生物固氮的研究进展及发展趋势_张武

生物固氮的原理、应用及研究进展摘要：生物固氮是自然生态系统中氮的主要来源全球生物固氮的量是巨大的，海洋生态系统每年生物固氮量在四百万吨到两千万吨，陆地生态系统生物固氮量在九百万吨到一千三百万吨，而工业固氮量在世纪年代中期每年约为一千三百万吨。

可见，生物固氮在农林业生产和氮素生态系统平衡中的作用很大我国农民利用豆科植物固氮肥田历史悠长，直至现在仍保留着豆科植物和非豆科植物轮作套作和间作等耕作制度国外也十分重视固氮生物在农业中的作用。

关键词：生物固氮；联合固氮菌；自生固氮菌一、生物固氮的原理1982年，Postage 以肺炎克氏菌为例提出一个固氮酶催化机理模式，至今仍被广泛采用其总反应式为：N2 + 6H+ + nMg-ATP +6e-(酶)→2NH3+nMg-ADP+nPi固氮微生物的固氮过程是在细胞内固氮酶的催化作用下进行的不同固氮微生物的固氮酶，其催化作用的情况基本相同在固氮酶将还原成的过程中，需要e和H+，还需要ATP提供能量生物固氮的过程十分复杂[1]，简单地说，即在ATP提供能量的情况下，e和H+通过固氮酶传递给N2，使它们还原成NH3，而乙炔和N2具有类似的接受e还原成乙烯的能力。

二、固氮微生物的种类固氮微生物多种多样，不同的划分标准满足了不同的要求。

从它们的生物固氮形式来分，有自生固氮、联合固氮、和共生固氮3种。

①自生固氮微生物是指能够在自由生活状态下固氮的微生物总称。

在自然界，自生固氮微生物种类很多，分散地分布在细菌和蓝细菌的不同科、属和不同的生理群中；并大致可以分为光合细菌和非光合细菌两类。

前者如红螺菌、红硫细菌和绿硫细菌等，其中的某些种类可与其它微生物联合而相互有利；后者的种类很多。

根据非光合细菌的自生固氮菌对氧的需求，可以分为厌氧的细菌如梭状芽胞杆菌[2]；需氧细菌如自生固氮菌、贝捷林克氏固氮菌、固氮螺菌等；以及兼性细菌如多粘芽胞杆菌、克鲁伯氏杆菌、肠杆菌等。

自生固氮微生物中的某些种类，在有些情况下可以与植物进行联合固氮。

生物固氮的研究进展及发展趋势
生物固氮是一种自然界中重要的氮循环过程，其在农业和生态系统中具有重要的意义。

研究生物固氮的进展以及未来的发展趋势，对于提高农作物产量、节约化肥资源、增加土壤肥力以及保护环境都具有重大意义。

近年来，生物固氮的研究取得了一系列重要的进展。

首先，对于固氮微生物群落结构和功能的理解不断深化。

通过使用分子生物学技术，可以快速检测和鉴定土壤和根际中的固氮微生物，了解它们的多样性和分布情况。

此外，通过基因组学和转录组学等方法，可以深入研究固氮微生物的基因表达和代谢途径，进一步揭示其固氮机制。

其次，关于如何提高固氮效率的研究也取得了进展。

通过选择性培育具有高效固氮能力的微生物或植物品种，可以显著提高固氮效率。

同时，研究表明，与其他生物有机肥料和化学肥料的联合使用可以进一步提高固氮效率。

此外，通过调控固氮微生物与宿主植物的共生关系，可以提高植物对固氮微生物的利用效率。

在生物固氮的未来发展中，一方面，研究人员将继续深入探索固氮微生物的多样性和功能，通过开展元基因组学和功能基因组学研究，预期会发现更多新的固氮微生物。

另一方面，研究人员将努力开发新的技术和方法，以提高固氮效率。

例如，通过基因编辑和代谢工程等手段，改良固氮微生物的代谢途径和固氮酶的催化效率。

此外，研究人员还将关注固氮微生物与植物之间的信号交流和共生调控机制，以更好地控制和利用生物固氮过程。

综上所述，生物固氮研究取得了不少进展，并且未来的发展趋势也比较明确。

通过深入研究固氮微生物群落结构和功能，以及努力提高固氮效率，我们有望实现更加可持续和高效的氮肥利用，在农业生产和环境保护中发挥重要作用。

生物固氮的原理、应用及研究进展摘要：生物固氮是自然生态系统中氮的主要来源全球生物固氮的量是巨大的，海洋生态系统每年生物固氮量在四百万吨到两千万吨，陆地生态系统生物固氮量在九百万吨到一千三百万吨，而工业固氮量在世纪年代中期每年约为一千三百万吨。

可见，生物固氮在农林业生产和氮素生态系统平衡中的作用很大我国农民利用豆科植物固氮肥田历史悠长，直至现在仍保留着豆科植物和非豆科植物轮作套作和间作等耕作制度国外也十分重视固氮生物在农业中的作用。

关键词：生物固氮；联合固氮菌；自生固氮菌一、生物固氮的原理1982年，Postage 以肺炎克氏菌为例提出一个固氮酶催化机理模式，至今仍被广泛采用其总反应式为：N2 + 6H+ + nMg-ATP +6e-(酶)→2NH3+nMg-ADP+nPi固氮微生物的固氮过程是在细胞内固氮酶的催化作用下进行的不同固氮微生物的固氮酶，其催化作用的情况基本相同在固氮酶将还原成的过程中，需要e和H+，还需要ATP提供能量生物固氮的过程十分复杂[1]，简单地说，即在ATP提供能量的情况下，e和H+通过固氮酶传递给N2，使它们还原成NH3，而乙炔和N2具有类似的接受e还原成乙烯的能力。

二、固氮微生物的种类固氮微生物多种多样，不同的划分标准满足了不同的要求。

从它们的生物固氮形式来分，有自生固氮、联合固氮、和共生固氮3种。

①自生固氮微生物是指能够在自由生活状态下固氮的微生物总称。

在自然界，自生固氮微生物种类很多，分散地分布在细菌和蓝细菌的不同科、属和不同的生理群中；并大致可以分为光合细菌和非光合细菌两类。

前者如红螺菌、红硫细菌和绿硫细菌等，其中的某些种类可与其它微生物联合而相互有利；后者的种类很多。

根据非光合细菌的自生固氮菌对氧的需求，可以分为厌氧的细菌如梭状芽胞杆菌[2]；需氧细菌如自生固氮菌、贝捷林克氏固氮菌、固氮螺菌等；以及兼性细菌如多粘芽胞杆菌、克鲁伯氏杆菌、肠杆菌等。

自生固氮微生物中的某些种类，在有些情况下可以与植物进行联合固氮。

一、生物固氮产业发展状况1、生物固氮产业发展的背景意义氮、磷、钾是作物的三大营养元素，氮素尤其重要。

虽然空气中氮气的含量接近80%，但由于氮气是惰性气体，不能为作物直接利用。

化学氮肥的施用，在补充作物氮素营养、提高作物产量、保障我国的粮食安全方面发挥了巨大作用，但近年来，其与生态环境及农业可持续发展的矛盾日益凸显：1）化学氮肥的过量及不合理施用，使氮肥利用率不足30%，造成大量资源的浪费；2）粮食产出与化肥投入比呈现逐年下降的趋势，化肥在保障粮食安全方面的作用逐渐减弱；3）带来了环境污染等一系列问题：污染水体：全国532条河流中，82%受到不同程度的氮污染，水体富营养化严重；污染大气：每年我国氮肥生产耗能1亿多吨标准煤，CO2净排放量可达4亿吨以上，加剧温室效应；破坏土壤结构：部分地区土壤有机质含量从5%～8%，已降到1%～2%，土壤板结严重；影响食品安全：豆科作物食用部分的硝酸盐含量随着氮肥施用量的增加而大幅度提高，人体摄入的硝酸盐约80%以上来自豆科作物， 34种豆科作物的350个样品分析测定中，硝酸盐含量超标占61.7%；加剧病虫害：在黑龙江等粮食主产区，每年生产季节发生病虫害面积达600万亩，其中70%是因氮肥过量引起的，造成直接经济损失达50亿元。

