第33卷第1期2014年 1月华 中 农 业 大 学 学 报J o u r n a l o fH u a z h o n g A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t yV o l .33 N o .1J a n .2014,1~6收稿日期:2013-05-21基金项目:国家自然科学基金项目(31170084)白亭丽,硕士研究生.研究方向:链霉菌分子生物学.E -m a i l :b a i t i n gl i @g m a i l .c o m 通信作者:陶美凤,博士,研究员.研究方向:链霉菌分子生物学.E -m a i l :t a o _m e i f e n g @s jt u .e d u .c n 变铅青链霉菌高效异源表达宿主SBT5的构建白亭丽1 俞燕飞1 徐 钟1 陶美凤1,21.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,武汉430070;2.上海交通大学微生物代谢国家重点实验室,上海200030摘要 以变铅青链霉菌T K 24为出发菌株,依次敲除钙依赖抗生素(C D A )㊁放线紫红素(A C T )和十一烷基灵菌红素(R E D )这3个内源抗生素的生物合成基因簇,同时在钙依赖抗生素基因簇原位整合了来自棒状链霉菌的全局性调控基因a fs R S c l a ,构建得到变铅青链霉菌菌株S B T 5㊂将来自天蓝色链霉菌的放线紫红素生物合成基因簇导入S B T 5中,接合子产生大量蓝色的放线紫红素,而出发菌株T K 24只产微量蓝色抗生素;S B T 5接合子的A C T 产量也显著高于导入了额外a c t 基因簇拷贝的出发菌株接合子㊂S B T 5菌株次级代谢背景清晰,不产色素类抗生素和抗细菌抗生素,可作为高效宿主用于次级代谢产物基因簇的异源表达和筛选㊂关键词 变铅青链霉菌;异源表达宿主;次级代谢产物;抗生素生物合成基因簇;基因敲除;a fs R S c l a 中图分类号 Q785 文献标识码 A 文章编号 1000-2421(2014)01-0001-06天蓝色链霉菌(S t r e p t o m yc e s c o e l i c o l o r )是链霉菌分化发育和遗传学研究的模式菌株,可以产生色素类抗生素放线紫红素(A C T ,中性及偏碱性下呈蓝色)㊁十一烷基灵菌红素(R E D ,中性及偏碱性下呈红色)以及抗细菌抗生素钙依赖抗生素(C D A ),天蓝色链霉菌也常被作为宿主菌用于次级代谢基因簇的异源表达[1]㊂天蓝色链霉菌对甲基化D N A 具有限制作用,妨碍了它作为宿主的广泛应用㊂变铅青链霉菌(S t r e p t o m yc e s l i v id a n s )是天蓝色链霉菌近缘种,对甲基化D N A 没有限制作用,常被用作单基因或基因簇异源表达的宿主[2]㊂野生型变铅青链霉菌T K 24的基因组含有A C T ㊁R E D 和C D A 这3种抗生素的生物合成基因簇,对外源基因簇的表达筛选可能会造成干扰;这些基因簇只在特定条件下才会表达,表明该菌株合成次级代谢产物的能力较低㊂根据变铅青链霉菌的这些特点,本研究拟敲除这些内源基因簇,同时加入一个全局性调控基因a f s R S ,用以激活次级代谢基因簇,旨在构建适用于次级代谢产物基因簇异源表达和筛选的高效宿主菌㊂1 材料与方法1.1 菌株及质粒大肠杆菌(E s c h e r i c h i ac o l i )D H 5α为克隆宿主[3];大肠杆菌E T 12567/pU Z 8002为大肠杆菌-链霉菌属间接合转移供体菌[4]㊂蕈状芽胞杆菌(B a -c i l l u sm yc o ide s )为钙依赖抗生素(C D A )生物活性测定的指示菌[5]㊂变铅青链霉菌T K 24[6]为野生型链霉菌,出发菌株㊂天蓝色链霉菌K 7为M 145衍生菌株,由徐钟构建(未发表),在其C D A 生物合成基因簇(c d a )的下游有T n 5微型转座子(m i n i -T n 5-a a c (3)Ⅳ)插入,但C D A 的合成不受影响,m i n i -T n 5-a a c (3)Ⅳ序列中含有阿泊拉霉素抗性基因a a c (3)Ⅳ以及大肠杆菌质粒p U C 18的复制子,本研究利用K 7菌株的这些特点克隆c d a 基因簇部分序列,并用于构建c d a 基因置换质粒㊂质粒p S E T 152[7]包含接合转移起始位点o r i T R K 2㊁阿泊拉霉素抗性基因a a c (3)Ⅳ㊁放线菌噬菌体F C 31整合位点a t t P 以及整合酶基因i n t ㊂p MM 1为p S E T 152衍生质粒,含有放线紫红素生物合成基因簇,由王业民构建(未发表)㊂p H L 737为放线紫红素生物合成基因簇敲除载体,由徐钟构建(未发表);p H L Y 32为十一烷基灵菌红素基因簇敲除载体,由俞燕飞构建(未发表);pH L 