专业实验III 临床免疫检验

抗原抗体反应：是指抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应。

抗原抗体间的结合力涉及静电引力、范德华力、氢键和疏水作用力，其中疏水作用力最强，它是在水溶液中两个疏水基团相互接触，由于对水分子的排斥而趋向聚集的力。

亲和性（affinity）：是指抗体分子上一个抗原结合点与一个相应抗原表位（AD）之间的结合强度，取决于两者空间结构的互补程度。

亲合力（avidity）：是指一个完整抗体分子的抗原结合部位与若干相应抗原表位之间的结合强度，它与亲和性、抗体的结合价、抗原的有效AD数目有关。

抗原抗体反应的特点：特异性、可逆性、比例性、阶段性。

带现象（zone phenomenon）：一种抗原-抗体反应的现象。

在凝集反应或沉淀反应中，由于抗体过剩或抗原过剩，抗原与抗体结合但不能形成大的复合物，从而不出现肉眼可见的反应现象。

抗体过量称为前带，抗原过量称为后带。

免疫原（immunogen）：是指能诱导机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。

免疫佐剂（immuno adjustvant）：简称佐剂，是指某些预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的物质。

半抗原（hapten）：又称不完全抗原，是指仅具有与抗体结合的能力(抗原性)，而单独不能诱导抗体产生（无免疫原性）的物质。

当半抗原与蛋白质载体结合后即可成为完全抗原。

载体（carrier）：结合后能给予半抗原以免疫原性的物质。

载体效应：初次免疫与再次免疫时，只有使半抗原结合在同一载体上，才能使机体产生对半抗原的免疫应答，该现象称为~。

单克隆抗体（McAB）：将单个B细胞分离出来，加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生的针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，即~。

多克隆抗体（PcAb）：天然抗原分子中常含多种不同抗原特异性的抗原表位，以该抗原物质刺激机体免疫系统，体内多个B细胞克隆被激活，产生含有针对不同抗原表位的免疫球蛋白，即~基因工程抗体（GEAb）：是利用DNA重组及蛋白工程技术，从基因水平对编码抗体的基因进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。

绪论Δ基础免疫学理论相关内容：抗原、抗体、补体、细胞因子、HLA、免疫系统、免疫应答Δ临床免疫学抗感染免疫、超敏反应、自身免疫、肿瘤免疫、移植免疫Δ免疫学实验技术免疫学检验抗原抗体反应Δ抗原抗体反应：高度特异性体内：体液免疫效应体外：血清学反应(沉淀反应、凝集反应、补体参与的溶血反应、补体结合试验、中和试验、免疫标记技术)Δ原理内因：Ag、Ab能特异性结合外因：Ag、Ab结合的动力①静电引力（库仑引力）②范德华力（电子云力）小于静电引力③氢键大于范德华力④疏水作用力（作用最大）Δ盐析：在高浓度电解质（如NaCl）存在的条件下，NaCl可先与Ab分子结合（在Ab 未与Ag相遇时），排斥H2O分子，从而使Ab蛋白质优先沉降Δ特点：1.特异性：交叉反应（cross-reaction）：抗体对具有相同或相似抗原表位的不同抗原的反应。