在世界性能源危机和环境污染的压力下，必须寻求一种高效利用资源、环境友好的农业生产途径。

生物固氮，是发生在含有固氮酶的微生物种类中，将氮气还原成氨的一种生物过程，此过程在自然条件下完成，不消耗能源，也不对环境产生污染。

在自然界中，已知200多属细菌中含有固氮菌株，根据其与植物的互作关系分为：共生固氮菌，联合固氮菌和自生固氮菌，其中，根瘤菌能够与豆科植物形成共生固氮体系，共生固氮效率最高；联合固氮菌与植物是一种松散的结合，定植于作物的根际和植物体内进行固氮，并可分泌植物激素促进作物生长；联合固氮和共生固氮都可为作物提供氮素，减少化肥使用，在环境污染越演越烈的今天备受关注，生物固氮的可功效为：1）在减少化学氮肥上的作用。

固氮菌的生产应用现状及研究方向前言：固氮菌可以增加作物的产量，在农业生产中具有重要的作用。

目前应用最多的主要是根瘤菌，生物固氮越来越受到重视，它将向更深更远的方向发展。

population can increase the plant's output in agriculture has an important role. at present, the most applied largely root nodule truffles, and biological nitrogen fixation more attention, it will more further developed.引言：固氮作用是将空气中的氮气固定成氨。

人类与许多其它生物一样需要氮素作为合成蛋白质的原料，但不能自我合成有机氮。

虽然空气中有78%是氮气，但是绝大多数生物不能直接利用空气中的氮气。

关键词：固氮菌生产根瘤菌应用研究方向这里所说的固氮菌类肥料是指以自生固氮和联合固氮微生物菌生产出来的固氮菌类肥料生产中以联合固氮菌肥为。

这是由于联合固氮体系存在广泛，特异性不强，应用的范围；它的不足之处是作物与微生物只是松散的联合，它们之间没有形成共生的组织结构，因此固氮的活动容易受许多条件的制约。

例如，环境中速效氮含量高时，固氮活动受到抑制，有些芽胞细菌在有氧情况下常常停止1应用基础此类微生物肥料在生产实践中应用不少，其原因是除了它们能固定一定量的氮以外，这些微生物当中的许多菌株在生长繁殖过程中，它们能够产生多种植物激素类物质，促进作物生长。

2目前，用于生产此类微生物肥料的菌种主要有：园褐固氮菌或称为褐球固氮菌(Azotobacter chroococum)；棕色固氮菌亦称维涅兰德固氮菌(Azotobacter chroococum)；德氏拜叶林克氏固氮菌(Beijerinckia derxii)和克氏杆菌属(Klebsiella spp.)、肠道杆菌属(Enterobacter spp.)及产碱菌属(Alcaligenes spp.)中的某些菌种。

生物固氮技术的应用与前景生物固氮技术，是指利用某些微生物或植物，通过固氮作用将空气中的氮气转化为植物可利用的氨基氮而形成一种新型的农业技术。

在农业生产中，应用生物固氮技术可以有效地提高土壤肥力，促进作物的生长与发育，减少农民施肥成本，改善农业生态环境等，因此被广泛地应用于农业生产中，具有广阔的发展前景。

一、生物固氮技术的应用生物固氮技术的应用非常广泛，主要应用于三大领域，具体如下：1.农业领域生物固氮技术的运用，可以改善土壤肥力，增加农田的生物量，提高农产品的产量和品质。

通过种植草坪、绿肥、豆科作物等来增加土壤中的氨基氮含量，不仅可以提高作物的产量，同时也可以降低农民的施肥成本，减轻农民的负担，特别是对一些贫困地区的农民来说，生物固氮技术的应用意义更加重大。

2.环境保护领域生物固氮技术的应用还可以改善环境。

农业生产中过度使用化肥，会导致土地肥力下降，同时化肥还会污染地下水，污染环境。

利用生物固氮技术来提高土地肥力，可以有效地减少化肥的使用量，从而降低化肥对环境的污染。

3.生态修复领域利用生物固氮技术进行退化土地的修复，可以恢复土地的肥力，提高土地的西质，使得荒地成为有生命力的耕地。

同时，种植豆科作物还可以增加土壤有机质和微生物数量，改善土壤生态环境。

二、生物固氮技术的前景生物固氮技术在未来的发展中，将会有以下几个方面的发展趋势：1. 应用广泛程度还会进一步提升。

生物固氮技术虽然已经得到了广泛运用，但是在很多地区，尤其是发展中国家农村地区，生物固氮技术还没有得到充分的应用。

未来，生物固氮技术的应用范围还会进一步扩大。

2.技术手段不断创新。

生物固氮技术目前已经在很多方面取得了显著进展，但是目前仍存在着一些技术的不足之处。

未来，生物固氮技术的研究人员将继续创新技术，提高技术的精度、高效性和环境友好性。

3.绿色农业的快速发展。

随着人们对于环境污染和食品安全的重视，绿色农业的快速发展，成为未来农业发展的重要趋势。

生物固氮测定方法研究进展2016051848 黄鹏摘要:对生物固氮测定的方法乙炔还原法(A R A)、15N同位素稀释法(I D)、、非同位素法、全氮差值法和酰脲估测法进行综述,并评述了其引起误差的因素和测定结果的准确性。

关键词:生物固氮;固氮量;测定;方法目前,固氮测定技术对于生物固氮研究是十分重要的。

随着研究的深入,固氮测定技术也不断地向准确、可靠、操作简便的方向发展。

生物固氮测定方法主要有乙炔还原法、、15N同位素稀释法、非同位素法、全氮差值法和酰脲估测法等。

为便于更好研究生物固氮, 本文主要介绍常用的几种测定方法以及它们的优缺点,以供参考。

1乙炔还原法始于20世纪60 年代, 目前被广泛应用,根据固氮酶具有还原分子氮或利用其他底物的能力,使乙炔还原为乙烯,作为固氮的间接测定。

从植物根际分离的纯培养物分别接种于盛有无氮半固体培养基的血清小瓶中,置于28 ～30 ℃培养箱中培养48 h ,将血清小瓶瓶盖在无菌条件下换成橡胶塞,用无菌注射器抽出10 %的气体, 每瓶注1 mL C2H4,,再置于28 ～30 ℃下培养24 ～48 h。

