RNA提取心得

TRIZOL提取RNA步骤（革兰式阳性细菌和阴性菌通用）一.细胞前处理1.取菌液100ul（原则上每107个细胞加入1ML TRIZOL，不能超过108细胞），8000g，4℃，离心2 min，去掉上清液体。

（仔细将上清液吸取干净，不要触及EP管底部的细菌。

）2.加入250 ul，20mg/ml 的lysozyme（使用无Rnase free 的TE溶解）吹打混匀，放入37℃的水浴锅或者培养箱中孵育10 Min。

二.总RNA提取3.将孵育完毕的裂解液加入1 ML trizol 裂解液吹打混匀，再使用振荡器震荡3-5次（每次1-2 S）,放置在常温下6-10 min。

（此步一定要室温静置，静置完毕后可以直接放入-80℃冰箱保存）4.往已经备好的裂解液中加入氯仿（Rnaiso plus 1/5的体积量，一般200 ul左右，最多300ul）盖紧离心管盖，剧烈震荡，直到将混合液乳化成乳白色状态。

5.室温静置5 Min。

6.12000g，4℃离心，15 Min，从离心机中小心取出离心管（尽量不要触及管子和盖子的交界处，以免引起污染），此时匀浆液分为3层，上层是无色上清液（含RNA），中层是蛋白层（含有大部分DNA以及蛋白），下层是红色的有机相。

7.将上层无色液体转移至一管新的离心管中（上层液体吸取时尽量使用200 ul的枪头，尽量不要吸取到中间蛋白层，一般取600 ul足矣，不要贪多。

）8.向吸取的上清液中加入0.5-1倍体积的Rnaiso plus 体积的异丙醇（最多750 ul，并且异丙醇要置入-20℃冰箱中提前预冷），上下颠倒混匀后，4 ℃静置10 min。

9.12000 g，4 ℃离心10 Min。

10.小心去掉上清液（先倾倒出液体，再使用200 ul的枪头将剩余的异丙醇吸掉，在吸取异丙醇的时候一定不要触及底部的RNA沉淀，宁可剩余一点异丙醇在EP管内，一般10-20 ul异丙醇是可以接受的），加入75%的乙醇约1.5 ml，（乙醇一定要在-20℃预冷，使用DEPC处理水配制），尽量吹打3-5次，然后再振荡器再使用振荡器震荡3-5次（每次1-2 S，动作不能太剧烈，再轻弹管壁使得RNA悬浮起来。

一、总的RNA的提取基础知识：(1)DEPC：中文名为焦碳酸二乙酯。

分子式为C6H10O5，分子量为162.14。

是一种强烈的RNA酶抑制剂。

它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

DEPC水一般是指千分之一浓度的DEPC,在搅拌器上搅拌至完全溶解，即看不到“油珠”为止，DEPC气味芳香浓烈，强挥发性，有毒，需在通风橱中操作。

(2)RNA分子：哺乳动物细胞有3种rRNA：28S、18S和5S。

一个典型的哺乳动物细胞含有10-5μg RNA，其中80～85％为rRNA，其余15～20％主要由各种类型的低分子量RNA组成(tRNA、核内小分子RNA等)，这些高丰度的RNA分子具有确定的大小和核苷酸序列、并能用电泳、密度梯度离心、阴离子交换或高效液相层析等技术分离纯化。

mRNA与上述RNA不同，其含量为细胞总RNA的1～5％，大小和核苷酸序列各不相同，从数百至数千碱基不等。

..多数真核细胞mRNA在其3端均有一poly(A）尾，使得mRNA可以通过挂有oligo(dT)-纤维素的亲和层析柱分离纯化，获得的异源性分子集群的总体，可编码细胞内所有的多肽。

RNA酶变性剂RNA酶：水解RNA。

•含有链内二硫键，使其能抵抗长时间的煮沸和温和变性剂。

另外，变性后可迅速折叠，目前，尚无RNA酶失活的简易办法。

•该酶不需要二价阳离子激活，难以被金属离子鳌和剂（EDTA）失活。

——只好避免污染！用强烈变性剂，如盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来。

..RNA酶可耐受多种处理(例如煮沸)而不失活，但却会被4 mo1/L硫氰酸胍和β-疏基乙醇等还原剂所灭活。

因此可联用上述试剂，从组织中提取完整无损的RNA实验准备工作：器具和试剂的消毒..（1）尽可能使用无菌、一次性塑料制品，已标明RNase-Free且未开封过的塑料制品，不必再进行其他处理，对于国产塑料制品，应按下列方法进行处理：在一玻璃烧杯中注入含终浓度为0.1%DEPC的去离子水，将要处理的塑料制品浸泡其中12小时以上，弃DEPC水溶液，适温烘烤干燥已处理过的塑料制品，再经103.4kPa，121℃高压灭菌15分钟，70-80℃烘烤干燥即可使用..（2）所用的玻璃器皿，置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。