先决条件：存在共同Ag表位意义：①免疫学诊断：外斐氏反应——用变形杆菌OX19、OX2、OXk做抗原查血清抗体，诊断斑疹伤寒（立克次氏体感染所致）②免疫病理损害（Eg：链球菌感染后易导致肾小球肾炎，原因是链球菌与人体肾小球基底膜有共同Ag表位所致）2.最适比例Ab过剩，前带（可溶性抗原抗体复合物）Ag过剩，后带（可溶性抗原抗体复合物）Ab、Ag合适比例沉淀物等价带（沉淀物）Δ抗体（等价带范围不同）R型抗体家兔免疫血清较宽大多数小动物H型抗体马免疫血清较窄人和多数大动物3.可逆性：Ag+Ab AgAb原因：非共价键结合，不是化学反应Δ影响因素自身因素：①Ag：理化性质、抗原表位数目及种类②Ab：来源（R型or H型）、特异性、亲和性、浓度外界环境条件：①电解质：0.9%NaCl，if浓度过高，会盐析②pH：6~8，if小于3，酸凝集；过高，碱变性③温度：37℃沉淀反应及免疫电泳Δ颗粒型抗原凝集反应eg：细菌、RBCΔ可溶性抗原沉淀反应eg：血清蛋白溶液、多糖抗原Δ沉淀反应（precipitation reaction）：可溶性抗原与相应抗体结合，在电解质存在，两者比例恰当时，可出现肉眼可见的沉淀现象Ag：沉淀原Ab沉淀素实验中为使抗原抗体比例（数量）恰当，应稀释AgΔ分类①液相沉淀：絮状沉淀、环状沉淀、免疫比浊测定②凝胶扩散：双扩、单扩③凝胶免疫电泳：免疫电泳、对流免疫、火箭免疫Δ絮状沉淀试验出现絮状/块状沉淀玻片法：检测病毒（定性）试管法：方阵滴定（半定量）Δ环状沉淀反应测抗原（法医血迹鉴定）Δ免疫透射浊度测定法检测IgG、IgA、IgM、C3Δ凝胶扩散（agar immunodiffusion）：可溶性抗原与相应抗体在电解质存在下，在琼脂基质中扩散，当两者相遇，比例恰当时结合，可出现肉眼可见的沉淀线Δ双扩（double immunodiffusion）原理：可溶性抗原和抗体在含有电解质的琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自向四周凝胶中扩散，当二者相对应时即发生特异性反应，在浓度比例合适处形成可见的白色沉淀线方法：①制琼脂板（3ml 1.5%NS琼脂）②打孔（双孔型/三角孔型/梅花孔型）③加样（平孔沿加满）④扩散（37℃，24h观察结果）用途：①双孔型：已知Ag测未知Ab，or已知Ab测未知Ag②三角孔型：抗原性质分析③梅花孔型：测Ag有效稀释度优点：简单、易行、用途广缺点：敏感性低、出结果慢、只定性，不能定量Δ单扩（single immunodiffusion）原理：将一定量抗体混浇于琼脂内，置于凝胶孔中的定量抗原向四周扩散，抗原与相应抗体在比例合适处形成白色沉淀环，其大小与抗原浓度成正比方法：①已知抗体+琼脂制板，打孔②在琼脂板小孔中加梯度抗原③抗原向四周扩散形成沉淀环④抗原浓度与沉淀环直径呈线性关系，绘制标准曲线⑤从标准曲线上查出并计算出待测标本含量用途：定量测定IgG、IgA、IgM、C3等含量Δ影响电泳的因素①溶液的pH，常用8~9，蛋白质带负电②溶液的离子强度，越高，泳动慢，一般0.02~0.2M③电场强度，越高，越快，一般4~6V/cm（琼脂长），约40V左右④电渗作用：电场中液体对于一固体的固定相对移动的现象，电渗方向与电泳方向相反Δ对流免疫电泳（counter-immunoelectrophoresis）原理：定向加速的免疫双扩（双扩+电场，使抗原、抗体相对泳动）方法：Ag、Ab分别在琼制板上不同孔内，Ag在负极，Ab在正极，电泳电压：4~6V/cm（琼脂长度）时间：45分钟~1小时pH：8.6用途：检测HBsAg、AFP优点：耗时短、反应敏感性强Δ免疫电泳（immunoelectrophoresis）原理：Ag区带电泳+双扩结合方法：①Ag电泳分出区带②Ag、Ab免疫双扩用途：分析复杂Ag的组分（人全血清组分的分析）、多发性骨髓瘤等疾病的测定优点：用样品量小，特异性高、分辨力强凝集反应Δ凝集反应（Agglutination）细菌、细胞等颗粒性抗原悬液加入相应抗体，在电解质存在下，两者特异性结合，出现肉眼可见得凝聚块Ag：凝集原Ab：凝集素凝集反应应稀释抗体Δ沉淀试验和凝集试验的比较抗原性质可溶性Ag 颗粒性Ag稀释对象抗原抗体结果现象沉淀现象凝集现象敏感性低高Δ分类：直接凝集反应玻片法试管法间接凝集反应（正向）间接（血、胶乳）凝集试验反向间接（血、胶乳）凝集试验间接凝集抑制试验协同凝集试验Δ直接凝集反应（direct agglutination）细菌、螺旋体、细胞等颗粒性抗原（抗原时细胞表面结构）在适当电解质参与下，直接与相应抗体结合，出现肉眼可见的凝集现象Δ玻片法与试管法的区别玻片法试管法原理已知抗体测未知抗原已知抗原测未知抗体的效价定性半定量用途ABO血型鉴定肥达氏反应菌种鉴定外斐氏反应Δ间接凝集反应（indirect agglutination or passive agglutination）将可溶性抗原或抗体吸附在某种载体微球上，使之成为颗粒性抗原或抗体，然后再与相应的抗体或抗原结合，出现载体微球的凝集现象载体的要求：不干预免疫反应、颗粒大小均匀常用载体种类：红细胞（绵羊、家兔、人O型）聚苯乙烯胶乳颗粒（人工合成高分子材料）等活性炭粒、、硅酸铝颗粒Δ致敏微粒/致敏颗粒：吸附有抗原或抗体的载体颗粒Δ间接凝集试验命名（根据载体不同）血凝试验（以RBC为载体）乳胶凝集试验（以胶乳颗粒为载体）Δ（正向）间接（血、胶乳）凝集试验原理：将已知的可溶性抗原吸附于颗粒性载体上，检测未知抗体Δ反向间接（血、胶乳）凝集试验原理：将已知抗体吸附于颗粒性载体上，检测未知抗原实例：检测HBsAg、AFP等Δ间接凝集抑制试验原理：待测样本（可溶性Ag？）