动物微生物与免疫学

动物微生物与免疫学实验指导实验一培养基制备教学目标会制作液体培养基、固体培养基和半固体培养基。

仪器材料微波炉、高压灭菌器、玻璃器皿、PH试纸、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、氢氧化钠。

操作方法１．肉汤培养基制作⑪成分肉浸膏（0.3%牛肉膏） 1000ml蛋白胨 10g氯化钠 5g磷酸氢二钾 1g⑫准备工作配制调节PH用的0.1M氢氧化钠和1M氢氧化钠溶液。

⑬操作①称取牛肉膏，放入玻璃皿中，另入适量蒸馏水配成0.3%。

②按比例加入适量蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾搅拌。

③加热溶解。

④矫正PH值。

⑤过滤，并分装于无菌试管内（达试管的1/3）或每管加4-5ml。

⑥置高压灭菌器内高压灭菌（121.3℃，20分钟即可）2．普通琼脂培养基制作⑪成分肉汤培养基 1000ml琼脂 15-30g⑫制法①先矫正肉汤培养基PH值。

②加入适量琼脂煮沸溶解，矫正PH值。

③灭菌后使杂质沉淀。

④取其上清液灭菌后分装。

倒入无菌平皿内凝固即成平板培养基；倒入无菌试管中4-5ml，灭菌后趁热斜放凝固即成斜面培养基；倒入大试管15-20ml，灭菌后直立凝固即成高层培养基。

3．半固体培养基制作⑪成分肉汤培养基 1000ml琼脂 1-5g⑫制法同固体培养基。

⒋特殊培养基制作操作方法⑪血液琼脂①成分脱纤血液 5～10ml普通琼脂 100ml②方法a制作普通琼脂（同前）b冷至55℃c按以上数量加入血液，混合做成斜面或平板培养基即可。

⑫鉴别培养基（溴麝香草酚蓝培养基）①成分普通琼脂 100ml20%乳糖水溶液 5ml0.2%BTB水溶液 2ml②制法灭菌的乳糖溶液和BTB溶液依次加入已溶解的普通琼脂溶液中，混合后倒成平板即可。

⑬选择培养基（SS琼脂）①成分牛肉膏 5g示蛋白胨 5g乳糖 10g胆盐 8.5～10g枸橼酸钠 10～14g硫代硫酸钠 8.5～10g枸椽酸铁 0.5g煌绿 0.00033g中性红 0.022g琼脂 18g蒸馏水 1000ml②制法a先将牛肉膏、蛋白胨、琼脂加入蒸馏水中，加热溶解。

b再加入胆盐、乳糖、枸橼酸钠、硫代硫酸钠及枸橼酸铁以微热加温，使其全部溶解。

c修正pH值。

d过滤。

e煮沸10分钟。

f加入0.1%煌绿水溶液0.33ml、1%中性红水溶液2.5ml。

g摇匀灭菌。

h分装。

常用培养基成分及用途1．实验结果（1）简述移液管包装注意事项。

（2）简述配制液体培养基的简单步骤。

（3）简述斜面及平板培养基的制作过程。

2．思考题（1）为什么微生物实验室所用的移液管口或滴管口的上端均需塞上一小段棉茬再用报纸包起来，经高压蒸汽灭菌后才能使用?（2）配制培养基时为什么要调节pH?（3）制作平板培养基的注意事项是什么?（4）培养基配好后，为什么必须马上进行高压蒸汽灭菌?如不能及时灭菌时，应将培养基暂时放置何处?实验二显微镜的使用及细菌形态结构观察教学目标会使用显微镜油镜，认识细菌的基本形态及结构。

