紫杉醇的发酵培养

微生物发酵生产紫杉醇研究进展摘要：综述了微生物发酵生产紫杉醇的主要研究进展，包括产紫杉醇的内生真菌的生物多样性、真菌细胞发酵生产紫杉醇的优势，同时也对如何改良内生真菌菌种性能和优化培养基组成及培养条件以提升其产紫杉醇的能力，作出了较为全面的综述。

关键字：紫杉醇，微生物发酵，内生菌，产量前言：目前国外市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮中提炼和人工合成方法，目前并未见有第三种形式形成大规模产业化制作的报道。

紫杉醇的生产受着原材料与科技二个方面的约束，短期内无法突破。

为克服红豆杉资源匮乏和紫杉醇需要量的日益扩大的问题，人类对生产紫杉醇开展了多种多样的科学研究，涉及化学全合成、植物细胞培养、微生物转化和微生物发酵。

微生物发酵法生产紫杉醇由于具备突出优点，其研制与发展日益引起中外科研学者的普遍重视。

一、紫杉醇产生菌的研究进展（一）产紫杉醇的内生真菌的种类Stierle和Strobel等首次从短叶红豆杉的树枝上分离出一个可以形成紫杉醇的内生真菌，命名为安德列亚霉[1]。

当时这一发现对于紫杉醇的药源研究是一次重要的突破，为开发紫杉醇的物源提出了一个崭新的途径。

此后，各地研究者相继进行对产紫杉醇的内生真菌的分离操作，先后在西藏红豆杉、云南省红豆杉、东北地区红豆杉、欧洲红豆杉和中国红豆杉中分离到能形成紫杉醇的内生真菌，其寄主植被基本包括红豆杉属下的所有种类。

在国外的树木中，科学家也分离出来到了可形成紫杉醇的内生真菌。

Li等在不同种类的秃柏的韧皮部和木材部中均分离出能形成紫杉醇的内生真菌[2]。

GA等18人在同一种松树中分离出产紫杉醇的内生真菌。

这表明，产紫杉醇的内生真菌不但存在于红豆杉属植被中，在某些非红豆杉属植被中也存在，他的研究结果更拓宽了产紫杉醇的内生真菌的研究范畴。

（二）真菌发酵制备紫杉醇的优越性与过去在红豆杉植株的树皮上获得的紫杉醇比较，由内生真菌发酵制备紫杉醇有着更多的优越性，微生物发酵方法具有以下特点：（1）微生物发酵的方法易扩大化，有利于工业化生产的落地实施；（2）微生物易于通过诱变育种等方法筛选高产菌株，提高紫杉醇的产量，微生物育种及选育速度明显高于植物细胞株；（3）内生真菌生长迅速，在简单培养基中便可大量繁殖，形成丰富的发酵活性性质；（4）内生真菌在生物反应器中生长时，可人为调节各项发酵参数，使代谢路径朝着有利于紫杉醇的生产及高浓度紫杉醇的积累的方向进行。

课程名称细胞工程课题紫杉醇的大规模培养及其影响因素学院酿酒与食品工程学院专业生物工程姓名学号指导老师老师紫杉醇的大规模培养及其影响因素钟坤1酿酒与食品工程学院生工112班摘要：紫杉醇是一个从红豆杉植物中提取的对多种癌症都具有较好疗效的天然药物。

近几年植物细胞培养生产紫杉醇的尝试性研究不断有突破性进展，综合当今研究报告，对利用植物细胞培养大规模生产紫杉醇过程及其影响因素作一定的分析与概述。

关键字：紫杉醇、细胞培养、红豆杉、影响因素紫杉醇是一种复杂的天然的抗癌药物，属于二萜生物碱，其基本结构由浆果赤霉素Ⅲ和连接其13位碳上一苯丙氨酸衍生物构成。

1982年紫杉醇开始在临床上进行试验，1989年完成II期临床，1990年进行Ⅲ期临床，1992年12月29日美国正式批准用于晚期卵巢癌、肺癌、子宫癌的治疗。

它是经认证、目前最好的天然抗癌药物之一，可广泛用于肺鳞癌、肺腺癌、乳腺癌、睾丸胚胎癌、卵巢癌、恶性胸腺癌、胆囊癌、食道癌、非小细胞肺癌、淋巴瘤、膀胱癌、生殖细胞癌、头颈癌等肿瘤的治疗，特别是晚期卵巢癌的治疗。