用无菌注射器从瓶种抽取混合气体0 .2 m L 注入气相色谱仪(GC)进样柱中, 测定C2H4含量。

其中,以不接种菌注有C2H2的血清小瓶为对照, 重复 3 次。

从显示屏上C2H2、C2H4峰值判定有无C2H4的产生以确定其固氮性能, 按下式计算其固氮酶活性大小。

A RA =（实际C2H4峰面积×标准气含量×血清小瓶容积∕（标准气峰面积×进样量×培养时间×样品量）。

主要仪器：SP一02型气相色谱仪和氢离子化鉴定器。

该方法优点是灵敏度高,操作较简单,速度快、费用较低,可快速确认固氮作用的存在与否。

并通过还原乙炔活性的强弱，推算出植物——— 固氮菌联合体的固氮量、适应范围广,可以离体,也可以整株活体连续测定或原位测定。

中国生物固氮研究现状和展望沈世华荆玉祥*(中国科学院植物研究所中国科学院光合作用和环境分子生理学重点实验室, 北京100093. *联系人, E-mail: yxjing@ )摘要生物固氮是生命科学中的重大基础研究课题之一, 它在生产实际中发挥着重要作用: 为植物特别是粮食作物提供氮素、提高产量、降低化肥用量和生产成本、减少水土污染和疾病、防治土地荒漠化、建立生态平衡和促进农业可持续发展. 本文在介绍国际生物固氮研究进展的同时, 着重叙述了生物固氮研究取得的重大进展和成果: 收集了根瘤菌资源, 建立了最大的数据库, 修正和发展了国际上对根瘤菌的分类; 发现了固氮基因, 证实了克氏杆菌固氮基因操纵子的连锁性及正调控基因的调节机制和对氧、温度的敏感性; 发现苜蓿根瘤菌结瘤调控基因nodD3的产物对结瘤基因表达的启动不受宿主类黄酮的作用; 发现苜蓿根瘤菌的碳利用基因和固氮生物氮代射和碳代谢基因表达及其调节的偶联作用; 化学合成了根瘤菌的结瘤因子; 在固氮基因表达调节基础上, 构建了固氮基因工程菌株, 并在生产中得到应用; 提出了化学模拟固氮酶的结构和功能, 固氮酶活性中心的模型和合成了模型化合物, 受到了国际高度评价. 根据国际上研究的趋势并结合国内的研究进展, 提出了生物固氮研究的发展方向, 建议在联合(内生)固氮菌固氮基因调控及其提供氮素的作用, 根瘤菌与豆科植物共生结瘤固氮的信号传递和分子相互作用, 氮、碳代谢和固氮与光合作用的偶联与共生结瘤固氮中功能基因组学等方面展开积极研究.关键词固氮生物固氮酶基因表达化学模拟微生物与植物相互作用功能基因组空气中约80%的氮气不能被植物直接利用, 只有固氮微生物具有将氮气转化成氨的能力, 人们称为生物固氮. 据联合国粮农组织(FAO)1995年粗略估计, 全球每年由生物固定的氮量已近2 × 106t(相当于4 × 108 t尿素), 约占全球植物需氮量的3/4. 所以, 生物固氮是地球上最大规模的天然氮肥工厂. 但是, 迄今为止所发现的绝大多数固氮微生物均不能在粮食作物水稻、小麦、玉米以及多种果树、蔬菜上固氮, 即使少数可以的话, 其固氮量也很少, 所以这些植物的高产不得不依赖化学氮肥. 30年后我国人口将达到16亿, 年需粮食6.4 × 108 t, 总计需尿素64 × 108 t. 按此需要, 至少还要新建很多氮肥厂, 投资上千亿元. 一方面, 适量使用化学氮肥可使粮食高产; 另一方面, 生产化学氮肥要大量消耗能源, 加重大气污染和温室效应. 大量施用化肥, 不仅提高农业生产成本, 而且导致水土污染, 影响健康和破坏生态平衡. 对于提高农业产量, 降低化肥用量和农业生产成本, 减少水土污染和疾病, 治理占我国国土面积约27%的荒漠化地区, 发展可持续农业, 生物固氮将起重要作用.研究生物固氮的作用机制有3个目的: (1) 提高固氮效率, 在理论上阐明影响固氮效率的原因, 在生产实际中提出有效措施; (2) 在研究根瘤菌与豆科植物相互作用和共生固氮的基础上, 扩大根瘤菌的宿主范围, 使其能在非豆科植物, 特别是主要粮食作物上固氮, 或将固氮基因转移到非豆科植物上, 实现其自主固氮; (3) 在研究固氮酶结构与功能的基础上, 进一步探讨化学模拟固氮酶作用机制, 发展化学催化理论, 改革目前合成氨工艺, 提供廉价氮肥.生物固氮是生命科学的重大问题之一, 是跨世纪的研究课题. 在当前生命科学的发展中由于基因组学和功能基因组学的建立和高新技术的创新, 又赋予生物固氮研究新的内涵和研究策略, 为实现固氮研究的目标增添了新的动力.本文叙述生物固氮的研究现状和发展, 着重介绍我国的研究概况和取得的成果, 并结合当前生命科学的进展, 展望生物固氮研究的前景.1生物固氮的研究现状当前, 国内外生物固氮研究已进入一个新阶段, 其特点是多学科交叉, 将基础研究和应用前景相结合, 开拓了思路. 当前生物固氮研究正在分子和原子水平上开展, 如: 固氮基因表达的铵阻遏和氧敏感机制; 共生结瘤固氮中植物与微生物相互关系的基因表达和调控; 根瘤菌结瘤因子的结构和生物合成; 根瘤菌及其宿主植物的基因组学、转录组学和蛋白质组学; 固氮酶的结构和功能及其化学模拟; 固氮效率的提高及其在农业和环境保护中的应用等. 这些研究要求生物学、农学、化学和物理学等学科的交叉和结合, 引入新概念和新技术, 综合进行.1.1固氮资源的发掘和应用生物固氮系统分为根瘤菌与豆科植物的共生结瘤固氮系统、联合(包括内生)固氮系统和自生固氮系统. 在共生固氮系统方面, 世界上有豆科植物19700种, 其中已知可以结瘤固氮的有2800多种, 占15%, 而对其共生固氮体系进行过研究的只占0.5%[1]. 不少国家, 特别是美洲和非洲国家, 积极发展种植大豆或其他豆科植物(美国大豆播种面积约占30%), 以发挥生物固氮作用, 减少化学氮肥用量, 取得了明显的经济效益. 在对联合(内生)固氮系统的研究中, 发现禾本科植物甘蔗内有内生固氮菌, 以光合产物为能源进行固氮, 可为甘蔗提供60%的氮素[2]. 这一发现为进一步开发联合(内生)固氮体系提供了突破空间和潜在的应用前景. 在自生固氮体系中, 发现一株嗜热放线菌(Streptomyces thermoautotrophicus)有耐氧的固氮酶[3], 为最终通过转基因手段实现非豆科植物自主固氮提供了可能的突破点.我国传统农业耕作过程中采用豆科植物与其他农作物套种、轮作等手段改良土壤环境, 提高农作物产量. 当前, 苜蓿等豆科植物在我国西部地区的开发及开展生态农业、退耕还林还草过程中正起着不可替代的作用. 我国共有豆科植物约1400多种. 多年来, 我国科学家以豆科植物根瘤菌为重点, 逐步摸清了我国豆科植物的根瘤菌资源, 进行了系统分类, 发现了一些新属、新种[4~7], 并建立了我国最大的根瘤菌数据库. 其中一个重要的发现是, 一种植物在不同的生态环境可与多种根瘤菌共生, 例如我国的大豆可与3个属、7个种的根瘤菌共生固氮, 而一种根瘤菌(如海南根瘤菌Rhizobium hanaese)可从13 属14种豆科植物的根瘤中分离. 其他很多植物与根瘤菌的关系也是如此. 这一研究说明豆科植物与根瘤菌共生的多样性, 修正并发展了传统的根瘤菌“寄主专一性”和植物“互接种族”的概念. 将为利用现代基因组学、功能基因组学和蛋白质组学手段, 探索最佳的结瘤固氮模式和微生物与植物相互作用的机理提供良好的研究材料.1.2生物固氮调控机理及植物与微生物的相互作用用自生固氮菌——克氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae) 研究固氮基因及其表达和调控机理, 有很多开创性工作, 如发现了固氮基因nifC,7个固氮基因nif操纵子连锁以及正调控基因nifA的调节机理及其对温度和氧的敏感性[8~10]. 豆科植物与根瘤菌之间的分子对话机理研究有了重大进展. 在能量供应方面, 弄清了根瘤菌在豆科植物根瘤中依靠植物提供四碳二羧酸糖作碳源用于固氮, 并发现了dctABD基因[11]; 重组根瘤菌已经构建成功, 并用于提高固氮效率[12,13]; 与粮食作物联合固氮的固氮螺菌(Azospirillum brasilence Yu62)的固氮调节机理也已逐步明朗, 为构建铵阻遏条件下也能固氮的基因工程菌株打下了理论基础[14]. 我国科学家在深入研究正调节基因(nifA)的表达及其产物(NifA)活性调节机制的基础上, 构建了不受铵阻遏的组成型表达的nifA质粒, 将其引入大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonica)和阴沟肠杆菌(Enterbacter cloacae)后, 固氮作用不受铵阻遏[15~19]. 用此基因工程菌株接种水稻可以增产[20,21]. 此外, 还开展了固氮基因负调节基因(nifL)的研究[22,23]. 我国分离的巴西固氮螺菌Yu62的固氮酶基因表达和活性双重调节机制研究已经比较清楚, 为构建耐铵泌铵的基因工程菌株和降低玉米化肥用量提供了理论基础[24~26]. 田间实验结果有实效, 施用工程菌株比不施用的对照增产21.1%, 比野生型菌剂增产8.5%. 在相同产量水平下可降低20%的氮肥使用量. 在共生固氮体系结瘤固氮基因表达调节研究的基础上, 发现苜蓿根瘤菌结瘤基因nodD3的表达不受苜蓿类黄酮物质的启动[27,28], 为扩大根瘤菌的宿主范围提供了理论根据. 同时, nodD3基因表达受到两个启动子的控制[29], 第2个启动子可以被NtrC激活[30]; 化学合成了苜蓿根瘤菌的结瘤因子[31]; 根据宿主植物对根瘤菌识别因子和固氮嫌氧机制的研究, 将豆科植物的凝集素基因和血红蛋白基因转入烟草和水稻, 获得基因表达, 为进一步研究非豆科植物和根瘤菌侵染的关系奠定了技术基础[32,33]. 近年来, 我国开展了特有的华癸根瘤菌(Sinorhizobium huakui)结瘤固氮基因表达调节的研究[34,35], 发现了微生物体内碳代谢与固氮及氮代谢的基因表达调节之间存在着偶联关系[36,37]. 这一发现不仅对生物固氮调控有重要意义, 也对基因表达调控基础研究有重要贡献, 为进一步研究光合和固氮之间的偶联提供了理论基础.1.3固氮酶的生物化学特性及其化学模拟国际上已经对固氮酶高分辨率的空间结构进行了研究, 阐明了其活性中心的原子簇FeMoco及其周围蛋白分子的三维结构[38,39]. Schmid等人[40]对棕色固氮菌缺失FeMoco的突变种nifB-Av1的钼铁蛋白组分做了晶体衍射结构分析, 发现4个亚单位中的1个构象发生了较大变化, 存在一个带正电的漏斗状(funnel)结构, 它足够容纳带负电的FeMoco的插入, 成为具有固氮功能的钼铁蛋白组分. 与此同时, 化学模拟固氮酶在温和条件下合成氨有了很大进展[41]. 在这个领域里我国也做了大量非常出色的工作: 固氮酶催化HD的形成绝对依赖于氮[42]; 在固氮酶催化还原N2的放氢机制中, 率先提出了双位点放H2模式, 对了解固氮酶催化机制有所发展[43]. 美国1992年用X光衍射确定固氮酶活性中心原子簇是由MoS3Fe和FeS3Fe3两个缺口的立方烷型簇合物组成[38], 通过3个非蛋白配体S桥联而成为一个笼(其顶端分别是Fe和Mo). 其实在此之前, 我国就已经合成了这两个簇合物[44]; 根据配位催化原理和化学探针思路, 提出活性中心原子簇笼应是活口的, N2还原成氨和质子还原成H2都是在笼内进行, 提出用于还原底物有两条质子通道的设想[45~47]. 这些进展对指导合成高效催化剂, 实现在温和条件下固氮有重要意义.1.4我国生物固氮研究成果的国际认可和曾经面临的困境“生物固氮”成为科学定义并开始大力研究已有114年的历史. 我国自1937年开始生物固氮研究, 已有65年历史. 20世纪70年代生物固氮研究在生物化学和分子遗传学等方面取得突破后, 我国也取得了一系列重要成果, 在国际上占有一定的地位, 在某些方面还具有重要影响. 因此, 国际生物固氮研究委员会主席W. Newton曾多次建议在中国召开国际生物固氮研究大会, 经研究决定2003年在北京召开第14届国际生物固氮大会.我国生物固氮研究的道路曲曲折折, 曾经有两种错误认识: 一是受到假冒伪劣生物固氮肥料的宣传的干扰, 认为生物固氮问题已经解决; 二是对国际和国内生物固氮研究的突破性进展了解不够, 认为难度大, 进展甚微, 国内经多年研究也未出成果. 两者的结果使我国的生物固氮研究面临严重困境.为防止困境再现, 经我国有关决策者和研究人员的共同努力, 恢复了固氮研究应有的地位. 这就为巩固研究成果, 继续发展, 不失时机地迎接生物固氮的重大突破的新时代的到来, 并把生物固氮研究中与生命科学其他学科相关的重大科学问题提高到一个新水平, 使其进一步为我国农业可持续发展做出重要贡献.2生物固氮研究的展望根据国际上生物固氮研究的发展和我国的具体情况, 我国生物固氮研究应着重下列几个方面.2.1联合(内生)固氮菌固氮基因调控及其在提供氮素中的作用联合或内生固氮菌大多数是自生固氮菌, 其固氮作用大小极易受外界环境因素(氧、铵、温度等)的制约. 在自然状态下有些固氮菌与植物有着松散的联合, 或进入植物成为内生菌, 这就为进一步利用这些固氮生物给植物提供氮素创造了更多的机会. 在研究固氮基因表达和调控的基础上, 有针对地进行固氮菌的遗传改造, 构建高效的固氮菌株, 以提高固氮效率, 减少化肥施用, 为作物提供更多的固氮量[13,14,20,21].2.2根瘤菌与豆科植物共生结瘤固氮的信号传递和分子相互作用豆科植物共生固氮由于其固氮作用的高效率, 始终是生物固氮研究的焦点之一. 根瘤菌与豆科植物之间的信号传递、相互识别、基因的顺序性表达和调节对根瘤的形成、发育和固氮作用的大小等有着错综复杂的联系. 苜蓿根瘤菌和苜蓿的共生结瘤固氮是共生固氮的模式系统, 研究最为集中, 但仍然有很长的路要走. 如果考虑到地区不同和自然环境的差异, 即使是同一模式系统也会有不同的差异表现, 更何况还有特异的共生固氮系统? 在分子水平上阐明两者相互作用的机理, 一方面旨在提高共生固氮的效率, 另一方面还可以为扩大根瘤菌宿主范围, 为实现粮食作物共生固氮提供理论依据和技术措施.2.3氮、碳代谢和固氮与光合作用的偶联氮、碳代谢是一切生物最基本的代谢作用, 而且是相互联系的. 固氮作用需要消耗作为能源的碳源. 植物共生固氮中固氮作用的能源直接来自光合作用. 固氮生物有选择性地利用碳源, 其中以四碳二羧酸糖的利用较好. 固氮生物在氮、碳代谢的基因表达中, 分别利用RNA聚合酶的σ54和σ70. 碳代谢调控蛋白CRP(carbon receptor protein)与结合在启动子上的σ54相互作用, 使依赖σ54的dctA和glnAp2等基因启动子的表达受到抑制[36,37], 其结果就在分子水平上将氮、碳代谢联系起来. 最近研究证明, CRP-cAMP同样抑制肺炎克氏杆菌nif基因的表达, 而且其抑制作用的大小与启动子上有无潜在的CRP结合位点直接相关[48,49].豆科植物是C3植物, 固氮作用需消耗光合作用能量的10%, 因此减产达5%, 固氮不增产[50]. 虽然在大豆根瘤菌中增加nifA正调控基因的拷贝数, 可以提高固氮作用, 增加产量[51,52], 但仍然需要植物提高光合作用效率, 才能满足既不施或少施氮肥, 又能达到增产的目的. 如何提高豆科植物的光合作用效率, 是光合作用和固氮作用的共同研究问题. 现有报道表明, 通过诱变获得高光效的大豆品种, 产量可提高30%左右[53]. 这一品种将为固氮和光合偶联研究提供了材料. 另一途径是通过转基因技术将C4植物的基因转入豆科植物, 使其变成C4植物. 这种可能性是存在的, 最近已经将玉米光合作用C4途径的基因转入水稻, 获得高光效增产幅度较大的转基因水稻[54~56], 这为获得C4豆科植物提供了借鉴.2.4共生固氮中包括蛋白质组学在内的功能基因组学研究共生固氮功能基因组学和蛋白质组学研究包括根瘤菌和宿主植物两个方面. 功能基因组学研究的前提是对目的生物的基因组进行全序列分析. 目前国际上已经对苜蓿根瘤菌基因组进行了全序列分析[57], 接着是大豆根瘤菌和百脉根根瘤菌(Rhizobium loti)基因组. 在宿主植物方面已经启动了对苜蓿Medicago sativa Lin)、大豆(Glycine max Lin)和百脉根(Lotus corniculatu)基因组序列的分析[58~60]. 这些研究成果将为固氮功能基因组和蛋白质组学研究奠定基础和建立技术平台. 目前, 固氮功能基因组和蛋白质组学已经陆续有所报道[61~63]. 固氮资源生物多样性研究表明, 不同根瘤菌可与同一豆科植物相互作用结瘤固氮, 但它们之间的结瘤固氮效率却大不相同. 同样, 同一根瘤菌可与不同属的豆科植物结瘤固氮[64]. 这一结果为开展共生固氮功能基因组学和蛋白质组学研究奠定了基础. 可以充分利用公布的苜蓿根瘤菌基因组序列, 通过RNA 和蛋白质差异显示法和微阵列法, 对不同苜蓿根瘤菌基因组及其突变株在共生条件下进行功能比较, 对不同根瘤菌在同一豆科植物结瘤的不同根瘤素基因表达进行比较, 将可大大推进共生结瘤固氮中微生物与植物相互作用机理的研究. 在此基础上, 还可寻找非豆科植物, 特别是禾本科植物中是否有以及有多少类似于豆科植物的根瘤素存在, 从而最终为非豆科植物的共生固氮和自主固氮提供策略和技术路线. 无疑, 共生固氮功能基因组和蛋白质组学研究将具有更为重大的科学意义和潜在的实际意义.致谢感谢沈善炯、李季伦和朱家壁教授对文稿的建议和修改及林敏、陈文新、周朝晖等教授所提供资料. 本工作为国家重点基础研究发展规划资助项目(批准号: 2001CB108904).参考文献1 Denarie J, Roche P. 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生物固氮研究报告
标题：生物固氮研究报告
摘要：
本研究报告探讨了生物固氮的过程、机制以及其在农业生产中的应用。