+已知Ab +已知致敏Ag颗粒（已成为颗粒性Ag）观察是否有凝集现象（不凝集为阳性，凝集为阴性）实例：检测小便中绒毛膜促性腺激素（HCG）Δ协同凝集试验（coagglutination）原理：实质为反向间接凝集反应实例：葡萄球菌A蛋白（SPA）能非特异性地与IgG的Fc段结合，当与特异性抗原相遇时，IgG的Fab段与抗原结合，出现金葡菌的凝集现象（属特殊间接凝集试验）用途：用已知抗体检测未知抗原，用于多种抗原的检测免疫标记技术Δ免疫标记技术的原理用可以微量检测的标记物（示踪物质）标记抗原或抗体，作为试剂，与相应抗体或抗原结合反应后，测定抗原抗体复合物中的标记物，从而推断所测抗体或抗原有无及量的多少免疫标记技术=免疫技术+标记技术免疫技术：抗原抗体反应（特异性）示踪物标记：酶、荧光素、同位素（灵敏性）特点：高特异性、高灵敏性Δ分类免疫标记技术放射免疫技术酶免疫组化技术双抗体夹心法免疫酶技术竞争抑制法免疫荧光技术酶联免疫吸附技术双抗原夹心法其他标记技术间接法双位点一点法Δ常用标记物荧光素、酶、同位素、胶体金、可发光化学物质Δ免疫荧光技术（IF）免疫荧光显微技术（定性）免疫荧光测定技术（定量）原理：用荧光素标记抗原或抗体，与待测标本中相应抗体或抗原结合，通过检测荧光，确定标本中有无待测的抗体或抗原Δ常用荧光素异硫氰酸荧光黄（FITC）黄绿色四乙基罗丹明（RB200）橘红色四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）橙红色Δ荧光显微镜主要组成A. 白炽光源（超高压汞灯）紫外光or兰紫光B. 两组滤光板激发滤板激发光谱抑制滤板抑制紫外光or兰紫光，只许荧光通过C. 显微镜普通光学显微镜or兰紫光——激发滤板——紫外光——被检物（荧光染色标本）—荧光——抑制滤板——荧光（我们肉眼见）Δ一般免疫荧光显微技术均标记抗体Δ片子制作：切片、涂片、印片Δ荧光抗体染色法①直接法：待测标本固定（Ag？）+*Ab——*AgAb用途：检测抗原优点：快，直接，干扰因素少缺点：每检测一种抗原要标记一种荧光抗体，较麻烦②间接法（用得最多）Step1：荧光素标记抗抗体（如荧光素标记的羊抗人IgG）Step2：已知Ag固定+待测标本（Ab？）——洗，+荧光标记的抗抗体——洗，荧光显微镜镜检优点：①制备一种荧光标记二抗（抗抗体）可用于多种Ab检测②灵敏度高③补体法Step1：荧光素标记抗补体Step2：已知Ag固定+待测标本（Ab？）+补体——洗，+荧光标记的抗补体——洗，荧光显微镜镜检优点：灵敏度高，制备一种荧光抗补体用于多种检测缺点：干扰因素多，补体不稳定，易失活，该法少用④双标记法用两种荧光素（FITC、罗丹明）分别标记针对同一Ag上不同抗原表位的抗体，对同一标本染色，当Ag有两种相应抗原表位存在时，可同时见到黄绿和橙红两种荧光Δ免疫荧光显微技术优缺点优点：①特异性、敏感性高②快速③可定位④既可测Ag又可测Ab缺点：①需要荧光显微镜②存在非特异荧光干扰（原因是自发抗体不纯，交叉反应、技术问题）③定性测定、判断结果不客观④制备片子难保存（荧光猝灭）Δ时间分辨荧光免疫测定（液相检测）原理：用铕（Eu）等具有较长荧光寿命的稀土金属作荧光标记物来标记Ab或Ag，从而检测标本中相应Ag或Ab的新技术特点：①利用时间分辨荧光仪延缓检测时间，排除非特异性干扰荧光②灵敏度可达0.2~1ng/ml免疫酶技术Δ优点：较IF、RIA更优越，敏感、安全、稳定、易观察结果Δ原理：利用酶标记Ag或Ab后不改变Ag、Ab反应特异性，同时又不影响酶的活性，结合在AgAb上的酶催化底物，生成有色产物，根据产物颜色深浅推测出待测物中相应物质（Ag、Ab）有无及含量多少Ag+AbE——AgAbE+底物呈色反应Δ特点特异性：Ag、Ab反应敏感性：酶的高效催化作用Δ分类酶免疫组织化学染色技术（免疫组化）酶免疫测定法（酶联免疫吸附试验，ELISA）Δ常用的酶辣根过氧化物酶HRP：铁卟啉蛋白质，能进入细胞内，酶活性强，酶结合物可长期保存，最适Ph为5.5左右碱性磷酸酶葡萄糖氧化酶Δ纯度：RZ：反映酶含量与蛋白含量之比（最好RZ为3.0左右）Δ活性：每1mg酶中所具有的活性单位，应大于250u/mgΔ底物系统：供氢体、受氢体ΔHRP的底物邻苯二胺（OPD）反应体系中作为供氢体：DH2+H2O2D+2H2O供氢体受氢体有色产物特点：有色产物为黄色，空白对照接近无色，敏感度高，有致癌作用四甲基联苯胺（TMB）特点：有色产物为蓝色，无致癌作用酶联免疫吸附试验（ELISA）Δ原理将酶分子与Ab或Ag连接成一酶结合物（酶标记物），当它与固相载体中相应Ag或Ab相遇，形成酶标记的AgAb复合物，加入底物，酶催化底物，生成有色产物，根据颜色深浅可测出溶液中Ag或Ab的量Δ有关术语及试剂包被（coat）：将Ag或Ab吸附在固相载体上的过程，又称固相化或吸附包被后不能被洗脱包被缓冲液：pH：9.6CB（碳酸盐缓冲液）洗涤（wash）：pH：7.2~7.4PBS（磷酸盐缓冲液）酶结合物：酶标抗体或酶标抗原终止液：2M H2SO4OPD（邻苯二胺）：酶催化后有色产物为黄色，H2SO4终止后橙色（棕色）TMB（四甲基联苯胺）：酶催化后有色产物为蓝色，H2SO4终止后黄色Δ步骤包被已知Ab——洗涤——加待测标本（测Ag？）