851携带来自棒状链霉菌的全局性调控基因a fs R S c l a [8]㊂1.2 引物及试剂本研究应用的引物序列如表1,由上海生工生物技术有限公司合成㊂网络出版时间：2013-12-13 14:26网络出版地址：/kcms/detail/42.1181.S.20131213.1426.001.html华中农业大学学报第33卷表1 本研究所涉及引物及其用途T a b l e 1 P r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d y a n d i t s a p pl i c a t i o n 名称N a m e 序列S e qu e n c e 用途A p pl i c a t i o n o r i T -FG G A T C C G G T T T C A T C A G C C A T C C G 扩增o r i T 片段A m pl i f i c a t i o no f o r i T o r i T -R A G A T C T T G C C A A A G G G T T C G T G T A GK 7-B K FT G C T G C T G C T C A T C C A C C A C A T C G 筛选含c d a 序列的p H L T 2S c r e e n i n g fo r p H L T 2w h i c h c o n t a i n i n g c d a s e qu e n c e K 7-B K RC G T C A T C C G G G T C G C G T T C AK 7-L N -FG A G C C T C C G T C C A C C G T C G T T T K 7-L N -RC C A G C T T C C T G T T C G G C G T C AK 7-L e f t -F G C A G G T C G G T G A G C A C G A A G G TK 7-L e f t -R T G G T G G A T G A G C A G C A G C A G G A C s jh C h e k 1F C G A C T G G C T G G A C G T G C T G G A A 筛选c d a 基因簇中断菌株(P C R 1)S c r e e n i n g fo r c d a g e n e c l u s t e r r e p l a c e m e n tm u t a n t (P C R 1)s jh C h e k 1R A C G A C G A C A T G C G G G A G G T G C Tt n -7-2047-F G G G G A T A A C G C A G G A A A G A A筛选c d a 基因簇中断菌株(P C R 2)S c r e e n i n g fo r c d a g e n e c l u s t e r r e pl a c e m e n tm u t a n t (P C R 2) 限制性内切酶和碱性磷酸酶购自F e r m e n t a s 公司;连接酶S o l u t i o n Ⅰ㊁D N A 聚合酶r T a q 等试剂购自T a K a R a 公司;琼脂糖回收试剂盒购自OM E -G A 公司;高保真D N A 聚合酶K O D p l u s 购自T O Y O B O 公司;抗生素购自S i g m a 公司;其余试剂均购自国药集团和O x o i d 公司㊂1.3 培养基L B 培养基用于培养大肠杆菌[8]㊂2ˑY T 培养基[9]用于接合转移时链霉菌孢子的热激处理㊂M S 培养基用于链霉菌的培养㊁产孢和接合转移[10]㊂营养琼脂培养基用于生测涂布培养蕈状芽胞杆菌[11]㊂S MM S 培养基用于链霉菌产素观察[12]㊂N A 培养基用于链霉菌固体发酵产抗生素[13]㊂1.4 DNA 的抽提、转化及克隆大肠杆菌质粒D N A 和链霉菌总D N A 抽提参照标准操作方法[9-10]㊂质粒酶切和连接方法参照酶的使用说明书㊂D N A 片段的回收参照琼脂糖回收试剂盒的使用说明书㊂D N A 片段的P C R 扩增参见文献[9]㊂大肠杆菌转化参照标准钙转方法[9]㊂D N A 序列由上海美吉生物医药科技有限公司测定㊂1.5 大肠杆菌和链霉菌属间接合转移大肠杆菌和链霉菌属间接合转移参照文献[10]进行,将待转穿梭质粒转化到大肠杆菌E T 12567/pU Z 8002,挑单克隆转化子于L B 中活化过夜;活化后按1ʒ100(V /V )的比例转接到新鲜L B 中培养到D 600n m =0.4~0.6,收集菌体,用新鲜L B 洗涤2次,0.1倍体积L B 悬浮备用㊂同时将新鲜链霉菌孢子悬浮于2ˑY T 培养基中,50ħ水浴10m i n,自然冷却㊂1ʒ1(V /V )混合大肠杆菌和孢子,涂布在M S 无抗平板上,30ħ培养14~18h ,用抗生素和三甲氧苄啶覆盖筛选接合转移子㊂1.6 cda 基因簇敲除质粒的构建从天蓝色链霉菌K 7菌株中克隆c d a 生物合成基因簇的部分序列,然后用来自p H L 851的a f s R -S c l a 替换c d a 基因簇内部分片段,获得c d a 基因簇敲除质粒㊂具体构建过程如下:1)c d a 基因簇部分序列的克隆㊂抽提K 7菌株的总D N A ,S a u 3A I 部分酶切,回收大约20k b 的片段,自连后转化大肠杆菌D H 5α,获得具有阿泊拉霉素抗性㊁含有完整的m i n i -T n 5-a a c (3)I V 微型转座子的克隆,最后从这些克隆中P C R 筛选到含有较长c d a 基因簇序列的克隆,命名为p H L T 2㊂2)a f s R S c l a D N A 片段的结构改造㊂用P C R 方法从p S E T 152上扩增含o r i T R K 2的D N A 片段,用B a m HⅠ和B gl Ⅱ双酶切P C R 产物,插入到pH L 851上a f s R S c l a 下游的B a m HⅠ位点,得到质粒p H L T 1㊂3)c d a 基因簇敲除质粒的构建㊂用P s t I 和E c o RⅠ双酶切p H L T 1,回收含有a f s R S c l a -o r i T 的4685b p 片段,与P s t Ⅰ和E c o RⅠ双酶切p H L T 2得到的约14k b 片段连接,得到p H L T 3,再用K pn Ⅰ酶切p H L T 3,自连以抹掉过长的一段基因组D N A ,得到p H L T 4,在该质粒中用全局性正调控基因a f s R S c l a 替换掉了7.1k b 的c d a 基因簇部分D N A 片段,可用作c d a 基因簇基因置换质粒㊂1.7 抗生素基因簇敲除突变菌株的筛选通过同源重组删除基因簇的部分序列来失活抗生素合成基因簇,为便于今后菌株的应用,不采用抗生素抗性基因来替换待中断的基因,因此,基因中断菌株没有抗生素抗性,筛选必须分为两步进行㊂首先,接合转移得到整合了中断载体的链霉菌,P C R筛选并且验证单交换;其次,正确的单交菌株在抗性2第1期白亭丽等:变铅青链霉菌高效异源表达宿主S B T 5的构建 M S 平板培养至产孢,孢子稀释涂布到无抗的M S平板上培养,用影印的方法将长好的菌落转印到抗生素平板上培养,对照2个平板挑选无抗性的克隆,然后抽提总D N A ,通过P C R 筛选双交换突变株㊂1.8 抗生素生物活性测定将待测链霉菌接种到N A 培养基上,30ħ培养7d 进行固体发酵㊂指示菌芽胞杆菌于L B 培养基中37ħ㊁200r /m i n 活化过夜,然后转接培养至D 600n m =0.4~0.6,取200μL 培养物均匀涂布到营养琼脂平板上,接着用打孔器取相同大小的链霉菌发酵菌块放置到上述营养琼脂平板上,37ħ培养12~16h 后观察抑菌圈㊂2 结果与分析2.1 cda 基因簇敲除1)c d a 基因簇敲除质粒p H L T 4的构建㊂从天蓝色链霉菌k 7菌株的总D N A 中克隆得到p H L T 2,P C R 验证m i n i -T n 5-a a c (3)I V 一侧含有约14k b 的c d a 基因簇部分序列,在此基础上构建p H L T 4(图1)㊂p H L T 4与p H L T 2相比:c d a 基因簇D N A 序列中从P s t Ⅰ到E c o R Ⅰ位点的7.1k b 部分片段被a f s R S c l a -o r i T 所取代;且p H L T 4中a f s R S c l a -o r i T 两侧可用于同源交换的染色体D N A 片段分别为4544和2312b p,可用于c d a 基因簇的基因置换㊂图1 c d a 生物合成基因簇基因置换质粒p H L T 4的构建流程F i g .1 C o n s t r u c t i o no f p H L T 4,t h e c d a g e n ec l u s t e r g e n e r e p l a c e m e n t pl a s m i d 3华中农业大学学报第33卷2)c d a 基因簇敲除菌株的构建㊂将p H L T 4接合转移到变铅青链霉菌T K 24中,筛选阿泊拉霉素抗性(A p r R)的接合转移子,用o r i T R K 2特异性引物进行P C R 验证菌株基因型为单交换菌株㊂从A pr R的单交换菌株后代中通过影印筛选得到阿泊拉霉素敏感(A p r S )菌株,设计2个P C R 反应从A pr S菌株中筛选㊁验证双交换菌株,双交换只有P C R 1可以有阳性条带产生,野生型没有阳性条带,而单交换则2个P C R 反应都有阳性条带(图2)㊂图2中5㊁13和14号为正确的双交换菌株,命名为S B T 2㊂与T K 24出发菌株相比,S B T 2明显产生更多的蓝色色素(图3)㊂ M :1k b 标准(对照)1k b m a r k e r ;WT :野生型S .l i v i d a n sS .l i v i d a n s w i d e t y pe ;2~16:来源于p H L T 4接合转移子的衍生菌株S t r a i n s d e r i v e df r o ma nA p r R p H L T 4e x c o n j u ga n t .