生物固氮是指一种过程，通过该过程，某些生物能够将大气中的氮气转化为可供植物利用的形式，从而满足植物的氮营养需求。

这一过程对于生态系统的氮循环具有重要意义，也对农业生产的可持续发展起到了至关重要的作用。

研究方法：
本研究使用田间实验方法，选择了几种生物固氮相关的微生物和植物进行观察和研究。

通过收集土壤样本和植物根系样本，并进行实验室分析，以评估这些微生物在土壤中固氮的能力以及它们与植物的共生关系。

同时，也进行了田间试验，观察不同固氮微生物对作物生长和氮肥利用的影响。

研究结果：
研究表明，生物固氮的能力在不同微生物和植物之间存在差异。

一些固氮微生物，如根瘤菌和蓝绿藻，能够与植物建立共生关系，并通过将氮气固定为植物可利用的铵态氮来提供植物所需的氮营养。

这对于减少对化学氮肥的依赖，提高土壤质量和农产品质量具有重大意义。

此外，研究还发现，通过优化固氮微生物的应用方式和施肥管理措施，能够进一步提高生物固氮的效果。

结论：
生物固氮是一种可行的方法，用于实现农业生产的可持续发展。

通过建立良好的共生关系，利用固氮微生物将大气中的氮转化为植物可利用的形式，可以减少对化学氮肥的需求，减少对环境的负面影响，提高土壤质量，并提高农产品的产量和品质。