——洗涤——加酶标Ab——洗涤——加底物——加终止液——观察结果Δ用途检测抗原，包被的抗体与酶标抗体属同一种类抗体，每检测一种抗原就需制备相应的酶标抗体，较麻烦Δ步骤包被已知Ag+待测标本（测Ab？）——反应一段时间后，洗涤——加酶标抗抗体（酶标羊抗人IgG）——洗涤——加底物——加终止液，观察结果Δ用途测抗体，每标记一种抗抗体可以用于多种抗体的检测双位点一步法Δ步骤包被抗体A+待测标本+酶标抗体B——洗涤，+底物——终止液，观察结果Δ用途检测Ag，Ag至少含A、B两个抗原表位竞争法Δ步骤待测管：已知Ab包被+待测标本（Ag？）——洗涤，+酶标Ag——洗涤，+底物——显色应用亲和素和生物素的ELISA亲和素（avidin）糖蛋白，一分子由四个亚基组成，每一亚基可以与一分子生物素结合生物素（biotin）维生素H，可与蛋白质、糖类、酶类等结合，与亲和素特异结合后极稳定生物素生物素亲和素生物素生物素ΔELISA结果的判定①肉眼判定：与阳性、阴性对照颜色比较若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性若待检孔显色深于或等于阳性对照则判定为阳性若待检孔显色介于阴性与阳性对照之间则判定为弱阳性②酶标光度仪检测A492值（吸光率）：比色法与阳性、阴性对照测定值比较P/N比值：大于2.0为阳性，小于2.0为阴性P：positive（待测吸光度值）N：negativeΔELISA试验的影响因素（一）固相载体常用：聚苯乙烯特点：吸附Ag或Ab的能力强，一旦吸附后，不能被洗脱形状多——试管、珠、微孔板（酶标板）、分软、硬板（最常用）一次性使用，不可回收酶标板要求：吸附性能好、空白值低、透明度高、板批间、孔间性能相近（二）抗原、抗体Ag：需纯化Ab：需效价高、亲和力强、纯化（三）试验条件1. 包被：一般用pH9.6CB，0.05M，有利于蛋白质吸附浓度：0.1~100ug/ml，常用10ug/ml时间、温度：4℃过夜或37℃，1~3h量：100ul封闭：用0.1~5%牛血清白蛋白缓冲液浸泡0.5小时2. Ag-Ab反应的条件①微碱性有利于Ag-Ab结合，故用pH7.4PBS洗涤②去污剂有利于Ag-Ab形成，洗液中加0.05%Tween-20③Ag、Ab反应时间、温度：37℃、40min3. 洗涤采用pH7.2~7.4PBS洗涤，规一化，每次浸泡1~2min，拍干，共洗涤3~4次4. 酶促反应条件温度：37℃时间：10minpH：5.5底物量：一致5. 排除干扰：多设对照ΔElISA应设哪些对照，why？阳性对照：排除假阴性；阴性对照：排除假阳性；酶结合物对照：加酶步加入，无色；底物对照：步加入，无色；空白对照：只加终止液，无色Δ膜载体的酶免疫测定斑点-ELISA：特点，固相载体为硝酸纤维素膜，酶促反应后在膜上形成有色沉淀物免疫印迹法（IBT）Δ应用（所有标记技术）病原体的诊断及研究①病毒、细菌等传染病的诊断（测抗原或抗体）②病毒、细菌表面抗原的研究某些疾病的诊断①某些微量物质有关疾病的诊断②肿瘤的诊断及定位③自身抗体检测协助自身免疫病诊断④寄生虫疾病的诊断等免疫学方面的研究T、B细胞的发生、演化、表面抗原改变等的研究微量物质的检测体内：微量蛋白质、激素、酶等抗原；药物、糖等半抗原工农业：微生物、微量物质等化学发光免疫分析技术Δ发光免疫技术是将发光系统与免疫反应相结合，来检测抗原、或抗体的方法Δ化学发光免疫测定化学发光酶免疫测定（CLEIA）试验前部分与ELISA一样，改变所加底物，使产物能发光，用仪器检测发光强度，判断结果（如酶是用辣根过氧化物酶，常用底物是鲁米诺或其衍生物）化学发光标记免疫测定（CLIA）是用化学发光剂作为标记物直接标记抗原或抗体的免疫测定方法金免疫技术Δ采用胶体金作为标记物Δ胶体金：又称金溶胶，是金盐（氯金酸）被还原（还原剂：柠檬酸钠）成原子金后的金颗粒悬液Δ胶体金的特性①胶体性质：颗粒稳定均匀，分散悬浮，1~100nm②呈色性：颜色与颗粒大小有关2~5nm，橙黄色；Δ原理采用胶体金标记抗体，以硝酸纤维素膜为载体，使抗原抗体反应和洗涤在同一渗滤膜上，反Δ原理以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜毛细管作用，使膜一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析Δ用金标记免疫法（斑点免疫层析试验）测HCG的原理对于HCG阳性标本，尿中HCG与金标记的鼠抗人HCG单抗结合形成免疫复合物，随层析作用向上移动，至检测线与鼠抗人HCG抗体结合而聚集显色，在检测线未结合的金标记鼠抗人HCG单抗（IgG）随着尿液上行，到达质控线与羊抗鼠IgG（二抗）结合而显色，作为质控对照；对于HCG阴性标本，尿中无HCG与金标记的鼠抗人HCG单抗结合形成免疫复合物，随层析作用向上移动，至检测线与鼠抗人HCG抗体不结合而不显色，在检测线未结合的金标记鼠抗人HCG单抗（IgG）随着尿液上行，到达质控线与羊抗鼠IgG（二抗）结合而显色，作为质控对照；若试纸条无效，金标鼠抗人IgG单抗随层析作用向上移动，到达质控线，无羊抗鼠IgG（二抗）或破坏失效，不结合而不显色，作为质控对照免疫血清的制备Δ概述免疫血清：含有某种抗体的血清。