图2 c d a 基因簇置换菌株的P C R 筛选与鉴定F i g .2 P C Rs c r e e n i n g an dc o n f i r m a t i o no f t h e c d a g e n ec l u s t e r r e pl a c e m e n t s t r a i n s 2.2 放线紫红素和十一烷基灵菌红素基因簇的基因敲除将放线紫红素基因簇a c t 敲除载体p H L 737转入大肠杆菌E T 12567/pU Z 8002,接合转移到S B T 2中,得到A p r R接合转移子,再用P C R 方法筛选验证单交换菌株㊂通过影印筛选,从A pr R后代得到A pr S菌株,其中正确的双交换菌株不再产生蓝色的放线紫红素,菌株命名为S B T 4;同时观察到S B T 4大量合成红色的十一烷基灵菌红素(图3)㊂将十一烷基灵菌红素基因簇r e d 敲除载体p H L Y 32接合转移到S B T 4中,得到A p r R接合转移子,先进行单交换菌株筛选,再筛选双交换菌株,得到既不产蓝色A C T 也不产红色R E D (图3)㊁且不产钙依赖性抗生素C D A 的菌株(图4),命名为S B T 5㊂2.3 放线紫红素在SBT5中的表达质粒p MM 1上含有来自天蓝色链霉菌的放线紫红素生物合成基因簇,将p MM 1引入S B T 5和出发菌株T K 24中,以空载体p S E T 152作为对照,2个菌株均具有较高接合转移效率(数据未给出)㊂观察比较2个菌株表达次级代谢基因簇能力(图5)㊂结果显示野生型菌株加入空载体(T K 24ɨp S E T 152,含有A C T 和R E D 两个色素类抗生素基因簇)呈淡红色;用p MM 1引入额外拷贝a c t 基因簇后,含有2个a c t 基因簇拷贝的菌株T K 24ɨpMM 1产蓝色色素有所提高,而含p MM 1的S B T 5菌株大量产生放线紫红素,根据深蓝色判断其产量远远高于含有1个或2个拷贝a c t 基因簇的野生型菌株㊂超量表达A C T 的S B T 5接合转移子经过多次传代仍保持较高产量㊂在N A 培养基上培养T K 24及其突变株S B T 2㊁S B T 4和S B T 5,30ħ4d (平板背面)㊂T K 24a n di t s m u t a n tS B T 2,S B T 4a n dS B T 5w e r e c u l t u r e do nN Aa ga r p l a t e s f o r 4d ,30ħ.图3 T K 24及其抗生素基因簇敲除菌株产色素的表型观察F i g .3 P i g m e n t s p r o d u c t i o nb y TK 24a n d i t s g e n ec l u s t e r s r e pl a c e m e n tm u t a n t s 链霉菌在N A 培养基上发酵,发酵平板上的琼脂块用于生物测定㊂T K 24产生抑菌圈,S B T 5不产生㊂S t r e p t o m yc e s s t r a i n sw e r e f e r m e n t ed o nN Aa g a r ,t he n t h e a g a r p l u g sf r o mf e r m e n t a t i o n ag a r w e r eu s e d f o r th ebi o a s s a y.T K 24p r o d u c e daz o n eo f i n h i b i t i o n ,w h i l eS B T 5d i dn o t .图4 T K 24和S B T 5合成钙依赖抗生素的生物测定F i g .4 B i o a s s a y o f C D A p r o d u c t i o nb y TK 24a n dS B T 54第1期白亭丽等:变铅青链霉菌高效异源表达宿主S B T 5的构建在S MM S 培养基上接种链霉菌,30ħ培养4d ;S B T 5ɨp MM 1产生深蓝色的放线紫红素㊂S t r e p t o m yc e s s t r a i n sw e r e f e r m e n t e do n S MM Sa ga r ,30ħ,4d .S B T 5ɨp MM 1p r o d u c e dd a r kb l u e ac t i n o r h od i n .