1995年中国医学科学院药物研究所研制的国产紫杉醇原料(从云南红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉、中国红豆杉和美丽红豆杉五种植物中提取，纯度达98％以上)、据估算，从1000~2000棵稀有的紫杉树皮中只能提取lkg紫杉醇，而对l例病人制各充足的药物需3～4棵百年的老红豆杉树。

由于红豆杉属植物中紫杉醇的含量极低，远远不能满足市场的要求。

为了解决紫杉醇供需之间的尖锐矛盾，多年来，科学家在寻找及扩大紫杉醇药源途径方面做了大量工作，紫杉醇的全合成已取得成功，但皆因路线长，收率低等原因目前无法实现工业化．化学半合成是一条扩大紫杉醇来源的较好途径，国外已用半合成法生产紫杉醇，但化学半合成所用前体巴卡亭III和10一去乙酰巴卡亭III等仍要依赖于从红豆杉属植物中提取，限制了它的应用，利用植物细胞培养技术生产紫杉醇是一种大有前途的途径。

紫杉醇真菌发酵试验方案1、培养基种子培养基：马铃薯200 g (去皮煮汁，过滤取液)，蔗糖20 g，水1 L。

配制方法是马铃薯去皮切条，水煮30 min，4 层纱布过滤，溶入蔗糖，然后加水定容，121℃灭菌30 min，在超净工作台内倒平板。

发酵培养基：葡萄糖5 g /L，蔗糖15 g /L，蛋白胨1 g /L，醋酸钠1 g /L，MgSO4 2. 5 mg /L，C a (NO3) 2 10 mg /L，CuSO4 10 mg /L，ZnSO4 5 mg /L，M nCl2 2. 5 mg /L，FeCl3 2 mg /L，KH2 PO4 100mg /L，维生素B1 5 mg /L，维生素B6 5 mg /L，甲醇10mL /L，油酸5mL /L。

2、菌株活化在冰箱中保存的平板菌种上取10m m×10 mm大小的菌块接种，转接于种子培养基中，200 r/m in摇床上28 ℃黑暗培养3 d。

3、液体培养(1)摇瓶培养实验将内生真菌菌株接种到发酵培养基中，培养3 d后取6 m l接入250 m l三角瓶中，28℃、220 r/min，每瓶60m l培养7 d。

(2)发酵罐培养实验将内生真菌菌株接种到发酵培养基中，培养3 d后取6 0m l接入2500 m l发酵罐中，28℃、220 r/min，培养7 d。

4、紫杉醇粗提将发酵液4 000 r/m in离心，取上清液于60 ℃下旋转蒸发至1 /10体积后，加入等体积乙酸乙酯在超声波下萃取1 h，收集乙酸乙酯层，沉淀的菌体用组织捣碎仪处理后，经低温冻融2次，加入一定量乙酸乙酯用超声波细胞破碎仪破碎细胞。

加入等体积乙酸乙酯超声波提取1 h，收集乙酸乙酯层。

菌体沉淀和上清液再加入等体积的乙酸乙酯超声波提取2次。

合并乙酸乙酯层，并于50 ℃下旋转蒸发至干，加入适量甲醇溶解洗涤固体，再加入体积比为1：1的二氯甲烷-水混合液萃取后，将二氯甲烷层45 ℃旋转蒸发至干，用少量甲醇溶解过滤。

微生物发酵生产紫杉醇产品介绍及社会价值：紫杉醇是一种二萜类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一⋯。

紫杉醇最早是wanj等于1971年从短枝红豆杉(7Ikusbreviifolia)树皮中分离得到的。

随后，schiff等证实紫杉醇具有独特的抗癌机制。

随着紫杉醇的临床应用，对其研究也逐渐深入，其主要抗癌机制为抑制肿瘤细胞的微管(Microtllbules)合成，以阻断细胞分裂，致使肿瘤体积逐渐缩小；紫杉醇还可诱导细胞凋亡，另外还有类似脂多糖(IPS)的作用，可调节机体的免疫功能。

目前国际市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮提取及半合成，迄今为止尚未见有第三种形式形成大规模工业化生产的报道。

