDS，β-巯基乙醇，溴酚蓝，缓冲盐溶液等。

SDS可与蛋白质结合使蛋白质－SDS复合物上带有大量的负电荷，这时蛋白质本身的电荷完全被SDS掩盖，消除了各种蛋白质本身电荷的差异，SDS 还可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构，消除了蛋白结构之间的差异。

最终无电荷及结构上差异的蛋白（亚单位），电泳速度只是与其分子量大小有关。

溴酚蓝用作电泳时的指示剂，可大概指示电泳结束的时间。

使用说明：1.请按每30微升蛋白样品加入10微升上样缓冲液的比例（4倍稀释）来使用。

如果蛋白浓度过高，可用双蒸水稀释。

2.混匀后，100℃水浴加热3-5分钟，使蛋白变性。

3.冷却到室温后，10000-14000rpm离心2-5分钟，取上清直接上样电泳即可。

注意事项：1.聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%时溴酚蓝指示条带的位置大概在30kd 左右，胶浓度12%时，约在20kd左右，胶浓度15%时，大概在10kd。

请根据自己目标条带来判断结果电泳时间。

2.本试剂因含β-巯基乙醇，有一定的毒性，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

相关试剂：P10154×蛋白上样缓冲液（含DTT）P10174×非变性蛋白上样缓冲液A101030%丙烯酰胺(29:1)A103010%过硫酸氨P001210×丽春红染色液P1300-500考马斯亮蓝快速染色液P1300SDS-PAGE凝胶制备试剂盒PR1700预染次高分子量蛋白MARKER。