第三章免疫原和抗血清的制备第一节免疫原的制备免疫原指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。

一、颗粒性抗原的制备细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒性抗原。

细胞抗原（如绵羊红细胞）一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配制一定浓度即可。

细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。

颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法。

二、可溶性抗原的制备和纯化（一）组织和可溶性抗原的粗提蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原。

1组.织匀浆的制备（1）高速组织捣碎机法；（2）研磨法：组织匀浆液要离心沉淀，沉淀物为组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。

2细.胞的破碎（）反复冻融法：℃冷冻，〜7融化。

（2）超声破碎法（3）自溶法（4）酶处理法：胃蛋白酶或胰酶。

（5）表面活性剂处理法：十二烷基硫酸钠。

3免.疫球蛋白片段的制备（）非共价键解离法：改变环境或用变性剂。

（2）共价键解离法：还原法或氧化法解离二硫键。

（3）溴化氰裂解法：溴化氰裂解蛋白质肽链。

（4）酶解法：木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶。

（二）可溶性抗原的提纯和纯化超速离心法：适用于少数大分子抗原或比重较轻的抗原，不适用于大多数中小分子抗原。

选择性沉淀法：（1）核酸去除法：核糖核酸降解法更简便。

（2）盐析法：常采用硫酸铵使蛋白抗原进行粗筛、提取丙种球蛋白及抗原浓缩。

（3）有机溶剂沉淀法：常采用乙醇或丙酮。

（）聚合物沉淀法：常用非离子型聚合物，如聚乙二醇（）G凝胶过滤法：根据分子大小进行分离纯化。

离子交换层析法：利用一些带电离子基团的凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白质抗原。

5亲.和层析法：与生物分子间不同的亲和性进行分离。

如抗原和抗体、酶和酶抑制物、酶蛋白和辅酶、激素和受体等。

电泳法：蛋白质在同一环境中，分子量和电荷不同，在电场中迁移速率不同进行分离。

（三）纯化抗原的鉴定蛋白质含量测定：常用的是紫外光吸收法，该法测定和的吸光度（）值。

《临床免疫学检验》教学大纲课程类别：专业核心课程课程性质：必修英文名称：Clinical immunology examinations总学时：96 讲授学时：48 实验学时：48学分：4.5先修课程：仪器分析、人体解剖学、组织学与胚胎学、生理学、细胞生物学、病理学、病理生理学、药理学、生物化学、医学免疫学、病原生物学、医学遗传学、分子生物学、临床生物化学检验。

适用专业：医学检验技术开课单位：医学院一、课程简介临床免疫学检验是研究免疫系统功能异常与相应疾病发病机制及其诊断和防治措施的科学。

通过学习本课程，使学生获得免疫功能异常所致的病理过程及其机制以及免疫学理论和技术在疾病预防、诊断和治疗中的应用等方面的基本知识。

同时结合教学实践，培养学生分析问题和解决问题的能力以及严谨的科学作风。

二、教学内容及基本要求第一章临床免疫学与检验概论（1学时）教学内容：1.1 免疫学技术概论1.2 临床免疫性疾病及检验概论教学要求：1.了解免疫学技术在医学中地位和应用；了解免疫学技术的发展简史。

2.了解临床免疫学及其检验在医学中的作用。

授课方式：讲授第二章抗原抗体反应（1学时）教学内容：2.1 抗原抗体反应的原理2.2 抗原抗体反应的特点2.3 影响抗原抗体反应的因素2.4 免疫学检测技术的类型教学要求：1.掌握抗原抗体反应的原理。

2.掌握抗原抗体反应的特点。

3.掌握影响抗原抗体反应的因素。

4.掌握免疫学检测技术的类型。

授课方式：讲授第三章免疫原和抗体的制备（2学时）教学内容：3.1 免疫原的制备3.2 免疫血清的制备3.3 单克隆抗体的制备3.4 基因工程抗体的制备教学要求：1.掌握颗粒性抗原的制备和半抗原的制备；了解可溶性抗原的制备。

2.掌握免疫血清的制备。

3.掌握单克隆抗体的概念；掌握B细胞杂交瘤技术的基本原理。

4.掌握基因工程抗体的概念；了解基因工程抗体的制备。

授课方式：讲授第四章凝集反应（2学时）教学内容：4.1直接凝集反应4.2间接凝集反应4.3抗球蛋白试验教学要求：1.掌握直接凝集反应的原理和应用。

一：名词解释1免疫学（immunology）：是研究免疫系统的结构与功能，并通过对其在免疫应答过程中所产生的免疫保护与免疫损伤机制的研究，探讨有效的免疫措施，实现以防病，治病为目的的一门现代医学科学。

