实验1 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶【实验目的】掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理和校准曲线的绘制。
熟悉丙氨酸氨基转移酶测定的临床应用。
了解固定时间法测定酶活性的特点与应用。
【原理】丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase ，ALT ，EC 2·6·1·2）催化L-丙氨酸与α-酮戊二酸间的氨基移换反应，生成α-丙酮酸和L-谷氨酸。
经30min 反应后，加入2,4-二硝基苯肼终止反应，并与反应液中的两种α-酮酸生成相应的2,4-二硝基苯腙（丙酮酸苯腙和α-酮戊二酸苯腙）。
在碱性条件下，两种苯腙的吸收光谱曲线有差别，在500nm~520nm 处差异最大，以等摩尔浓度计算，丙酮酸苯腙的呈色强度约为α-酮戊二酸苯腙的3倍。
据此可以计算出丙酮酸的生成量。
谷氨酸丙酮酸酮戊二酸丙氨酸-+-−−→−-+-L L ALT αα二硝基苯腙，二硝基苯肼，酮酸碱性条件-−−−→−-+-4242α（红棕色，λ=505nm ）【试剂与器材】1．0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液 称取KH 2PO 4 13.61g ，溶解于蒸馏水中，加水至1 000ml ，4℃保存。
2．0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液 称取Na 2HPO 414.22g ，溶解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml ，4℃保存。
3．0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4） 取0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液420ml 和0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液80ml ，混匀，即为pH7.4的磷酸盐缓冲液。
加氯仿数滴，4℃保存。
4．基质缓冲液（200mmol/L 丙氨酸/2.0mmol/L α-酮戊二酸） 精确称取DL-丙氨酸1.79g ，α-酮戊二酸29.2mg ，溶于0.1mol/L 磷酸盐缓冲液约50ml 中，用1mol/L NaOH 调pH 至7.4，再加磷酸盐缓冲液至100ml ，4℃～6℃保存，该溶液可稳定2周。
授课对象：06级检验1-5班课时：2学时血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定（赖氏法）目标：1.掌握赖氏法测血清ALT的原理及注意事项2.掌握试剂的配制熟练地制作标准曲线3.规范地进行ALT测定4.了解血清ALT测定的临床意义实验用品：配制试剂用的各种器皿（烧杯、容量瓶、电炉、分析天平等）、37℃水浴箱、721型风光光度计、坐标纸等原理：丙氨酸和α-酮戊二酸在血ALT的作用下生成丙酮酸及谷氨酸，在酶反应达到规定时间时，加入2.4-二硝基苯肼-盐酸溶液以终止反应。
生成的丙酮酸与入2.4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸入2.4二硝基苯腙，苯腙在碱性条件下显红棕色。
根据显色之深浅，求得血清中丙氨酸氨基转移酶活力。
试剂：1. 0.1molPH7.4磷酸盐缓冲液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4AR）11.928g,磷酸二氢钾（KH2PO4AR）2.176g，加少量蒸馏水溶解并稀释至1000mL。
2. ALP基质液称取DL丙氨酸[CHCH（NH）COOH]1.79g，α-酮戊二酸[COOH （COCOOH）29.2mg于烧杯中，加入0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液80mL,煮沸溶解后待冷，用摩尔NaOH溶液调节PH至7.4（约加入0.5ml），再用0.1mol/LPH7.4磷酸盐缓冲液稀释至100mL,混匀，加氯仿数滴，置冰箱保存数周。
3．1mmol/L2.4-二硝基苯肼溶液称取 2.4-二硝基苯肼[（NO）CHNHNH AR]19.8mg，用10mol/L HC110mL溶解，然后加蒸馏水至100mL，置棕色瓶内，冰箱保存。
4．0.4mol/L NaOH溶液。
5．2mmol/L丙酮酸标准液精确称取丙酮酸钠[CHCOCOONa AR]22.0mg于100mL容量瓶中，加0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液至刻度。
此液应新鲜配制，不得久放。
操作：血清ALT测定步骤（赖氏法）加入物（mL）R B血清0.1 0.1ALP基质液0.5 —混匀，置37o C水浴30min2.4-二硝基苯肼0.5 0.5ALP基质液—0.5混匀，置37o C水浴20min0.4mol/L NaOH 5.0 5.0将上述两管混匀，10min后，用蒸馏水调零，λ=505nm比色读取各管吸光度值，用测定管A-对照管A，查标准曲线得ALT活力单位。