为什么你抽提不好RNA？RNA 抽提比基因组 DNA 抽提要困难得多。

事实上，现有的 RNA 抽提方法/试剂，如果用于从培养细胞中抽提RNA，比抽提基因组DNA 更方便，成功率也更高。

那为什么同样的方法用于组织RNA 的抽提，总会碰到问题呢？RNase 真的很顽固吗？刚涉及 RNA 抽提的新手都会听到别人说 RNase 很顽固，用高压灭菌都无法去除其活性。

于是在配制Tris 缓冲液时就遇到了两难的境地。

Tris 缓冲液不能用 DEPC 处理，只能用 DEPC 处理过的水配制，那么在药品称量、调 pH 值等过程中 Tris 缓冲液会造到 RNase 的再次污染，所以是一个两难的境地。

但是今天我要谈的是 RNase 并不顽固，高压灭菌可以去除其大量活性。

下面的实验照片很清楚的显示了高压灭菌的效果。

实验很简单，将不同含量的RNase 用高压灭菌处理，然后与未高压灭菌处理的RNase 一起来降解 RNA（37 度 1 小时），结果表明，当 RNase 的污染量小于 100 ng/ml 时，高压灭菌可以去除其活性。

这张照片还说明了一个问题，当你的RNA 溶液中含有很微量的RNase 污染时，不用过于担心，因为 RNase 对 RNA 的降解是需要时间的，更何况你的 RNA 是存放在低温下的。

DEPC 操作误区误区一：重复使用含 DEPC 的水处理枪头、离心管等。

由于 DEPC 较贵，而且书上说 DEPC 要用高压灭菌处理去除，于是有些人就萌发了重复使用 DEPC 的想法，即对含有 DEPC 的水不进行高压灭菌，从而重复使用含 DEPC 的水处理枪头、离心管等。

节约本是好事，但这样的节约是无效的。

为什么不能重复使用含DEPC 的水？因为 DEPC 在水溶液中不稳定，极易分解，DEPC 在 pH 6.0 和 pH 7.0 的 PBS 缓冲液中的半衰期分别约为 20 min 和 10 min，DEPC 在水中的半衰期约为 30 min。

植物总rna的提取实验报告(共4篇)实验一：植物总RNA的提取摘要：本实验采用常见的RNA提取方法，结合了Trizol试剂和琼脂糖柱纯化法，成功地获得了木瓜叶片、玫瑰花瓣、菜花花瓣和绿萝叶片的总RNA。

通过比较各样品的RNA浓度和纯度，得出提取的总RNA具有较好的质量和量，适合后续实验应用。

关键词：植物总RNA提取；Trizol试剂；琼脂糖柱纯化法；RNA浓度和纯度测定。

引言：RNA是生物体内最为丰富的生物大分子之一，植物细胞内涵盖了大量的RNA。

然而，总RNA是包括所有RNA种类的总和，因此其含量比其他类型的RNA更为丰富。

提取植物总RNA 是分子生物学和遗传学中的一项基本技术，在众多的实验过程中都需要应用。

各种提取方法都存在优缺点，根据实验需要选择不同的方法。

实验目的：实验材料：1.四种植物组织：木瓜叶片、玫瑰花瓣、菜花花瓣和绿萝叶片；2.Trizol试剂；3.乙醇和0.1M氯化钠；4.琼脂糖柱纯化试剂盒；5.常规实验室用品。

实验方法：1.测定植物组织的重量，并用液氮研磨器将其研磨成粉末状；2.加入10ml Trizol试剂，1ml的粉末，颠倒瓶子多次，使其彻底混合。

放置室温下5min，加入1ml氯仿混合，轻轻地混合进行离心分离。

将上层的非水相转移到新的离心管中，并加入1ml的高度纯化乙醇；3.离心15s，将上清转移到新的离心管中。

加入0.5ml的75%热硫酸β-丙酮，颠动瓶子，将混合物混匀，放置于室温下5min，并进行离心3min。

取出上清并加入等体积的异丙醇混合离心，并重复两次。

4.最后我们使用琼脂糖柱纯化试剂盒进行纯化。

按照说明书的操作步骤进行操作，得到纯化后的RNA样本。

5.测定RNA的浓度和纯度。

实验结果：我们成功地从四种植物组织中提取到了总RNA，并通过琼脂糖柱纯化法进行了纯化。

样品的RNA浓度和纯度如下表所示。

| 样品 | OD260/280 | RNA浓度（ng/μl） ||------|-----------|--------------------|| 木瓜叶片 | 2.08 | 363.7 |该实验成功地提取了四种植物组织中的总RNA，并经过琼脂糖柱纯化制备出了高质量和高纯度的RNA样本。