1．显微镜的结构显微镜的结构可分为下列各部分：⑪底座是支撑整个镜体的基座，位于显微镜的最下方，用于载荷全部显微镜的重量。

⑫镜架呈弓形，位于镜筒和底座之间，用以支持镜筒、载物台等，并便于显微镜的提取和移动。

⑬镜筒呈现圆筒状，位于镜架上前方，上端容纳目镜，下端与物镜连接。

用以使透过物镜的光线直达目镜而不致分散。

镜筒有一定长度，一般多为160mm。

⑭目镜位于镜筒的上端，是一个复合放大镜，用以由物镜所放大的影像再放大一次。

目镜的放大率与接目镜的直径和目镜筒长有关，即直径越小，筒长越短，而放大率越大。

镜外刻有放大率数字如5×、10×、40×、100×等。

⑮转换器位于镜筒的下端，其下装置各种不同放大倍数的物镜，用以转换物镜至使用位置上，以与光轴重合。

⑯物镜位于转换器的下方，利用入射光线造成被检物体的第一次影像。

它是由1~5组复式透镜所组成，每一组复式透镜又由一至数块透镜组成。

显微镜分辨率的高低主要决定于物镜的性能。

目镜是决定显微镜性能的最重要因素。

显微镜通常装有物镜5种，分别为低倍镜、高倍镜、油浸镜。

⑰载物台位于集光器的上方，呈圆形或方形，供放被检标本用。

⑱压钳和推进器有些显微镜的载物台上装有薄金属压钳两片，可用以固定承放标本的载玻片；载物台的后方左训各有小螺丝一个，用以移动载物台的上部，从而移动标本的位置。

有些显微镜则一载物台上装有推进器移动架，一方面可以固标本，另一方面可以将标本前后左右移动。

有些推进器上刻有尺度和数字，以便在重复观察时容易找出原来的检查部位。

⑲聚光镜又称集光器，位于载物台的下方，由一组透镜合成，可以上下移动，以使光线集中于检查的标本上。

⑳光圈位于聚光镜之下，可以放大和缩小；用以调节进入聚光镜的光量。

其转动的把手恒定于右方（左前象限中点与后象限中点之间）。

⑴滤光器位于光圈之下，呈圈状，可以装上玻璃片，以滤过进入集光器的光线。

通常显微镜附有蓝色玻璃片和毛玻璃片各一块，当用灯光时，可以装上蓝色玻片，使光线近似白昼光线；若光线过强时，可装上毛玻璃片，使光线柔和，不致刺眼。

⑵反光镜位于集光器的下方，一面为凹面镜，一面为平面镜，可随意翻转，用以将光线反射入集光器内。

在日光下用平面，人工光源用凹面；染色标本用平面，本色标本多用凹面。

⑶粗调节器位于镜筒和镜架交接处的上方，为较大的螺旋，可以旋转，以使镜筒升降，而调节物镜和标本之间的距离。

⑷细调节器位于粗调节器之下，为较小的螺旋，功用与粗调节器同，但其升降限度较小，作用机理较为精密。

2．油浸镜原理在油浸镜与标本之间，滴加香柏油后，调整光源作检查。

其使用原理是，因香柏油具有与玻璃相似的折射率（香柏油的折射率为1.515，玻璃的折射率为1.52）。

镜检时，滴加香柏油的作用是使光源尽可能多地进入物镜中，避免光线通过折光率低的空气（空气的折光率为1.0）而散失光线，因而能提高物镜的分辨力使物像明亮清晰。

3．观察细菌：基本形态：球菌、杆菌、螺旋菌；特殊结核：荚膜、鞭毛、芽胞4．显微镜的保护方法⑪由镜箱内取用显微镜时，应以右手持镜架，从箱内以水平方向抽出，不得碰撞，再用左手托底座，并保持镜筒上下垂直，以防止反光镜及接目镜滑落。