2免疫球蛋白（immunoglobulin）：是B细胞经抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等液体中，约占血浆蛋白总量的20%，IgG能与相应抗原特异性结合，执行体液免疫功能。

3补体（complement）：是存在于人和脊椎动物血清与组织液中一组经活代后有酶活性的蛋白质，包括30余种可溶性蛋白和膜结合蛋白，故称为补体系统。

4细胞因子（cytokine）：是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的总称。

大多数细胞因子是低分子量的蛋白或糖蛋白。

5临床免疫学（clinical immunology）：是将免疫学基础理论，临床疾病与免疫学技术相结合，用于研究疾病的免疫病理机制，诊断与鉴别诊断，评价治疗效果和判断预后的多个分支学科的总称。

6亲和性（affinity）：是指抗体分子上的一个抗原结合点与一个相应抗原表位之间的结合强度，抗原抗体的亲和性取决于两者空间构型的互补的程度。

7亲和力（avidity）：是指一个完整抗体分子的抗原结合部位与若干相应抗原表位之间的结合强度，亲和力与亲和性，抗体的结合价，抗原的有效抗原表位数目有关。

8免疫原（immunogen）：是指能诱导机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。

9半抗原（hapten）：是指仅有抗原性而无免疫原性的物质。

10免疫佐剂（immunoadjuvant）：预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型，简称佐剂。

11凝集反应（agglutination reaction）：是指细菌和红细胞等颗粒性抗原或表面包被可溶性抗原的颗粒性载机与相应抗体特异性结合后，在适当电解质存在下，出现肉眼可见的凝集现象。

检验科免疫室检验项目介绍免疫学是研究机体对抗感染、肿瘤和自身免疫疾病等相关免疫反应的学科。

在医学领域中，免疫学在临床诊断和治疗方面起到了重要的作用。

检验科免疫室是一种具备先进设备和技术，可以进行免疫学检验的专门实验室。

免疫学检验是通过检测机体的免疫反应、抗体和细胞因子等指标来评估机体的免疫状态和判断是否存在免疫相关的疾病。

在免疫室中，进行免疫学检验需要掌握一系列的技术和方法，以确保准确的检测结果并为临床提供可靠的依据。

检验项目分类1.免疫系统功能检测–淋巴细胞亚群分析：通过流式细胞仪等设备检测T细胞、B细胞和NK 细胞等亚群的数量和比例，评估机体免疫系统的功能状态。

–免疫球蛋白测定：检测血清中的免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM等）的水平，评估机体的免疫功能。

2.自身免疫病检测–自身抗体检测：检测血清中是否存在抗核抗体、抗磷脂抗体等，用于早期诊断和监测自身免疫疾病（如系统性红斑狼疮、抗磷脂抗体综合征等）的发展。

–自身抗原检测：通过检测血液或其他组织中的自身抗原（如RF、ANCA等）的水平，用于诊断和评估自身免疫性疾病。

3.传染病相关检测–病原体抗体检测：通过检测血清中的病原体特异性抗体，如HIV抗体、乙肝病毒抗体等，用于确认感染病原体和分析感染状态。

–免疫反应性蛋白检测：通过检测病原体特异性的免疫反应蛋白（如流感病毒抗原、白喉杆菌抗原等），用于早期诊断和监测传染病的发展。

具体检验技术1.免疫层析法–检测原理：利用抗体与抗原发生特异性结合反应，通过检测反应后的彩色条带来判断样本中抗原或抗体的存在与浓度。

–应用范围：常用于一些便携式检测仪器或试纸上，应用于快速检测一些常见的传染病等。

2.酶联免疫吸附试验（ELISA）–检测原理：利用酶标抗体或酶标抗原与待测物特异性结合，通过底物的化学反应生成染色产物，利用光密度计读取并判断待测物的浓度。

–应用范围：广泛应用于抗体和抗原的检测，如HIV抗体检测、肿瘤标志物检测等。

临床检验主管检验师临床免疫学和免疫检验—临床免疫检验的质量保证复习资料汇编临床实验室的测定数据是为患者疾病的诊疗或临床实验研究服务的，因而为保证患者临床诊疗或临床实验研究的有效性，就要求临床实验室采取一系列有效的措施证明其测定数据能够达到所确定的质量标准，这就是质量保证的内容，涵盖了实验室内进行的涉及临床检测的所有活动。

第一节概述一、与质量保证相关的定义1.质量保证（QA）：为一产品或服务满足特定的质量要求提供充分可信性所要求的有计划的和系统的措施。

2.室内质量控制（IQC）：由实验室工作人员采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本室常规工作的精密度，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，并确定当批的测定结果是否可靠，可否发出检验报告。

3.室间质量评价：为客观地比较某一实验室的测定结果与靶值的差异，由外单位机构，采取一定的方法，连续、客观地评价实验室结果，发现误差并校正结果，使各实验室之间的结果具有可比性。