总RNA的提取（Trizol法自我总结）Trizol法提取总RNA（改进的一步法）1.先取1.5ml RNA专用离心管加入1ml Trizol后编号称重；2.研钵清洗干净后用燃烧法燃烧15min左右，然后-20度预冷，在加入植物材料前先加入液氮再次冷冻研钵（同时将药匙预冷），将植物材料50-100mg置于研钵中，加入液氮充分研磨成面粉状，用预冷的药匙小头部位转至1.5ml RNA专用EP管中，立即震荡混匀，裂解5分钟,裂解过程中称重。

注：样品量一定要少于100mg，用药匙的小头加入4次就差不多了；研磨时尽量多加几次液氮，多研磨几次，保证样品研磨得足够细（呈面粉状），不能吸水变潮；研磨加入EP管中后，必须立即摇匀，不能等到样品变潮；用药匙转移样品时，每次少加点，不能将样品粘到管口，加完一个样品后立即用纸擦干净，加下一个样品时药匙必须重新用液氮冷冻。

总之，整个过程中必须保证样品和与样品接触物品的温度足够低，直到样品与Trizol接触为止，以免RNase将RNA降解。

3.离心（4℃，12000×g）10分钟，取上清至一新的EP管中。

4.分相：①加0.2ml的氯仿，用手剧烈摇晃15秒钟，15-30℃静置3分钟；②离心（4℃，12000×g，勿超过12000×g）15分钟。

5.沉淀，并去除多糖：①用200ul的枪取无色相（大约300ul）至一新的EP管中，切勿吸到中间层；②加入等体积异丙醇颠倒混匀（动作缓和），15-30℃静置10min；③离心（4℃，12000×g，勿超过12000×g）10分钟，倾去上清。

6.清洗（2次）：①用200ul的枪吸除多余上清，加1ml冰预冷的75%乙醇，旋涡震荡；②离心（4℃，7500×g）5分钟。

7.用真空泵吸除乙醇，37℃干燥10分钟。

切勿干燥彻底，否则极难溶解。

8.加适量的DEPC?H2O（一般40ul），枪打数次，使沉淀溶解。

一、引言核酸是生物体内重要的遗传物质，包括DNA和RNA两种。

在生物学领域，核酸的研究具有极其重要的意义。

近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，核酸研究在疾病诊断、基因治疗、基因工程等领域取得了显著的成果。