不同浓度BME对大鼠胚胎脊髓神经干细胞增殖和分化的影响【摘要】目的：观察含10 ml/L血清的不同浓度的β一巯基乙醇(BME)对大鼠胚胎脊髓神经干细胞增殖和分化的影响. 方法：从大鼠胚胎脊髓中分离神经干细胞，经过2~3次传代培养后，采用含10 ml/L血清的不同浓度的BME分组对细胞进行体外诱导，选择3个时段观察细胞形态变化情况，诱导24 h后采用GFAP和NSE免疫荧光染色法鉴定分化结果，同时对分化结果进行统计学分析. 结果：用BME( mmol/L)组和对照组血清诱导的神经元的百分率分别为49%和10%，而BME(1 mmol/L)组的神经元分化率显着升高至58%. 由BME( mmol/L)组、BME(1 mmol/L)组和对照组血清诱导的星形胶质细胞分化率分别为46%，35%和83%. 结论： BME 有明显诱导神经干细胞向成熟神经元分化的作用. 配合血清使用可使细胞向神经原分化的趋势明显优于单纯使用血清，两者协同效应明显.【关键词】β一巯基乙醇(BME)；神经干细胞；细胞分化0引言β巯基乙醇(βmereaptoethanol, BME)又名2巯基乙醇，是具有硫醇臭味的无色或微黄色透明液体，作为一种化学原料药具有抗氧化作用. Woodbury等［1］证实它在诱导骨髓基质干细胞(marrow stromal cells, MSCs)向神经元方向分化的过程中起到关键作用,陈霞平等［2］对BME诱导MSCs作用也有相关报道. MSCs在被诱导分化为成熟神经细胞的过程中必定经过神经干细胞阶段. 因此，本研究将成功诱导MSCs的BME配合血清作用于神经干细胞，以观察其对神经干细胞增殖过程及分化结果的影响.1材料和方法1．1材料受孕SD大鼠(E10E12)由第四军医大学实验动物中心提供；DMEM/F12, N2添加剂均购自Gibco公司；EGF, bFGF购自Sigma公司，兔抗鼠NSE,GFAP,NESTIN一抗以及羊抗兔FITC, CY3荧光二抗均购自博士德公司；BME，多聚赖氨酸，胰蛋白酶均购自Sigma 公司. 倒置相差光学显微镜OLYMPUS IX70型.1．2方法1．2．1NSC原代培养依照Weiss的实验模型［3,4］，将孕大鼠(E10~E12)脱颈处死后，750 ml/L乙醇浸泡消毒10 min，在无菌条件下打开腹腔，取出胚胎，解剖显微镜下分离胎鼠脊髓，在4℃ DHanks液内用解剖剪将脊髓减碎成l mm×l mm×1 mm，用火焰抛光的吸管将剪碎的组织小块机械吹打成单细胞悬液，800 r/min离心5 min后弃沉渣，血细胞计数板细胞计数，以条件培养基(DMEM/F12为基本培养基，N2添加剂以1∶100稀释，EGF, bFGF［5,6］终浓度为20 μg/L. 调整细胞密度约为9×105个/L 后接种于培养瓶内，置于37℃, 50 ml/L CO2孵箱中培养. 每隔2~3 d更换新鲜培养液，5~6 d传代.1．2．2实验分组将盖玻片放入24孔板，并用多聚赖氨酸包备37℃过夜，使用前用PBS冲洗干净. 将传至第3代的神经干细胞克隆球用滴管吹打成单细胞悬液，仅使用基本培养基而不加入EGF，bFGF和N2，并稀释至×106个/L，接种到24孔板，每孔l mL细胞悬液. 每6孔为一组，共分三个试验组(A~C组)和一个对照组(D组). A~C组分别使BME终浓度达到, 1和2 mmol/L,并分别加入l/100体积浓度的胎牛血清，而D组仅加入1/100体积浓度的胎牛血清.1．2．3免疫细胞化学检测各组细胞于诱导24 h后吸干液体，40 g/L多聚甲醛(10 mmol/L PBS配置)室温固定30 min, 10 mmol/L PBS冲洗3 min×3次. 滴加山羊血清封闭，20 min后吸去余液. 加入一抗NSE(1∶250)和GFAP(1∶250)分别标记分化后的神经原和星形胶质细胞. 放于4℃过夜. 复温PBS冲洗后加入荧光二抗，2 h后甘油封片观察.统计学处理：在每张盖玻片上随机取10个视野观察，分别对每视野中NSE及GFAP染色细胞和所有细胞计数. 采用进行ChiSquare检验，认为差异有统计学意义.2结果2．1NSCs的原代培养相差显微镜观察，原代后的1~2 d里由于培养基的高度选择性和机械吹打损伤使得部分细胞死亡，绝对数量明显减少. 培养3 d后细胞快速生长，逐渐形成由数十个至数百个细胞组成体积大小不等的克隆球(neurosphere)悬浮生长(Fig 1A)，表面凹凸不平，折光性强. 随着培养时间的延长，这些克隆球不断增大，其中有个别神经干细胞生长速度明显快于其余细胞，由这个别细胞形成的新的克隆球会出现在母球表面并逐渐脱离旧的克隆球(Fig 1B). 此时如果停止传代，这些体积较大的克隆球生长减缓，折光性减弱.2．2BME对神经干细胞增殖的作用将BME 加入24孔板后，我们选择4, 12和24 h三个时间点借助倒置相差光学显微镜观察神经干细胞形态变化情况. 发现D组纯血清诱导神经干细胞大约在2 h左右即有个别细胞发生形变，4 h时明显增多. A组与对照组纯血清组几无差别，B组神经干细胞同样发生梭型变，个别细胞形似水滴状，推测是分化方向为神经元的过渡细胞(Fig 2)，但也有小部分细胞维持原状或逐渐黯淡，死亡. C 组细胞分化很少，大量神经干细胞死亡.2．3BME对神经干细胞的分化作用在纯血清对照组中，NSE和GFAP阳性的比例分别为10%和83%；A组中NSE和GFAP阳性的比例分别为49%和46%；B组中NSE和GFAP阳性的比例分别为58%和35%(Fig 3,4): C组因为大量细胞已经死亡，故未做免疫荧光染色.2．4对得到数据进行统计学分析将每组6孔每孔10个随机视野共60个NSE染色细胞数据分别记录，统计结果各组之间差异明显.3讨论以往文献中报道大鼠脊髓神经干细胞培养大都选取胎龄在13~14 d胎鼠为实验材料，但在实际操作中发现孕13~14 d胎鼠脊髓系统已初步发育成形，血管膜紧缚在上，结缔组织出现，不但增加取材难度，且使用胰蛋白酶消化时势必增加消化时间，加大对神经干细胞的损伤［7］. 在分离过程中因为出血明显，原代的培养基中势必会留有少量血清，很容易使原代大量神经干细胞分化贴壁，这对以后实验的客观性分析及试验进程都产生影响. 而孕10~12 d胎鼠脊髓尚未完全成型，还处在中空的神经管阶段. 神经干细胞含量高，活性好，较易分离. 且无需胰蛋白酶消化，小心机械吹打即可形成单细胞悬液，在本实验过程中观察发现原代极少分化.DMEM F12作为改良型的培养液，与原MEM培养液相比较营养成分加倍，对细胞的分裂增殖十分有利［8］，而且Ham F12所含微量元素非常适于无血清情况下的细胞培养. 目前进行神经组织的培养，一般以DMEM 与F12的1∶1混合培养基为基础培养基. 但现在商品化常见高糖型DMEM培养基含糖量仅为 g/L,难以满足以糖代谢为主要能源的神经细胞. 我们的实验将DMEM F12基本培养基中的葡萄糖含量添加至6 g/L，与普通高糖DMEM(糖 g/L)相比，细胞生长活力明显增强，克隆球形成更早，形态更规则，原代之后死亡细胞数明显减少.目前已知的大量神经干细胞体外诱导实验中，化学物质以其独特的优势在其中占有相当比例. 与各种生物自身因子诱导最少几日才可见效果相比，化学诱导剂往往在加入数小时内细胞就发生形变，部分诱导剂24 h左右即可完成整个诱导过程，而且结果确切高效. 以最常见的化学诱导剂RA为例,在已知文献报道中，诱导神经干细胞最终分化为神经元的比例可高达90%左右［9］. 但化学诱导剂的细胞毒性较大，长时间使用对细胞损伤较大严重制约了其在临床治疗上的应用. 在我们的试验中曾尝试将诱导剂BME以试验组相同浓度在无血清情况下加入细胞培养液中. 在随后观察中发现4 h左右就有个别细胞发生形变，但随后细胞整体状态明显下降，24 h死亡细胞过半. 在配合血清使用后仍可以发现细胞死亡程度随诱导剂浓度增加而增加. 试验组细胞在成功诱导后如不及时换掉含诱导剂培养基，换成普通培养基，细胞仍有死亡. 所以要利用化学成分对干细胞进行诱导并最终应用于临床治疗首先必须解决细胞毒性从始至终对细胞的伤害. 我们认为BME和血清的联合使用有明显诱导神经干细胞向成熟神经元分化的作用，其结果明显优于单纯使用血清. 不但降低了单一使用化学成分的严重毒性，而且血清也不仅仅依靠本身的诱导作用，其含有的丰富的营养物质和生长因子对BME的诱导具有协同作用，也是一种辅助作用.【参考文献】［1］ Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons ［J］. J Neurosci Res,2000;61(4):364.［2］陈霞平，阮绪芝，张群林，等. NGF 和BME对小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的作用［J］.中国现代医学杂志，2004；14：20-23.Chen XP, Ruan XZ, Zhang QL, et al. Effects of NGF and BME on differentiation of mMSCs into neuronlike cells ［J］. Chin J Mod Med,2004；14：20-23.［3］ Reynolds BA, Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cell of adult mammalian central nervous system ［J］. Science, 1992;225:1707-1710.［4］章翔. 加强神经干细胞的基础与应用研究［J］. 第四军医大学学报，2003；24：2017-2020.Zhang X. Improvement on study of application and base of neural stem cell ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003；24：2017-2020.［5］ Gfitti A, Parati EA, Cova L, et al. Multipotential stem cells from adult mouse brain proliferate and selfrenew in response to basic fibroblast growth factor ［J］. J Neurosci, 1996；16(3)：1091-1100.［6］ Ciccolini F, Svendsen CN. Fibroblast growth factor 2(FGF2) promotes acquisition of epidermalgrowth factor(EGF) responsiveness in mouse striatal precursor cell: Identifieation of neural precursors responding to both EGF and FGF2 ［J］. J Neurosci, 1998；18：7869-7880.［7］章翔，林绿标，姬西团，等. 外源性一氧化氮对小鼠神经干细胞增殖的抑制作用［J］. 第四军医大学学报，2004；25：297-300.Zhang X, Lin LB, Ji XT, et al. Ectogenic nitric oxide inhibits proliferation of neural stem cells in mice ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2004；25：297-300.［8］姚柏春，黄翔. 胚胎小鼠纹状体神经干细胞的体外培养和分化［J］. 解剖与临床，2004;9:238-240.Yao BC, Huang X. Cultivation and differentiation of embryonic striatumneural stem cells in vitro ［J］. Anatomy Clinic, 2004；9：238-240.［9］崔景彬，鄢文海，王建枝，等. 维甲酸和EGF对大鼠脑胚胎神经干细胞增殖和分化的影响［J］. 中国组织化学与细胞化学杂志，2003；12：81-85.。