4.准确度：待测物的测定值与其真值的一致性程度。

准确度不能直接以数值表示，通常以不准确度来间接衡量。

对一分析物重复多次测定，所得均值与其真值或参考靶值之间的差异亦即偏倚即为测定的不准确度。

5.偏倚：待测物的测定值与一可接受参考值之间的差异。

偏倚又分批内偏倚和批间偏倚，批内偏倚反映的是该批测定的系统误差，如校准不准、非特异显色等。

批间偏倚所反映的问题要更大一些，如试剂或校准物变质所致的误差。

6.精密度：在一定条件下所获得的独立的测定结果之间的一致性程度。

与准确度一样，精密度同样也是以不精密度来间接表示。

测定不精密度的主要来源是随机误差，以标准差（SD）和（或）变异系数（CV）具体表示。

SD或CV越大，表示重复测定的离散度越大，精密度越差，反之则越好。

准确度好的实验，其精密度不一定好；准确度差的实验，其精密度则不一定差；反之亦然。

7.重复性条件：是指在短的间隔时间内，在同一实验室对相同的测定项目使用同一方法和同一仪器设备，由相同的操作者获得独立的测定结果的条件。

临床免疫学检验1、免疫：是机体识别和排斥抗原性异物的一种生理功能2、免疫防御(对外）；免疫自稳（防自身免疫病）；免疫监视（防肿瘤）。

3、中枢免疫器官：骨髓、胸腺；外周免疫器官:淋巴结、脾脏(最大)、黏膜相关淋巴组织4、B细胞：通过识别膜免疫球蛋白来结合抗原，介导体液免疫；B细胞受体=BCR=mIg表面标志：膜免疫球蛋白(SmIg)、Fc受体、补体受体、EB病毒受体和小鼠红细胞受体.成熟B细胞:CD19、CD20、CD21、CD22 （成熟B细胞的mIg主要为mIgM和mIgD）同时检测CD5分子，可分为B1细胞和B2细胞。

B细胞功能检测方法：溶血空斑形成试验（体液免疫功能）。

5、T细胞：介导细胞免疫。

共同表面标志是CD3（多链糖蛋白）；辅助T细胞的标志是CD4；杀伤T细胞的标志是CD8；T细胞受体=TCR。

T细胞和NK细胞的共同表面标志是CD2（绵羊红细胞受体）;CD3＋CD4＋CD8－ = 辅助性T细胞（Th）CD3＋CD4－CD8＋ = 细胞毒性T细胞（Tc或CTL）(T细胞介导的细胞毒试验）CD4＋CD25＋ = 调节性T细胞（Tr或Treg)T细胞功能检测：植物血凝素（PHA）刀豆素（CONA）刺激T细胞增殖。

增殖试验有：形态法、核素法.T细胞亚群的分离:亲和板结合分离法,磁性微球分离法,荧光激活细胞分离仪分离法*E花环试验是通过检测SRBC受体而对T细胞进行计数的一种试验；6、NK细胞：具有细胞介导的细胞毒作用。

直接杀伤靶细胞(肿瘤细胞和病毒感染的细胞）表面标志：CD16（ADCC）、CD56。

测定人NK细胞活性的靶细胞多用K562细胞株，而测定小鼠NK细胞活性则常采用YAC—1细胞株。

7、吞噬细胞包括：单核-吞噬细胞系统（MPS，表面标志CD14，包括骨髓内的前单核细胞、外周血中的单核细胞和组织内的巨噬细胞）和中性粒细胞。

（表达MHCⅡ类分子）8、人成熟树突状细胞（DC）(专职抗原呈递功能）：表面标志为CD1a、CD11c和CD83。

临床免疫血清学专业检验项目
1.免疫球蛋白测定：通过检测血浆中的IgG、IgM、IgA等免疫球蛋白，判断机体的免疫状态，诊断免疫相关疾病。

2. 细胞免疫功能检测：通过检测外周血淋巴细胞亚群、NK细胞活性、T细胞功能等指标，评估机体的细胞免疫功能。

3. 自身抗体检测：通过检测血清中的自身抗体，诊断自身免疫性疾病。

4. 特殊免疫检测：包括肿瘤标志物检测、风湿因子检测、抗核抗体检测等，用于辅助诊断肿瘤和风湿性疾病。

5. 免疫荧光检测：通过荧光显微镜观察患者的组织或细胞中的自身抗体或抗原，诊断自身免疫性疾病和感染性疾病。

6. 免疫电泳：通过电泳分离血清中的蛋白质，检测免疫球蛋白的数量和种类，诊断免疫相关疾病。

以上是临床免疫血清学专业检验项目的主要内容，这些检测项目能够为临床诊断和治疗提供重要的帮助和参考。

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临床免疫学检验一、免疫球蛋白检测•概念：免疫球蛋白（Ig）是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称。