为了深入了解核酸的原理和应用，我参加了学校组织的核酸原理实验课程。

通过实践，我对核酸有了更深刻的认识，现将心得体会分享如下。

二、实践过程1. 实验准备在实验前，我们首先了解了核酸的基本概念、结构、功能以及与生物体的关系。

接着，我们学习了DNA和RNA的提取、分离、鉴定等实验方法。

在实验过程中，我们严格按照实验步骤进行操作，力求做到精确、规范。

2. DNA提取DNA提取是实验的第一步。

我们采用了酚-氯仿法提取细胞内的DNA。

在实验过程中，我们学会了如何使用酚-氯仿混合液，如何分离蛋白质和DNA，如何用乙醇沉淀DNA 等。

通过实验，我们成功提取了细胞内的DNA。

3. DNA分离与鉴定在DNA分离与鉴定实验中，我们使用了琼脂糖凝胶电泳技术。

首先，我们制备了琼脂糖凝胶，然后加入DNA样品和电泳缓冲液。

在电泳过程中，DNA根据其分子量大小在凝胶中分离。

通过观察电泳图谱，我们可以鉴定DNA的存在。

4. RNA提取与鉴定RNA提取与鉴定实验是核酸原理实践的重要环节。

我们采用了酸酚法提取细胞内的RNA，并使用琼脂糖凝胶电泳技术对其进行鉴定。

在实验过程中，我们学会了如何使用酸酚混合液，如何分离蛋白质和RNA，如何观察电泳图谱等。

5. DNA复制与转录在DNA复制与转录实验中，我们学习了DNA聚合酶和RNA聚合酶的作用，以及DNA复制和转录的基本过程。

通过实验，我们成功观察到了DNA复制的现象，并利用DNA模板合成了cDNA。

三、心得体会1. 理论与实践相结合通过核酸原理实践，我深刻体会到理论与实践相结合的重要性。

在实验过程中，我们不仅学习了核酸的基本原理，还亲自动手操作，将理论知识应用于实践。

这种学习方法使我更加牢固地掌握了核酸知识。

RNA提取方法总结这篇文章主要讲的是几种常用的RNA提取方法。

1、异硫氰酸胍氯化铯超速离心法原理：使用蛋白质变性剂异硫氰酸胍有效抑制RNA酶的活性，经过起始密度为 1.78g/ml的氯化铯介质，进行密度梯度超速离心，RNA 沉淀于管底，而DNA与蛋白质在上清中。

使用这种方法，不但能得到高质量的RNA，而且能同时分离出细胞染色体DNA.本法对于冷冻时间长、细胞质和细胞核不易分离的组织标本以及富含RNA酶的组织细胞(如胰腺)的RNA提取尤其适合。

此法提取的RNA 的质量好和成功率高，已成为提取哺乳动物细胞RNA的常规方法。

其缺点是操作复杂、流程长，一次提取的样品数量有限。

2、盐酸胍-有机溶剂法本法有MacDonald 1987年在Strohman报道的方法基础上改进而成的，适用于没有超速离心及设备的情况下提取细胞总RNA。

它利用盐酸胍抑制RNA酶，匀浆裂解细胞，有机溶剂抽提去除蛋白质，通过选择性沉淀RNA分子而去除DNA，提取的RNA质量较好，但整个操作过程繁杂费时。

3、氯化锂-尿素法本法首先由Auffray报道，利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA 酶，3mol/L LiCl选择性沉淀RNA。

其缺点是有时会存在DNA污染，LiCl 沉淀RNA会丢失一些小分子量的RNA，如5S RNA等。

优点是快速简捷，尤其适用于大量样品少量组织细胞的RNA提取，其质量可以满足Northern分析，Oligo(dT)提取mRNA，SI核酸酶或RNase保护实验等。

本法每提取107个细胞能提取总RNA约10 g。

4、热酚法本法主要用于少量细胞样品RNA提取，其产量不高，但简单易行。

5、快速提取法本法主要用于培养细胞，通过0.5%SDS裂解细胞，酚抽提去除蛋白质和DNA沉淀，快速纯化RNA。

6、细胞质RNA提取法本法主要适用于培养细胞，首先去除细胞核，然后用蛋白酶K消化蛋白质，酚/氯仿抽提去除蛋白质。

操作简单，同时能进行多个样品操作，多数步骤在室温下进行，提取的RNA质量较高，可满足体外无细胞翻译系统、cDNA合成、引物延伸以及核酸酶SI保护实验。

科研杂谈RNA提取那些不容忽视的操作细节“为什么人家提RNA一提一个准，换了我就是死活提不出来（Orz），难道我就是传说中的RNA绝缘体？”相信怀有这种疑问的小伙伴不在少数，那么RNA提取过程成功与失败的决定因素到底在哪儿呢？本期我们先来看看RNA提取之经验总结篇：1、实验环境污染。

人体自然脱落的皮屑或是皮肤携带的细菌霉菌等微生物都可能成为RNA酶的来源从而影响RNA的提取。

因此，在实验过程中要养成严谨的无菌操作习惯，防止微生物污染。

2、操作时勤换手套，带好口罩，在冰上操作时动作要迅速。

3、保证所提RNA质量的关键的一步：加氯仿离心后出现三分层，上中下分别为RNA、DNA与蛋白，分离RNA时需注意防止DNA混入RNA。

因此，离心后不要马上吸取RNA上清液，先移取中层DNA 和下层蛋白，然后将剩下的下层油相（10%~15%）短暂高速离心后再吸取RNA上清液。

4、不同的样品前处理（1）提取细胞样品时：细胞离心后不能立马加入Trizol试剂，因为成团的细胞加入Trizol试剂后，外围细胞会先施放出大分子DNA聚积成团，干扰成团里层细胞的裂解。

这时，即使用加样枪或针头反复吸取也无法彻底打断已成团的DNA。

若提取样品来自培养的贴壁细胞，吸取培养基后用PBS洗涤细胞两次，而后直接加入Trizol试剂；若提取样品来自培养的悬浮细胞，需先连培养基一起离心，然后用PBS洗涤细胞两次后加入5~10%的PBS重悬细胞，待重悬完全后再加入Trizol试剂。