骨代谢的分子调控研究进展陈哂媛【摘要】骨形成与骨吸收之间的动态平衡受多种因素的调节,骨保护蛋白(OPG)、核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)和核因子-κB受体活化因子(RANK)是其关键的调节因子.下面就OPG/RANKL/RANK信号通路、转化生长因子-β、单酰基甘油酰基转移酶-2、骨活化蛋白和交感神经系统在骨代谢调控中的作用作一综述.【期刊名称】《国际口腔医学杂志》【年(卷),期】2010(037)005【总页数】4页(P544-547)【关键词】骨保护蛋白;核因子-κB受体活化因子配体;核因子-κB受体活化因子;转化生长因子【作者】陈哂媛【作者单位】四川大学华西口腔医院修复科,四川,成都,610041【正文语种】中文【中图分类】Q256成骨细胞（osteoblast，OB）和破骨细胞（osteoclast，OC）在正常的骨组织代谢中功能相反，但却保持着骨形成与骨吸收之间的动态平衡。

当两者出现分化或功能异常时，其动态平衡被破坏，骨代谢出现异常，全身则以骨质疏松症、骨质硬化症等形式表现出来。

研究显示，骨保护蛋白（osteoprotegerin，OPG）、核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）和核因子-κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）等细胞因子在骨代谢的调控中发挥着重要的作用。

1 OPG/RANKL/RANK信号通路OPG、RANKL和RANK为肿瘤坏死因子配体和受体家族成员，是一组调控OC发生的细胞因子。

OPG和RANKL竞争性地表达于OC及其前体上的RANK，两者的平衡调控着骨的形成和吸收，RANKL则使增殖的OC前体转化为OC[1]。

RANK与RANKL结合后启动OC分化的信号传导通路。

其中之一是核因子（nuclear factorNF）-κB途径[2]：RANK与RANKL结合后，启动一系列激酶的酶链反应，激活NF-κB复合体、转录因子和活化蛋白-1。