未来的研究应进一步深入了解生物固氮的机制，并探索更有效的固氮微生物应用方式。

微生物固氮机制的研究现状和新进展微生物的固氮能力是构建土壤氮素循环的关键，也是维持生态平衡的重要组成部分。

微生物通过各自的固氮途径将空气中的氮气转化成化学物质，为植物提供必要的营养素。

随着科技的不断进步，对微生物固氮机制的研究也取得了一些重要的发现和进展。

近年来，单细胞生物氮素转化机制的研究成为了固氮领域的热点。

以著名的单细胞固氮菌为例，其通过形成分裂小体的方式实现了分子固氮。

该过程过程中，由ATP酶驱动，集中在夹层腔中的谷氨酸合酶将加入氢原子的氢气与植物活塞内的电荷负载原子氮相结合，形成氨基基团后输出。

而其他的单细胞生物固氮菌则采用了不同的机制。

在多细胞生物领域，共生关系的研究成为了新的热点。

一些微生物通过与植物的共生关系，在植物根际创建适宜的微环境，为氮固定提供优越的条件。

同时，这些微生物还可通过其他途径来获得生存空间、水、光和其他营养物质等。

此外，一些研究也表明固氮能力可以通过基因改造来提高。

科学家通过人工合成新的代谢途径和调节代谢路径，成功地创建了一些高效型固氮细菌，使微生物的固氮能力得到了大大提升。

这项技术的应用在很大程度上为农业生产和生态保护带来了新的机遇。

但是同时，我们也不能忽视微生物固氮机制研究所面临的众多挑战。

除了单细胞生物和共生关系的研究，还有很多与微生物固氮相关的基因、生理和环境条件等等都需要深入探讨，以更好地理解微生物固氮机制的本质。

迄今为止，微生物固氮机制的研究没有结束，而是不断在进化和创新中发展。

对微生物固氮机制的深入探索不仅能够为理解生态系统提供基础知识，同时还将有益于开发新的农业技术和环境保护方法。

中国生物固氮研究现状和展望沈世华荆玉祥*(中国科学院植物研究所中国科学院光合作用和环境分子生理学重点实验室, 北京100093. *联系人, E-mail: yxjing@ )摘要生物固氮是生命科学中的重大基础研究课题之一, 它在生产实际中发挥着重要作用: 为植物特别是粮食作物提供氮素、提高产量、降低化肥用量和生产成本、减少水土污染和疾病、防治土地荒漠化、建立生态平衡和促进农业可持续发展. 本文在介绍国际生物固氮研究进展的同时, 着重叙述了生物固氮研究取得的重大进展和成果: 收集了根瘤菌资源, 建立了最大的数据库, 修正和发展了国际上对根瘤菌的分类; 发现了固氮基因, 证实了克氏杆菌固氮基因操纵子的连锁性及正调控基因的调节机制和对氧、温度的敏感性; 发现苜蓿根瘤菌结瘤调控基因nodD3的产物对结瘤基因表达的启动不受宿主类黄酮的作用; 发现苜蓿根瘤菌的碳利用基因和固氮生物氮代射和碳代谢基因表达及其调节的偶联作用; 化学合成了根瘤菌的结瘤因子; 在固氮基因表达调节基础上, 构建了固氮基因工程菌株, 并在生产中得到应用; 提出了化学模拟固氮酶的结构和功能, 固氮酶活性中心的模型和合成了模型化合物, 受到了国际高度评价. 根据国际上研究的趋势并结合国内的研究进展, 提出了生物固氮研究的发展方向, 建议在联合(内生)固氮菌固氮基因调控及其提供氮素的作用, 根瘤菌与豆科植物共生结瘤固氮的信号传递和分子相互作用, 氮、碳代谢和固氮与光合作用的偶联与共生结瘤固氮中功能基因组学等方面展开积极研究.关键词固氮生物固氮酶基因表达化学模拟微生物与植物相互作用功能基因组空气中约80%的氮气不能被植物直接利用, 只有固氮微生物具有将氮气转化成氨的能力, 人们称为生物固氮. 据联合国粮农组织(FAO)1995年粗略估计, 全球每年由生物固定的氮量已近2 × 106t(相当于4 × 108 t尿素), 约占全球植物需氮量的3/4. 所以, 生物固氮是地球上最大规模的天然氮肥工厂. 但是, 迄今为止所发现的绝大多数固氮微生物均不能在粮食作物水稻、小麦、玉米以及多种果树、蔬菜上固氮, 即使少数可以的话, 其固氮量也很少, 所以这些植物的高产不得不依赖化学氮肥. 30年后我国人口将达到16亿, 年需粮食6.4 × 108 t, 总计需尿素64 × 108 t. 按此需要, 至少还要新建很多氮肥厂, 投资上千亿元. 一方面, 适量使用化学氮肥可使粮食高产; 另一方面, 生产化学氮肥要大量消耗能源, 加重大气污染和温室效应. 大量施用化肥, 不仅提高农业生产成本, 而且导致水土污染, 影响健康和破坏生态平衡. 对于提高农业产量, 降低化肥用量和农业生产成本, 减少水土污染和疾病, 治理占我国国土面积约27%的荒漠化地区, 发展可持续农业, 生物固氮将起重要作用.研究生物固氮的作用机制有3个目的: (1) 提高固氮效率, 在理论上阐明影响固氮效率的原因, 在生产实际中提出有效措施; (2) 在研究根瘤菌与豆科植物相互作用和共生固氮的基础上, 扩大根瘤菌的宿主范围, 使其能在非豆科植物, 特别是主要粮食作物上固氮, 或将固氮基因转移到非豆科植物上, 实现其自主固氮; (3) 在研究固氮酶结构与功能的基础上, 进一步探讨化学模拟固氮酶作用机制, 发展化学催化理论, 改革目前合成氨工艺, 提供廉价氮肥.生物固氮是生命科学的重大问题之一, 是跨世纪的研究课题. 在当前生命科学的发展中由于基因组学和功能基因组学的建立和高新技术的创新, 又赋予生物固氮研究新的内涵和研究策略, 为实现固氮研究的目标增添了新的动力.本文叙述生物固氮的研究现状和发展, 着重介绍我国的研究概况和取得的成果, 并结合当前生命科学的进展, 展望生物固氮研究的前景.1生物固氮的研究现状当前, 国内外生物固氮研究已进入一个新阶段, 其特点是多学科交叉, 将基础研究和应用前景相结合, 开拓了思路. 当前生物固氮研究正在分子和原子水平上开展, 如: 固氮基因表达的铵阻遏和氧敏感机制; 共生结瘤固氮中植物与微生物相互关系的基因表达和调控; 根瘤菌结瘤因子的结构和生物合成; 根瘤菌及其宿主植物的基因组学、转录组学和蛋白质组学; 固氮酶的结构和功能及其化学模拟; 固氮效率的提高及其在农业和环境保护中的应用等. 这些研究要求生物学、农学、化学和物理学等学科的交叉和结合, 引入新概念和新技术, 综合进行.1.1固氮资源的发掘和应用生物固氮系统分为根瘤菌与豆科植物的共生结瘤固氮系统、联合(包括内生)固氮系统和自生固氮系统. 在共生固氮系统方面, 世界上有豆科植物19700种, 其中已知可以结瘤固氮的有2800多种, 占15%, 而对其共生固氮体系进行过研究的只占0.5%[1]. 不少国家, 特别是美洲和非洲国家, 积极发展种植大豆或其他豆科植物(美国大豆播种面积约占30%), 以发挥生物固氮作用, 减少化学氮肥用量, 取得了明显的经济效益. 在对联合(内生)固氮系统的研究中, 发现禾本科植物甘蔗内有内生固氮菌, 以光合产物为能源进行固氮, 可为甘蔗提供60%的氮素[2]. 这一发现为进一步开发联合(内生)固氮体系提供了突破空间和潜在的应用前景. 在自生固氮体系中, 发现一株嗜热放线菌(Streptomyces thermoautotrophicus)有耐氧的固氮酶[3], 为最终通过转基因手段实现非豆科植物自主固氮提供了可能的突破点.我国传统农业耕作过程中采用豆科植物与其他农作物套种、轮作等手段改良土壤环境, 提高农作物产量. 当前, 苜蓿等豆科植物在我国西部地区的开发及开展生态农业、退耕还林还草过程中正起着不可替代的作用. 我国共有豆科植物约1400多种. 多年来, 我国科学家以豆科植物根瘤菌为重点, 逐步摸清了我国豆科植物的根瘤菌资源, 进行了系统分类, 发现了一些新属、新种[4~7], 并建立了我国最大的根瘤菌数据库. 其中一个重要的发现是, 一种植物在不同的生态环境可与多种根瘤菌共生, 例如我国的大豆可与3个属、7个种的根瘤菌共生固氮, 而一种根瘤菌(如海南根瘤菌Rhizobium hanaese)可从13 属14种豆科植物的根瘤中分离. 其他很多植物与根瘤菌的关系也是如此. 这一研究说明豆科植物与根瘤菌共生的多样性, 修正并发展了传统的根瘤菌“寄主专一性”和植物“互接种族”的概念. 将为利用现代基因组学、功能基因组学和蛋白质组学手段, 探索最佳的结瘤固氮模式和微生物与植物相互作用的机理提供良好的研究材料.1.2生物固氮调控机理及植物与微生物的相互作用用自生固氮菌——克氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae) 研究固氮基因及其表达和调控机理, 有很多开创性工作, 如发现了固氮基因nifC,7个固氮基因nif操纵子连锁以及正调控基因nifA的调节机理及其对温度和氧的敏感性[8~10]. 豆科植物与根瘤菌之间的分子对话机理研究有了重大进展. 在能量供应方面, 弄清了根瘤菌在豆科植物根瘤中依靠植物提供四碳二羧酸糖作碳源用于固氮, 并发现了dctABD基因[11]; 重组根瘤菌已经构建成功, 并用于提高固氮效率[12,13]; 与粮食作物联合固氮的固氮螺菌(Azospirillum brasilence Yu62)的固氮调节机理也已逐步明朗, 为构建铵阻遏条件下也能固氮的基因工程菌株打下了理论基础[14]. 我国科学家在深入研究正调节基因(nifA)的表达及其产物(NifA)活性调节机制的基础上, 构建了不受铵阻遏的组成型表达的nifA质粒, 将其引入大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonica)和阴沟肠杆菌(Enterbacter cloacae)后, 固氮作用不受铵阻遏[15~19]. 