图5 S B T 5过量表达放线紫红素F i g .5 O v e r pr o d u c t i o no f a c t i n o r h o d i n i nS B T 53 讨 论基因组和宏基因组测序表明,自然界中的可培养或未培养微生物基因组中蕴含着丰富的次级代谢途径资源,是天然产物筛选的宝库㊂然而,由于大部分基因簇常处于沉默状态,采用传统方法很难继续从微生物中有效地分离到新的化合物㊂如何激活这些沉默或隐藏的基因簇以获得相应的化合物,是新药先导化合物发掘领域亟待解决的瓶颈问题[14-15],开发高效的异源表达方法无疑是其中重要的备选方案㊂变铅青链霉菌遗传背景清晰㊁遗传操作简单高效,是异源表达筛选技术的首选宿主菌,缺点是其含有内源色素和抗生素基因簇,且天然次级代谢能力不强㊂本研究针对这些特点,改造变铅青链霉菌,敲除了A C T ㊁R E D ㊁C D A 等3个内源抗生素的基因簇,同时为了激活或者高表达异源基因簇,还加入了一个多效性正调控基因a f s R S c l a ㊂来源于棒状链霉菌的a f s R S c l a 能够激活沉默的放线紫红素㊁钙依赖性抗生素和全霉素的生物合成,并大幅度提高棒酸的产量[8]㊂在本研究中也发现,在c d a 基因簇原位加上a f s R S c l a 后,菌株S B T 2大量合成放线紫红素;在进一步敲除a c t 基因簇后,由于没有蓝色色素干扰,在菌株S B T 4中又观察到十一烷基灵菌红素R E D 大量合成㊂这些结果表明,新引入的a fs R S c l a 可以促进不同类型抗生素的大量合成㊂无疑,高效表达宿主S B T 5菌株的成功构建和应用将为我们大量快速发掘新的天然产物提供很好的工具㊂参考文献[1] K I E S E R H M ,K I E S E R T ,H O P WO O D D A.Ac o m b i n e d g e -n e t i c a n d p h y s i c a lm a p o f t h e S t r e p t o m yc e s c o e l i c o l o r A 3(2)c h r o m o s o m e [J ].JB a c t e r i o l ,1992,174:5496-5507.[2] 郑华亮,白亭丽,陶美凤.大肠杆菌乙酰-C o A 羧化酶基因异源表达对变铅青链霉菌次级代谢的影响[J ].华中农业大学学报,2013,32(4):12-18.[3] HA N A HA N D .S t u d i e so nt h e t r a n s f o r m a t i o no f E .c o l i w i t h pl a s m i d s [J ].JM o l B i o l ,1983,166(4):557-580.[4] F L E T TF ,M E R S I N I A SV ,S M I T H CP .H i g h e f f i c i e n c y i n t e r -g e n e r i c c o n j u g a l t r a n s f e r o f p l a s m i dD N Af r o m E s c h e r i c h i a c o -l i t om e t h y l D N A -r e s t r i c t i n g S t r e p t o m y c e t e s [J ].F E M SM i c r o -b i o l L e t t ,1997,155:223-229.[5] K E M P T E R C ,K A I S E R D ,H A A GS ,e t a l .C D A :c a l c i u m -d e -p e n d e n t p e p t i d ea n t i b i o t i c sf r o m S t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o r A 3(2)c o n t a i n i n g u n u s u a l r e s i d u e s [J ].A n g e w a n d t e C h e m i e I n t e r -n a t i o n a l E n gl i s hE d i t i o n ,1997,36:498-501.[6] HO P WO O DD A ,H I N T E RMA N N G ,K I E S E R T ,e t a l .I n t e -g r a t e dD N A s e q u e n c e si nt h r e es t r e p t o m yc e t e sf o r m r e l a t ed a u t o n o m o u s p l a s m i d sa f te r t r a n sf e r t o S t r e p t o m y c e s l i v i d a n s [J ].P l a s m i d ,1984,11:1-16.