移动要轻缓，勿使震荡。

如搬移较远处时，须将显微镜在镜箱内固定后，再行搬移，以免损坏。

⑫显微镜用后须擦试干净，将各部恢复原位，将反光镜向下旋转，尤其注意不得将接物镜直对集光器，须将它叉开（使成八字形），同时落下集光器，以免发生撞坏的危险。

⑬显微镜不得受直射日光照射，或靠近热源，以免损坏镜头的粘胶和其它部分。

⑭不得与有腐蚀性和脂溶性的化学药品接触。

并避免潮湿，保持干燥和洁净。

⑮如非专业人员与必要时，不得随意拆卸显微镜。

⑯用毕，要小心地将其置于镜箱内锁好，放归原处，保存中应注意防止尘动手埃。

设备材料显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、细菌标本片等。

操作步骤①取显微镜：右手握接臂，左手托住镜座。

②上提镜筒。

（下降载物台）③放大光圈。

④打开光源。

⑤将标本片放在载物台上，用片夹固定。

⑥调节转换器，先使低倍镜对准中央，寻找适宜的视野⑦于标本片的欲检部位滴加香柏油。

⑧然后转换油镜镜头，使其对准中央。

⑨眼睛从镜筒侧面注视油镜镜头，小心转动粗调节器。

⑩左眼对镜筒，同时右眼争开，向上转动粗调节器，直至见到模糊物像为止。

转动细调节器，直至物像完全清晰为止。

擦试镜头：先用干擦掉香柏油，再用滴加少量二甲苯的擦镜纸擦试，最后再用干擦镜纸擦拭。

收放显微镜：将低倍镜对中央，各调节器均调至最低位置，减轻负重，放回原处。

实验报告1．实验结果绘制两幅细菌形态或结构镜下图，主要细菌的颜色、菌端特征。

2．思考题（1）说明普通光学显微镜油镜的使用原理。

（2）说明普通光学显微镜使用的注意事项。

实验三细菌的染色方法目的要求1．掌握细菌抹片的制备方法和几种常用的染色方法。

2．认识革兰氏染色和抗酸染色的反应特性。

3．认识细菌的基本形态和构造。

4．通过细菌标本片观察，进一步熟悉光学显微镜的使用。

基本原理细菌是单细胞生物，尽管个体微小，但有其完整的形态特征和结构。

细菌的基本形态可分为球状、杆状和螺旋状三种。

除细胞壁、细胞膜、细胞质和核质等基本结构外，尚有鞭毛、菌毛、芽孢、荚膜等特殊结构，也是辨别、鉴定细菌菌种的重要依据。

由于细菌细胞个体微小，不借助于显微镜，肉眼是无法观察到的。

而且，细菌细胞呈无色半透明状态，直接在普通光学显微镜下，也只能大致见到其外貌。

制成抹片并染色后，则能较清楚地显示其形态和结构，也可以根据不同染色反应，作为鉴别细菌的一种依据。

细菌的形态和特殊结构的观察，是学习微生物学的重要基本内容。

（一）简单染色法原理这是最基本的染色方法，由于细菌在中性环境中一般带负电荷，所以通常采用一种碱性染料，如美蓝、碱性复红、结晶紫、孔雀绿、蕃红等进行染色。

这类染料解离后，染料离子带正电荷，使细菌着色。

（二）革兰氏染色法原理革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色法，通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰阳性细菌（G+）和革兰氏阴性细菌（G—）两大类。

革兰氏染色过程中所用四种不同溶液的作用不同。

1．碱性染料草酸铵结晶紫溶液。

2．媒染剂碘液，其作用是增强染料与菌体的亲和力，加强染料与细胞的结合。

3．脱色剂乙醇将染料溶解，使被染色的细胞脱色，利用不同细菌对染料脱色的难易程度不同，而加以区分。

4．复染剂蕃红溶液，目的是使经脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未脱色的细菌进行比较。

革兰氏染色法具有重要的理论与实践意义，其染色原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。

革兰氏阴性菌的细菌壁脂类含量较多，肽聚糖层少而薄，网状结构交联少。

当以95％酒精脱色时，脂类被溶解，使得细胞壁孔隙变大，尽管95％酒精处理能使肽聚糖孔隙缩小，但因其肽聚糖含量较少，细胞壁缩小有限，故能让结晶紫与碘形成的紫色复合物被95％乙醇脱出细胞壁外，而被后来红色的复染剂染成红色。

而革兰氏阳性细菌细胞壁所含脂类较少，肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经95％乙醇脱色处理时，肽聚糖发生脱水作用，使孔隙缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子紫色染色料复合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细菌细胞被染成紫色。

（三）抗酸染色原理此染色法是鉴别分枝杆菌属的染色法。

分枝杆菌属细菌其菌体中含有分枝菌酸，用普通染色法不被着色，需在加热条件下与石炭酸复红牢固结合形成复合物。

而且用酸性乙醇处理不能使其脱色，故菌体染成红色。

（四）芽孢染色原理细菌的芽孢壁比细菌繁殖体的细胞壁结构复杂而且致密，透性低，着色和脱色都比细菌繁殖体困难。

因此，一般采用碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使细菌和芽孢都同时染上颜色后，再用蒸馏水冲洗，脱去菌体的颜色，但仍保留芽孢的颜色。

用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可以在显微镜下明显区分芽孢和细菌繁殖体的形态。