紫杉醇的工业生产受到了原料和技术两方面的制约，短期内难以突破。

为了解决红豆杉资源短缺与紫杉醇需求量的日益增加的矛盾，人们对生产紫杉醇进行了多方面的研究，包括化学全合成、红豆杉细胞培养及微生物发酵。

微生物发酵法生产紫杉醇因具有明显优势，其研究和开发越来越受到国内外研究学者的广泛关注。

这里提出一种运用基因工程，代谢工程，发酵工程结合的方法生产紫杉醇，该法首先将杉醇纯合成基因克隆至大肠杆菌，让其高产紫杉二烯，再把它流加至高产紫杉醇酵母的发酵罐中，运用代谢工程手段生产紫杉醇。

创新点：运用克隆方法，将合成紫杉二烯的代谢过程酶的结构基因，以及调控系列克隆至大肠杆菌，让其表达，此过程刚被Parayil Kumaran Ajikumar及其同事实现，而运用代谢工程手段让高产紫杉醇酵母利用紫杉二烯这个前体高产紫杉醇，这是没尝试但可行的。

国内外研究：1、分离菌种：最早stierle和strobel等在短叶红豆杉的枝条上分离到一种内生真菌，能够产生紫杉醇，定名为安德列亚霉。

此后，各国学者纷纷开展产紫杉醇内生真菌的分离工作，陆续从西藏红豆杉、云南红豆杉、东北红豆杉、欧洲红豆杉、中国红豆杉中分离到产紫杉醇的内生真菌，其宿主植物几乎涉及红豆杉属的各个种。

化工 进 展·392·CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS2012年第 31卷第 2期进展与述评微生物发酵法生产紫杉醇的研究进展张昕欣 1，吴翰桂1，奚立民1，王玲萍 2（1台州职业技术学院生物与化学工程系，浙江台州 318000；2浙江海正药业股份有限公司，浙江台州 318000） 摘 要：微生物发酵生产紫杉醇由于其环境友好、工艺简单、成本低廉的优势，近年来被认为是解决紫杉醇生 产原料来源危机的良好方法。

由于单位发酵液中紫杉醇产量太低，迄今为止尚没有一株可以进行工业化生产的 产紫杉醇菌株问世。

本文就微生物发酵法生产紫杉醇的研究现状进行了总结分析，主要包括紫杉醇产生菌的筛 选、发酵培养基的优化、微生物体内紫杉醇合成相关酶基因的克隆及产紫杉醇菌种的改良。

关键词：紫杉醇产生菌；培养基优化；菌种改良 中图分类号：Q 939.79文献标志码：A文章编号：1000–6613（2012）02–0392–05Recent research and prospect on microbial producing taxolZHANG Xinxin 1，WU Hangui 1，XI Limin 1，WANG Lingping 2（1 Departement of Biological and Chemical Engineering ，Taizhou Technical College ，Taizhou 318000，Zhejiang ，China； 2Hisun Pharmaceutical Co. Ltd.，Taizhou 318000，Zhejiang ，China ）Abstract ： F o r its environmentally acceptable ， r e latively simple and inexpensive features ，microor-ganisms fermentation has been investigated as a potential alternatives to solve the crisis of raw material. No commercial fermentation strain has been used so far ，because of the low production. The aim of this study is to review and analysis the present status of research on paclitaxel-producing by microorganisms ，screening of paclitaxel-producing microorganisms ，optimization of the culture medium ，genes of the paclitaxel biosynthesis and improvement of the taxol-producing microorganisms. Key words ：taxol-producing microorganisms ；optimization of the culture medium ；improvement of strain紫杉醇（taxol ）是在 20世纪 60年代早期从太 平洋紫杉中分离出来的一种二萜类生物碱（图 1）， 经研究发现其具有广泛的抗癌活性[1]。

微生物发酵生产紫杉醇产品介绍及社会价值：紫杉醇是一种二萜 类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的 抗癌药物之一 ？。

紫杉醇最早是wanj 等于1971 年从短枝红豆杉(7lkusbreviifolia) 树皮中分离得到的。

随后， schiff 等证实 紫杉醇具有独特的抗癌机制。

随着紫杉醇 的临床应用，对其研究也逐渐深入，其主 要抗癌机制为抑制肿瘤细胞的微管 (Microtllbules) 合成，以 阻断细胞分裂，致使肿瘤体积逐渐缩小；的作用，可调节机体的免疫功能。

目前国际市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮提取及半合 成，迄今为止尚未见有第三种形式形成大规模工业化生产的报道。