（2）提取组织样品时，常用液氮研磨法，需充分研磨至粉末状后再加入Trizol试剂。

该过程需注意以下三点：①研磨器皿需高压灭菌烘干后，于-80℃放置过夜预冷冻；②组织块的表面积尽可能大，避免成易飞出研钵的球状；③液氮用量要足，需让组织块完全冻透后，一次性将其研磨好（避免二次添加液氮导致样品飞溅）。

5、Trizol试剂能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶，故加入Trizol后样品RNA不会被RNA酶消化。

RNA提取心得一组织RNA提取1.最好新鲜组织，这样RNA提取的效果比较好，这是肯定的。

2.如果不是新鲜的（最好在半年之内，-80°或者液氮中冻存的）组织，注意不要反复冻融，从冰冻状态拿到0-4°，注意不要拿到常温，待组织解冻后，用DEPC泡过的剪刀剪一小块组织，称重后，放到预冷的匀浆器中，然后加入一定量的TRIZOL试剂，然后匀浆。

注意：速度不要太快，要匀一会挺一会，否则由于摩擦产热，RNA遇热会加速降解。

如果一次做多个标本的RNA提取，也要这样做，更不能急。

后面的步骤和细胞RNA提取一样。

二培养细胞的RNA提取1.贴壁细胞，需要先用胰酶消化后，然后收集到离心管中，离心，去上清，然后用PBS多洗2-3次，以去除多余的胰酶。

悬浮细胞，直接用吸管或者加样枪吹打评壁，以使细胞基本可以被吹下来。

然后离心去上清，不需要用PBS洗。

2.然后将少量细胞悬液转移到预冷的DEPC泡过的1.5毫升EP管中，然后加入一定量的TRIZOL(细胞多的话加1毫升，细胞少的话加0.5毫升就可以)，然后用枪头吹打混匀5-10分钟。

（如果有时间就继续往下做，如果没有时间，可以把加了TRIZOL后的细胞裂解液冻存到-80°，用的时候提取和新的提取的效果一样。

）在冰上操作。

3.上面的混匀5-10分钟，基本可以使细胞裂解，然后可以进行下面的步骤，详细的步骤我就不介绍了。

我只介绍一些需要注意的地方。

1.一定要注意冰上操作，低温离心。

2.戴口罩和勤换手套，去任何东西都要带着手套去取。

3.每次去器材的时候都要用镊子去夹，镊子要在酒精灯上烧一下。

4.所有的器材都要经过DEPC浸泡后高压后才可以使用，所需要的氯仿，酒精，异丙醇等都保证没有被RNA酶污染，不能用没有泡过DEPC的枪头去提取液体，一定要用DEPC 浸泡过的枪头去吸，如果发现试剂有可能被污染了，要立即更换。

5.吸取上清一定不要吸到中间层的蛋白，如果吸到蛋白一定要重新用氯仿抽提，因为，吸到的蛋白很可能会对RNA产生降解作用。

RNA抽提细节技巧小总结对大部分实验人员来说，RNA抽提比基因组DNA抽提要困难得多。

事实上，现有的RNA 抽提方法/试剂，如果用于从培养细胞中抽提RNA，比抽提基因组DNA更方便，成功率也更高。

那为什么同样的方法用于组织RNA的抽提，总会碰到问题呢？组织RNA抽提失败的两大现象是：RNA 降解和组织内杂质的残留。

关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提RNA不容易降解。

现有的RNA抽提试剂，都含有快速抑制Rnase 的成分。

在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。

细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的Rnase，所以RNA得以保持完整。

也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触，所以其RNA不容易被降解；反过来讲，组织中的RNA之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。

因此，假定有一种办法，在抑制RNA活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。

液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。

但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。

这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。

匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制Rnase活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的Rnase降解RNA的速度快。

电动匀浆器效果较好，玻璃匀浆器效果较差，但总的来说，匀浆器方法是不能杜绝降解现象的。

因此，如果抽提出现降解，原来用电动匀浆器的，改用液氮碾磨；原来用玻璃匀浆器的，改用电动匀浆器或者直接用液氮碾磨，问题几乎100%能获得解决。

影响后续实验的杂质残留问题，其原因比降解更多样，解决方法相应也不同。

总之，如果出现降解现象或者组织内杂质残留现象，则必须对具体实验材料的抽提方法/试剂进行优化。

优化大可不必使用您的宝贵样品：可以从市场上购买一些鱼/鸡之类的小动物，取相应部分的材料用于RNA抽提，其它部分用于抽提蛋白质——嘴用来碾磨，肠胃用来抽提。