用此基因工程菌株接种水稻可以增产[20,21]. 此外, 还开展了固氮基因负调节基因(nifL)的研究[22,23]. 我国分离的巴西固氮螺菌Yu62的固氮酶基因表达和活性双重调节机制研究已经比较清楚, 为构建耐铵泌铵的基因工程菌株和降低玉米化肥用量提供了理论基础[24~26]. 田间实验结果有实效, 施用工程菌株比不施用的对照增产21.1%, 比野生型菌剂增产8.5%. 在相同产量水平下可降低20%的氮肥使用量. 在共生固氮体系结瘤固氮基因表达调节研究的基础上, 发现苜蓿根瘤菌结瘤基因nodD3的表达不受苜蓿类黄酮物质的启动[27,28], 为扩大根瘤菌的宿主范围提供了理论根据. 同时, nodD3基因表达受到两个启动子的控制[29], 第2个启动子可以被NtrC激活[30]; 化学合成了苜蓿根瘤菌的结瘤因子[31]; 根据宿主植物对根瘤菌识别因子和固氮嫌氧机制的研究, 将豆科植物的凝集素基因和血红蛋白基因转入烟草和水稻, 获得基因表达, 为进一步研究非豆科植物和根瘤菌侵染的关系奠定了技术基础[32,33]. 近年来, 我国开展了特有的华癸根瘤菌(Sinorhizobium huakui)结瘤固氮基因表达调节的研究[34,35], 发现了微生物体内碳代谢与固氮及氮代谢的基因表达调节之间存在着偶联关系[36,37]. 这一发现不仅对生物固氮调控有重要意义, 也对基因表达调控基础研究有重要贡献, 为进一步研究光合和固氮之间的偶联提供了理论基础.1.3固氮酶的生物化学特性及其化学模拟国际上已经对固氮酶高分辨率的空间结构进行了研究, 阐明了其活性中心的原子簇FeMoco及其周围蛋白分子的三维结构[38,39]. Schmid等人[40]对棕色固氮菌缺失FeMoco的突变种nifB-Av1的钼铁蛋白组分做了晶体衍射结构分析, 发现4个亚单位中的1个构象发生了较大变化, 存在一个带正电的漏斗状(funnel)结构, 它足够容纳带负电的FeMoco的插入, 成为具有固氮功能的钼铁蛋白组分. 与此同时, 化学模拟固氮酶在温和条件下合成氨有了很大进展[41]. 在这个领域里我国也做了大量非常出色的工作: 固氮酶催化HD的形成绝对依赖于氮[42]; 在固氮酶催化还原N2的放氢机制中, 率先提出了双位点放H2模式, 对了解固氮酶催化机制有所发展[43]. 美国1992年用X光衍射确定固氮酶活性中心原子簇是由MoS3Fe和FeS3Fe3两个缺口的立方烷型簇合物组成[38], 通过3个非蛋白配体S桥联而成为一个笼(其顶端分别是Fe和Mo). 其实在此之前, 我国就已经合成了这两个簇合物[44]; 根据配位催化原理和化学探针思路, 提出活性中心原子簇笼应是活口的, N2还原成氨和质子还原成H2都是在笼内进行, 提出用于还原底物有两条质子通道的设想[45~47]. 这些进展对指导合成高效催化剂, 实现在温和条件下固氮有重要意义.1.4我国生物固氮研究成果的国际认可和曾经面临的困境“生物固氮”成为科学定义并开始大力研究已有114年的历史. 我国自1937年开始生物固氮研究, 已有65年历史. 20世纪70年代生物固氮研究在生物化学和分子遗传学等方面取得突破后, 我国也取得了一系列重要成果, 在国际上占有一定的地位, 在某些方面还具有重要影响. 因此, 国际生物固氮研究委员会主席W. Newton曾多次建议在中国召开国际生物固氮研究大会, 经研究决定2003年在北京召开第14届国际生物固氮大会.我国生物固氮研究的道路曲曲折折, 曾经有两种错误认识: 一是受到假冒伪劣生物固氮肥料的宣传的干扰, 认为生物固氮问题已经解决; 二是对国际和国内生物固氮研究的突破性进展了解不够, 认为难度大, 进展甚微, 国内经多年研究也未出成果. 两者的结果使我国的生物固氮研究面临严重困境.为防止困境再现, 经我国有关决策者和研究人员的共同努力, 恢复了固氮研究应有的地位. 这就为巩固研究成果, 继续发展, 不失时机地迎接生物固氮的重大突破的新时代的到来, 并把生物固氮研究中与生命科学其他学科相关的重大科学问题提高到一个新水平, 使其进一步为我国农业可持续发展做出重要贡献.2生物固氮研究的展望根据国际上生物固氮研究的发展和我国的具体情况, 我国生物固氮研究应着重下列几个方面.2.1联合(内生)固氮菌固氮基因调控及其在提供氮素中的作用联合或内生固氮菌大多数是自生固氮菌, 其固氮作用大小极易受外界环境因素(氧、铵、温度等)的制约. 在自然状态下有些固氮菌与植物有着松散的联合, 或进入植物成为内生菌, 这就为进一步利用这些固氮生物给植物提供氮素创造了更多的机会. 在研究固氮基因表达和调控的基础上, 有针对地进行固氮菌的遗传改造, 构建高效的固氮菌株, 以提高固氮效率, 减少化肥施用, 为作物提供更多的固氮量[13,14,20,21].2.2根瘤菌与豆科植物共生结瘤固氮的信号传递和分子相互作用豆科植物共生固氮由于其固氮作用的高效率, 始终是生物固氮研究的焦点之一. 根瘤菌与豆科植物之间的信号传递、相互识别、基因的顺序性表达和调节对根瘤的形成、发育和固氮作用的大小等有着错综复杂的联系. 苜蓿根瘤菌和苜蓿的共生结瘤固氮是共生固氮的模式系统, 研究最为集中, 但仍然有很长的路要走. 如果考虑到地区不同和自然环境的差异, 即使是同一模式系统也会有不同的差异表现, 更何况还有特异的共生固氮系统? 在分子水平上阐明两者相互作用的机理, 一方面旨在提高共生固氮的效率, 另一方面还可以为扩大根瘤菌宿主范围, 为实现粮食作物共生固氮提供理论依据和技术措施.2.3氮、碳代谢和固氮与光合作用的偶联氮、碳代谢是一切生物最基本的代谢作用, 而且是相互联系的. 固氮作用需要消耗作为能源的碳源. 植物共生固氮中固氮作用的能源直接来自光合作用. 固氮生物有选择性地利用碳源, 其中以四碳二羧酸糖的利用较好. 固氮生物在氮、碳代谢的基因表达中, 分别利用RNA聚合酶的σ54和σ70. 碳代谢调控蛋白CRP(carbon receptor protein)与结合在启动子上的σ54相互作用, 使依赖σ54的dctA和glnAp2等基因启动子的表达受到抑制[36,37], 其结果就在分子水平上将氮、碳代谢联系起来. 最近研究证明, CRP-cAMP同样抑制肺炎克氏杆菌nif基因的表达, 而且其抑制作用的大小与启动子上有无潜在的CRP结合位点直接相关[48,49].豆科植物是C3植物, 固氮作用需消耗光合作用能量的10%, 因此减产达5%, 固氮不增产[50]. 虽然在大豆根瘤菌中增加nifA正调控基因的拷贝数, 可以提高固氮作用, 增加产量[51,52], 但仍然需要植物提高光合作用效率, 才能满足既不施或少施氮肥, 又能达到增产的目的. 如何提高豆科植物的光合作用效率, 是光合作用和固氮作用的共同研究问题. 现有报道表明, 通过诱变获得高光效的大豆品种, 产量可提高30%左右[53]. 这一品种将为固氮和光合偶联研究提供了材料. 另一途径是通过转基因技术将C4植物的基因转入豆科植物, 使其变成C4植物. 这种可能性是存在的, 最近已经将玉米光合作用C4途径的基因转入水稻, 获得高光效增产幅度较大的转基因水稻[54~56], 这为获得C4豆科植物提供了借鉴.2.4共生固氮中包括蛋白质组学在内的功能基因组学研究共生固氮功能基因组学和蛋白质组学研究包括根瘤菌和宿主植物两个方面. 功能基因组学研究的前提是对目的生物的基因组进行全序列分析. 目前国际上已经对苜蓿根瘤菌基因组进行了全序列分析[57], 接着是大豆根瘤菌和百脉根根瘤菌(Rhizobium loti)基因组. 在宿主植物方面已经启动了对苜蓿Medicago sativa Lin)、大豆(Glycine max Lin)和百脉根(Lotus corniculatu)基因组序列的分析[58~60]. 这些研究成果将为固氮功能基因组和蛋白质组学研究奠定基础和建立技术平台. 目前, 固氮功能基因组和蛋白质组学已经陆续有所报道[61~63]. 固氮资源生物多样性研究表明, 不同根瘤菌可与同一豆科植物相互作用结瘤固氮, 但它们之间的结瘤固氮效率却大不相同. 同样, 同一根瘤菌可与不同属的豆科植物结瘤固氮[64]. 这一结果为开展共生固氮功能基因组学和蛋白质组学研究奠定了基础. 可以充分利用公布的苜蓿根瘤菌基因组序列, 通过RNA 和蛋白质差异显示法和微阵列法, 对不同苜蓿根瘤菌基因组及其突变株在共生条件下进行功能比较, 对不同根瘤菌在同一豆科植物结瘤的不同根瘤素基因表达进行比较, 将可大大推进共生结瘤固氮中微生物与植物相互作用机理的研究. 在此基础上, 还可寻找非豆科植物, 特别是禾本科植物中是否有以及有多少类似于豆科植物的根瘤素存在, 从而最终为非豆科植物的共生固氮和自主固氮提供策略和技术路线. 无疑, 共生固氮功能基因组和蛋白质组学研究将具有更为重大的科学意义和潜在的实际意义.致谢感谢沈善炯、李季伦和朱家壁教授对文稿的建议和修改及林敏、陈文新、周朝晖等教授所提供资料. 本工作为国家重点基础研究发展规划资助项目(批准号: 2001CB108904).参考文献1 Denarie J, Roche P. 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生物固氮的研究进展一、本文概述生物固氮，指的是生物体（特别是某些微生物）在无氧或低氧条件下，将大气中的氮气（N₂）转化为氨（NH₃）或其他含氮化合物的过程。