紫杉醇的工业生产受到了 原料和技术两方面的制约， 短期内难以突破。

为了解决红豆杉资源短缺与紫杉醇需求量的日 益增加的矛盾，人们对生产紫杉醇进行了多方面的研究，包括化学全合成、红豆杉细胞培养 及微生物发酵。

微生物发酵法生产紫杉醇因具有明显优势，其研究和开发越来越受到国内外 研究学者的广泛关注。

这里提出一种运用基因工程，代谢工程，发酵工程结合的方法生产紫杉醇， 该法首先将杉醇 纯合成基因克隆至大肠杆菌，让其高产紫杉二烯，再把它流加至高产紫杉醇酵母的发酵罐中， 运用代谢工程手段生产紫杉醇。

创新点：运用克隆方法，将合成紫杉二烯的代谢过程酶的结构基因，以及调控系列克隆至大 肠杆菌，让其表达，此过程刚被 Parayil Kumaran Ajikumar 及其同事实现，而运用代谢工程手 段让高产紫杉醇酵母利用紫杉二烯这个前体高产紫杉醇，这是没尝试但可行的。

国内外研究：1、 分离菌种：最早stierle 和strobel 等在短叶红豆杉的枝条上分离到一种内生真菌，能够产生紫杉醇，定名为安德列亚霉。

此后， 各国学者纷纷开展产紫杉醇内生真菌的分离工作， 陆续 从西藏红豆杉、云南红豆杉、东北红豆杉、欧洲红豆杉、 中国红豆杉中分离到产紫杉醇的内 生真菌，其宿主植物几乎涉及红豆杉属的各个种。

微生物发酵生产紫杉醇产品介绍及社会价值：紫杉醇是一种二萜类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一⋯。

紫杉醇最早是wanj等于1971年从短枝红豆杉(7Ikusbreviifolia)树皮中分离得到的。

随后，schiff等证实紫杉醇具有独特的抗癌机制。

随着紫杉醇的临床应用，对其研究也逐渐深入，其主要抗癌机制为抑制肿瘤细胞的微管(Microtllbules)合成，以阻断细胞分裂，致使肿瘤体积逐渐缩小；紫杉醇还可诱导细胞凋亡，另外还有类似脂多糖(IPS)的作用，可调节机体的免疫功能。

目前国际市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮提取及半合成，迄今为止尚未见有第三种形式形成大规模工业化生产的报道。

紫杉醇的工业生产受到了原料和技术两方面的制约，短期内难以突破。

为了解决红豆杉资源短缺与紫杉醇需求量的日益增加的矛盾，人们对生产紫杉醇进行了多方面的研究，包括化学全合成、红豆杉细胞培养及微生物发酵。

微生物发酵法生产紫杉醇因具有明显优势，其研究和开发越来越受到国内外研究学者的广泛关注。

这里提出一种运用基因工程，代谢工程，发酵工程结合的方法生产紫杉醇，该法首先将杉醇纯合成基因克隆至大肠杆菌，让其高产紫杉二烯，再把它流加至高产紫杉醇酵母的发酵罐中，运用代谢工程手段生产紫杉醇。

创新点：运用克隆方法，将合成紫杉二烯的代谢过程酶的结构基因，以及调控系列克隆至大肠杆菌，让其表达，此过程刚被Parayil Kumaran Ajikumar及其同事实现，而运用代谢工程手段让高产紫杉醇酵母利用紫杉二烯这个前体高产紫杉醇，这是没尝试但可行的。

国内外研究：1、分离菌种：最早stierle和strobel等在短叶红豆杉的枝条上分离到一种内生真菌，能够产生紫杉醇，定名为安德列亚霉。

此后，各国学者纷纷开展产紫杉醇内生真菌的分离工作，陆续从西藏红豆杉、云南红豆杉、东北红豆杉、欧洲红豆杉、中国红豆杉中分离到产紫杉醇的内生真菌，其宿主植物几乎涉及红豆杉属的各个种。

发酵法生产紫杉醇的工艺研究(孙春艳S2009134 )一、项目立项依据（立项的必要性及需求分析）紫杉醇(paclitaxel，商品名Taxol)是从红豆杉属植物树皮中提取分离出来的一种次生代谢物，是一种二萜类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一。