[7] B I E R MA N M ,L O G A N R ,O B R I E N K ,e t a l .P l a s m i d c l o n i n gv e c t o r s f o r t h e c o n j u ga l t r a n s f e r o fD N Af r o m E s c h e r i c h i a c o l i t o S t r e p t o m y c e s s p p .[J ].G e n e ,1992,116(1):43-49.[8] C H E NL ,WA N GY ,G U O H ,e t a l .H i g h -t h r o u g h p u t s c r e e n i n g f o r S t r e p t o m yc e s a n t i b i o t i cb i o s y n t h e s i sa c t i v a t o r s [J ].A p p l E n v i r o n M i c r o b i o l ,2012,78(12):4526-4528.[9] S AM B R O O KJ ,R U S S E L L D.M o l e c u l a r c l o n i n g :a l a b o r a t o r ym a n u a l [M ].3t h e d .N Y :C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r yP r e s s ,C o l dS p r i n g Ha rb o r ,2001.[10]K I E S E R T ,B I B B MJ ,B U T T N E R M J ,e t a l .P r ac t i c a l S t r e p -t o m y c e s g e n e t i c s [M ].2n ded .N o r w i c h :T h eJ o h nI n ne sF o u n -d a t i o n ,2000.[11]F A R N E T C M.S y s t e m ,k n o w l e d g er e p o s i t o r y a n dc o m p u t e r -r e a d a b l em e d i u mf o r i d e n t i f y i n g a s e c o n d a r y m e t a b o l i t e f r o ma m i c r o o r ga n i s m :U S A ,U S 2008/0010025A 1[P ].2008-01-01.[12]B E N T L E YSD ,C H A T E RKF ,C E R D E N O -T A R R A G AA M ,e ta l .C o m p l e t e g e n o m es e q u e n c eo ft h e m o d e la c t i n o m yc e t e 5华中农业大学学报第33卷S t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o r A3(2)[J].N a t u r e,2002,417(6885): 141-147.[13]W I N T E RJ M,B E HN K E N S,H E R TW E C K C.G e n o m i c s-i n-s p i r e dd i s c o v e r y o f n a t u r a l p r o d u c t s[J].C u r rO p i nC h e m B i o l, 2010,15(1):22-31.[14]H E R TW E C KC.H i d d e nb i o s y n t h e t i c t r e a s u r e s b r o u g h t t o l i g h t[J].N a tC h e m B i o l,2009,5(7):450-452.