这一过程对于全球氮循环和生物圈的氮素供应具有至关重要的作用。

本文旨在概述生物固氮的研究进展，包括固氮微生物的种类与特性、固氮机制、固氮效率的提高方法，以及生物固氮在农业、环保和工业生产等领域的应用前景。

我们将重点介绍近年来在分子生物学、基因工程和生物技术等方面的新发现和新进展，以期为推动生物固氮的深入研究和实际应用提供参考。

二、生物固氮的微生物学基础生物固氮，又称生物氮固定，是指某些微生物在常温常压下，将大气中的氮气（N₂）转化为氨（NH₃）或其它含氮化合物的过程。

这一生物过程在地球氮循环中起着至关重要的作用，为许多生态系统和农作物提供了必要的氮源。

生物固氮的微生物主要包括两大类：自生固氮菌和共生固氮菌。

自生固氮菌，如圆褐固氮菌，能够在无植物存在的情况下独立进行固氮作用。

而共生固氮菌，如根瘤菌，必须与植物形成共生关系，在植物根部形成根瘤结构，才能有效固氮。

固氮过程的核心是固氮酶的作用。

固氮酶是一种由铁蛋白和钼铁蛋白组成的复合酶，能够在ATP的供能下，将N₂还原为NH₃。

这一过程中，铁蛋白起到传递电子的作用，而钼铁蛋白则是固氮反应的催化中心。

固氮微生物具有独特的生理生态特性，以适应其在各种环境条件下的固氮生活。

例如，它们能够分泌多种胞外酶，分解有机物质以获取能量和营养；同时，它们还能够形成特殊的细胞结构，如根瘤，以提高固氮效率。

固氮效率受到多种因素的影响，包括环境因素（如温度、湿度、光照等）、土壤条件（如pH值、有机质含量等）以及微生物自身的遗传特性。

因此，在农业生产中，通过调控这些因素，可以有效提高生物固氮的效率和效果。

随着分子生物学和基因工程技术的快速发展，对固氮微生物的遗传机制和固氮酶的作用机制有了更深入的了解。

这为通过基因工程手段改良固氮微生物、提高其固氮效率提供了可能。

生物固氮及其发展前景摘要：本论文主要介绍生物固氮概念、固氮微生物及其种类和生物固氮发展前景。

关键词：生物固氮固氮微生物固氮生化机制生物固氮展望引言：生物固氮是一个具有重大理论意义和实用价值的生化过程。

生物固氮反应是一种及其温和及零污染排放的生化反应，它比人类发明的化学固氮有这无比的优越性，因后者需要消耗大量的石油原料和特殊的催化剂，并须要在高温（~300℃）、高压（~300个大气压）下进行。