由于其具有显著抗癌效果，现已成为临床上治疗肿瘤的重要药物。

紫杉醇的活性就表现在两个方面：1.对于迅速分裂的肿瘤细胞，紫杉醇“冻结”有丝分裂纺锤体，从而使肿瘤细胞停止在G2期和M期，直至死亡。

2.紫杉醇也作用于巨噬细胞上的肿瘤坏死因子(TNF)受体，促使释放白细胞介素(IL)-1、TNF-2、IL-6、干扰素(IFN)-1、IFN-2对肿瘤细胞起杀伤或抑制肿瘤细胞迁移作用。

紫杉醇在临床上的研究既有抗癌方面的作用又有治疗非癌症方面的作用。

在癌症方面，对晚期卵巢癌、转移性乳腺癌、食道癌、肺癌、头颈部癌和鳞状细胞癌均有明显疗效。

在非癌症方面，对类风湿性关节炎、抗疟作用、多囊性肾病、卡波海里是肉瘤有良好的治疗及抑制作用。

随着生活水平的提高，环境污染日益加剧，给人类健康造成了危害，同时人类癌症的发生随之日益加剧，所以人们对紫杉醇的需求也随之增加。

紫杉醇在Taxus属植物树皮中含量仅为0.01%，每提取1公斤要砍伐1000-2000棵树的树皮。

据估测，紫杉醇正式应用于临床后，每年约需200公斤以上，按现在的提取得率0.03%计算，每年要收集700吨树皮来提取。

即使全部天然资源采伐，也只能满足短期需要，并造成对森林和人类生存环境以及生物多样性不可弥补的损失，因此紫杉醇的原料保障就成为该药能否成功走向市场的的关键。

但因资源匮乏，单纯从含量甚微的天然红豆杉植物中提取紫杉醇无法满足临床需求，故紫杉醇的药源问题已引起人们的极大关注。

发酵法生产紫杉醇优点很多，既能保护生态环境，又能快速的生产出所需要的药品，是值得研究应用的。

针对紫杉醇的需求量的增加，药源少的问题，运用发酵的方法生产紫杉醇，降低它的价格，为广大人民所用，就成了迫在眉睫的任务。

发酵法生产紫杉醇的工艺研究(孙春艳S2009134 )一、项目立项依据（立项的必要性及需求分析）紫杉醇(paclitaxel，商品名Taxol)是从红豆杉属植物树皮中提取分离出来的一种次生代谢物，是一种二萜类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一。

由于其具有显著抗癌效果，现已成为临床上治疗肿瘤的重要药物。

紫杉醇的活性就表现在两个方面：1.对于迅速分裂的肿瘤细胞，紫杉醇“冻结”有丝分裂纺锤体，从而使肿瘤细胞停止在G2期和M期，直至死亡。

2.紫杉醇也作用于巨噬细胞上的肿瘤坏死因子(TNF)受体，促使释放白细胞介素(IL)-1、TNF-2、IL-6、干扰素(IFN)-1、IFN-2对肿瘤细胞起杀伤或抑制肿瘤细胞迁移作用。

紫杉醇在临床上的研究既有抗癌方面的作用又有治疗非癌症方面的作用。

在癌症方面，对晚期卵巢癌、转移性乳腺癌、食道癌、肺癌、头颈部癌和鳞状细胞癌均有明显疗效。

在非癌症方面，对类风湿性关节炎、抗疟作用、多囊性肾病、卡波海里是肉瘤有良好的治疗及抑制作用。

随着生活水平的提高，环境污染日益加剧，给人类健康造成了危害，同时人类癌症的发生随之日益加剧，所以人们对紫杉醇的需求也随之增加。

紫杉醇在Taxus属植物树皮中含量仅为0.01%，每提取1公斤要砍伐1000-2000棵树的树皮。

据估测，紫杉醇正式应用于临床后，每年约需200公斤以上，按现在的提取得率0.03%计算，每年要收集700吨树皮来提取。

即使全部天然资源采伐，也只能满足短期需要，并造成对森林和人类生存环境以及生物多样性不可弥补的损失，因此紫杉醇的原料保障就成为该药能否成功走向市场的的关键。

但因资源匮乏，单纯从含量甚微的天然红豆杉植物中提取紫杉醇无法满足临床需求，故紫杉醇的药源问题已引起人们的极大关注。

发酵法生产紫杉醇优点很多，既能保护生态环境，又能快速的生产出所需要的药品，是值得研究应用的。

针对紫杉醇的需求量的增加，药源少的问题，运用发酵的方法生产紫杉醇，降低它的价格，为广大人民所用，就成了迫在眉睫的任务。