[15]S C HWA R Z E RD,F I N K I N GR,MA R A H I E L M A.N o n r i b o s o-m a l p e p t i d e s:f r o m g e n e s t o p r o d u c t s[J].N a tP r o dR e p,2003, 20:275-287.C o n s t r u c t i o no f S t r e p t o m y c e s l i v i d a n s S B T5a s a n e f f i c i e n th e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o nh o s tB A IT i n g-l i1 Y U Y a n-f e i1 X UZ h o n g1 T A O M e i-f e n g1,21.S t a t eK e y L a b o r a t o r y o f A g r i c u l t u r a lM i c r o b i o l o g y,H u a z h o n g A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,W u h a n430070,C h i n a;2.S t a t eK e y L a b o r a t o r y o f M i c r o b i a lM e t a b o l i s m,S h a n g h a i J i a o t o n g U n i v e r s i t y,S h a n g h a i200030,C h i n aA b s t r a c t T h r e e g e n e c l u s t e r s c o n t r o l l i n g t h eb i o s y n t h e s i so f t h ea n t i b i o t i c s a c t i n o r h o d i n(A C T), u n d e c y l p r o d i g i o s i n(R E D)a n dc a l c i u m-d e p e n d e n ta n t i b i o t i c(C D A)w e r es e q u e n t i a l l y k n o c k o u t e db y g e n e r e p l a c e m e n t s f r o mt h e c h r o m o s o m eo f S t r e p t o m y c e s l i v i d a n s T K24t od e r i v eSB T5.I nS B T5,t h e g l o b a l r e g u l a t o r yg e n e s a f s R S c l a f r o m S t r e p t o m y c e s c l a v u l i g e r u s w a s i n t e g r a t e d i nt h e p l a c eo f t h e c d a g e n e c l u s t e r.T h e a c t g e n e c l u s t e r f r o m S t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o r w a s i n t r o d u c e d i n t oS B T5t o t e s t i t s c a-p a b i l i t y o f e x p r e s s i n g s e c o n d a r yg e n e c l u s t e r.T h e r e s u l t i n g S B T5e x c o n j u g a n t s o v e r p r o d u c e dAC Tc o m-p a r i n g w i t hw i l d-t y p e s t r a i n sh a r b o r i n g d o u b l ec o p i e so f t h e a c t g e n ec l u s t e r.S B T5i sa ne f f i c i e n th o s t w i t ha c l e a n s e c o n d a r y m e t a b o l i s mb a c k g r o u n d s u i t a b l e f o r h e t e r o l o g o u s l y e x p r e s s i n g a n d s c r e e n i n g s e c-o n d a r y m e t a b o l i c g e n e c l u s t e r s.K e y w o r d s S t r e p t o m y c e s l i v i d a n s;h e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o nh o s t;s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s;a n t i b i o t-i c b i o s y n t h e t i c g e n e c l u s t e r s;g e n ek n o c k o u t;a f s R S c l a(责任编辑:张志钰) 6。