此外，若不合理地使用氮肥，还会降低农产品的质量，破坏土壤结构和降低肥力，以及造成坏境污染（如湖泊的水华和海洋的赤潮）等恶果。

我国在近半个世纪当中，化肥产量猛增近6000倍，其有害影响已不断出现。

因此，我们应深刻认识到，只有深入研究、开发和利用固氮微生物，才能更好的发展生态农业和达到土地可持续利用的战略目标。

如果把光合作用旱作是地球上最重要的生化反应，则生物固氮作用便是地球上仅次于光合作用的生物化学反应，因为它为整个生物圈中一切生物的生存和繁荣发展提供了不可或缺和可持续供应的还原态氮化物的源泉。

内容：⒈生物固氮定义：指大气中的分子氮通过微生物固氮酶的催化而还原成氨的过程，生物界中只有原核生物才具有固氮能力。

⒉固氮微生物的种类⒉1 自生固氮菌⒉⒈1好氧：化能异养、化能自养、光能自养⒉⒈2兼性厌氧：化能异养、光能异样⒉⒈3厌氧：化能异养、光能自养⒉2 共生固氮菌⒉⒉1根瘤：豆科植物、非豆科被子植物⒉⒉2植物：地衣、满江红⒉3 联合固氮菌⒉⒊1根际（热带、温带）⒉⒊2叶面⒉⒊3动物肠道⒊固氮的生化机制⒊1生物固氮反应的6要素⒊⒈1ATP的供应由于N≡N分子中存在3个共价键，故要把这种极端的分子打开就得花费巨大能量。

固氮过程中把N2还原成2NH3时消耗的大量ATP(N2:ATP=1:(18~24)是由呼吸、厌氧呼吸、发酵或光合磷酸化作用提供的。

⒊⒈2还原力[H]及其传递载体固氮反应中所需大量的还原力（N2︰[H]=1︰8)必须以NAD（Ｐ）Ｈ＋Ｈ﹢的形成提供。

非豆科作物生物固氮研究进展及前景
丁武
【期刊名称】《中国农学通报》
【年(卷),期】1991(7)5
【摘要】非豆科作物生物固氮的研究是生物固氮研究中的一个新兴领域,前景迷人。

固氮基因工程和细胞工程的成就对根瘤菌只能在豆科植物根瘤中才能固氮的传统观点提出了挑战。

本文综述了非豆科作物生物固氮研究的若干进展并对其前景进行了展望。

【总页数】4页(P29-32)
【关键词】非豆科作物;生物固氮;发展
【作者】丁武
【作者单位】福建省农科院土肥所
【正文语种】中文
【中图分类】S188
【相关文献】
1.非豆科作物套种时间对烤烟产量和质量的影响 [J], 夏海乾;张恒;王晶君;孟林;石
俊雄
2.非共生生物固氮的重要作用和研究进展 [J], 新楠;连秀芬;樊明寿
3.豆科作物与禾本科作物轮作研究进展及前景 [J], 曾昭海
4.非豆科作物套种时间对减少烤烟后期氮素吸收量的研究 [J], 孙健;李志宏;张云贵;
夏昊
5.生物固氮研究的前景 [J], 黄群策;陈启锋;李志真
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生物固氮测定方法研究进展2016051848 黄鹏摘要:对生物固氮测定的方法乙炔还原法(A R A)、15N同位素稀释法(I D)、、非同位素法、全氮差值法和酰脲估测法进行综述,并评述了其引起误差的因素和测定结果的准确性。

关键词:生物固氮;固氮量;测定;方法目前,固氮测定技术对于生物固氮研究是十分重要的。

随着研究的深入,固氮测定技术也不断地向准确、可靠、操作简便的方向发展。

生物固氮测定方法主要有乙炔还原法、、15N同位素稀释法、非同位素法、全氮差值法和酰脲估测法等。

为便于更好研究生物固氮, 本文主要介绍常用的几种测定方法以及它们的优缺点,以供参考。

1乙炔还原法始于20世纪60 年代, 目前被广泛应用,根据固氮酶具有还原分子氮或利用其他底物的能力,使乙炔还原为乙烯,作为固氮的间接测定。

从植物根际分离的纯培养物分别接种于盛有无氮半固体培养基的血清小瓶中,置于28 ～30 ℃培养箱中培养48 h ,将血清小瓶瓶盖在无菌条件下换成橡胶塞,用无菌注射器抽出10 %的气体, 每瓶注1 mL C2H4,,再置于28 ～30 ℃下培养24 ～48 h。

用无菌注射器从瓶种抽取混合气体0 .2 m L 注入气相色谱仪(GC)进样柱中, 测定C2H4含量。

其中,以不接种菌注有C2H2的血清小瓶为对照, 重复 3 次。

从显示屏上C2H2、C2H4峰值判定有无C2H4的产生以确定其固氮性能, 按下式计算其固氮酶活性大小。

A RA =（实际C2H4峰面积×标准气含量×血清小瓶容积∕（标准气峰面积×进样量×培养时间×样品量）。

主要仪器：SP一02型气相色谱仪和氢离子化鉴定器。

该方法优点是灵敏度高,操作较简单,速度快、费用较低,可快速确认固氮作用的存在与否。

并通过还原乙炔活性的强弱，推算出植物——— 固氮菌联合体的固氮量、适应范围广,可以离体,也可以整株活体连续测定或原位测定。

固氮菌研究现状及前景分析摘要固氮菌所进行的生物固氮作用是土壤中氮素的主要来源，也是固氮微生物参与自然界氮素循环的主要环节，固氮菌主要包括自生固氮菌、共生固氮菌和联合固氮菌，涵盖固氮细菌和固氮蓝细菌两者共59个属。

本文将对固氮菌固氮作用的应用、基因工程育种在固氮菌研究上的应用以及固氮菌的最新研究进展等方面进行展开阐述，并进一步展望固氮菌的前景。

关键词固氮菌基因工程育种应用前景·AbstractBiological nitrogen-fixing is the main source of nitrogen in soil, also is the mainprocess that N-fixing bacteria take part in natural nitrogen cycle. N-fixing bacteriainclude free-living nitrogen fixing bacteria, symbiotic nitrogen fixing bacteria andassociative nitrogen fixing bacteria. This article will introduce the application ofnitrogen bacteria and the perspective of nitrogen fixing bacteria.KeywordNitrogen-fixing bacteria Genetic-engineering Application Perspective 固氮微生物包括自生固氮菌、共生固氮菌以及联合固氮菌三大类型。

对固氮菌的研究在农业生产，增加作物产量以及合成蛋白质等方面有着极其重要的应用。

本文叙述了生物固氮研究取得的重大进展和成果，包括发现了固氮基因，证实了克氏杆菌固氮基因操纵子的连锁性及正调控基因的调节机制和对氧、温度的敏感性；发现根瘤菌结瘤调控基因nodD3的产物对结瘤基因表达的启动不受宿主类黄酮的作用；发现根瘤菌的碳利用基因和固氮生物氮代射和碳代谢基因表达及其调节的偶联作用；在固氮基因表达调节基础上，构建了固氮基因工程菌株，并在生产中得到应用。