由浆细胞产生，存在于机体的血液、体液、外分泌液和某些细胞的膜上。

（一）分类•按重链性质分:IgG、IgA、IgM、IgD 、 IgE、IgG•于出生后三个月开始合成， 3—5岁接近成人水平。

IG是血液中含量最高的Ig，占血清总Ig的75%—80%，是抗感染的主要抗体。

是唯一能通过胎盘的抗体。

IgA：分为分泌型和血清型，分泌型的合成和分泌部位在肠道、呼吸道、乳腺、唾液腺和泪腺，血清型占总Ig的10—20%。

IgM：是分子量最大的Ig。

占血清Ig的5-10%。

是个体发育过程中最早出现的抗体，在胚胎发育晚期的胎儿即能产生IgM。

在机体受抗原刺激后，是最先产生的抗体。

IgM是血管内抗感染的主要抗体。

IgE:是正常人血清中含量最少的Ig。

约0.1—0.9mg/L。

占总血清Ig的0.02%，为亲细胞抗体。

参与Ⅰ型超敏反应,与变态反应、寄生虫病及皮肤过敏有关。

（四）临床意义⒈免疫球蛋白增高•（1）单克隆免疫球蛋白增高（M蛋白血症）IgG、IgA 、IgD 或IgE增高。

见于：多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症.淋巴样异常增生性疾病等。

•（2）多克隆免疫球蛋白增高•①感染：特别是慢性感染如细菌、寄生虫、螺旋体感染，IgG、IgM增高②自身免疫性疾病：SLE以IgG、IgA或IgG、 IgM增高多见，类风关以IgM增高为主③慢性肝病：IgG、 IgA 、IgM可增高，慢活肝IgG、IgM增高明显⑶IgD增高：见于IgD型多发性骨髓瘤、妊娠末期、大量吸烟者•⑷IgE增高：见于IgE型多发性骨髓瘤、变态反应性疾病、寄生虫病及皮肤过敏、急慢肝、肾综⒉免疫球蛋白减少IgG＜6.0g/L，IgM、IgA＜0.4g/L（1）先天性：见于先天性无丙种球蛋白血症、先天无胸腺症•（2）获得性：见于大量蛋白丢失性疾病：肾综、剥脱性皮炎中毒性骨髓病、白血病、淋巴网状系统肿瘤：淋巴瘤、霍奇金病长期使用免疫抑制剂⑶Ig减少易引起反复感染•IgG缺乏：易患化脓性感染•IgM 缺乏：易患革兰氏性阴败血症•IgA缺乏：易患呼吸道感染二、血清M蛋白检测⏹ M蛋白是一种单克隆B淋巴细胞异常增殖时产生的，具有相同结构和电泳迁移率的免疫球蛋白分子或其分子片段。

基金项目：　吉首大学独立实验课程建设基金资助项目（ＪＤＤＬ２０１８００３）；大学生校外实践教育基地开放基金资助项目（２０１７ＪＳＵＪＤ０５２）作者简介：　郭靖，女，１９７９－０６生，博士，讲师，Ｅ ｍａｉｌ：ａｌｉｃｅｇｊ＠１６３．ｃｏｍ收稿日期：　２０２０－０８－０１临床免疫学检验教学实践与反思郭　靖，王晓红，罗开军　（吉首大学医学院免疫学教研室，　吉首　４１６０００）摘要：　临床免疫学检验是医学检验专业最重要的课程之一，该学科近年来在临床上的地位也越来越高。

随着社会的进步，对人才的要求也越来越严苛。

因此，学生培养过程中遇到的问题应引起高度重视。

教师要有丰富的理论及临床知识；培养的学生不仅要掌握理论知识，还需要与临床紧密联系，重视实验教学及考核，全面提高动手能力。

文章结合笔者实际教学经历对临床免疫学检验的教学提出几点想法。

关键词：　临床免疫学检验；　实验教学；　教学考核中图分类号：　Ｒ３９２　文献标志码：　Ａ　文章编号：　２０９５－１４５０（２０２０）１１－０８０９－０３　ＤＯＩ：１０．１３７５４／ｊ．ｉｓｓｎ２０９５－１４５０．２０２０．１１．０８ 医学检验专业是建立在科学实验基础上的临床医学专业学科，又称为实验室医学，是实验室科学技术与临床医学相结合的一门专业［１，２］。

临床免疫学检验是医学检验专业重要的专业课之一。

检验专业的特点之一就是技术日新月异，因此，临床免疫学检验的理论教学和实验教学也需要与时俱进，传递新技术的理论与专业实践。

我国医学检验本科学制从５年减为４年，以突出该专业的应用型医学检验专业人才的培养目标［３，４］。

我校自２０１５年开始招收临床检验技术专业学生，２０１７年春季开设医学免疫学，秋季开设临床免疫学检验技术。

这两门课程均由免疫学教研室教师承担。

由于免疫学检验专业方向师资力量薄弱，在理论教学和实验教学过程中存在诸多问题。

针对存在的问题，教研室教学团队积极学习先进院校的教学经验，努力优化课程内容，加强检验实践技能考核。

临床检验项目满足临床需要
一、按照《医疗机构临床实验室管理办法》的要求，全院临床实验室集中设置，统一管理，资源共享。

检验科设有临床检验室、生化检验室、免疫检验室、微生物检验室、细胞室等。

二、现有7名具备丰富经验的专业技术人员。

三、按照卫生部印发《医疗机构临床检验项目》的通知，常规开展检验项目近400项，具有前沿性，能够保证疑难疾病的诊断，基本覆盖医院各临床科室所诊治的病种，包括临床输血学、临床血液学、临床化学、临床免疫学、临床微生物学，分子生物学等。

1、开展人8。

血型鉴定、Rh（D）血型鉴定和不规则抗体检查。

2、开展各种标本（血液、尿液、粪便、痰液、脑脊液、浆膜腔积液、精液、阴道分泌物等）的物理、化学、涂片检查；开展血常规、溶血、骨髓细胞形态（组化、免疫分型）、凝血、血流变等试验；血常规检查有镜检标准，镜检有记录并报告。

3、临床化学检测包括：蛋白、酶类、脂类、电解质、激素、血气等，有危急值报告制度。

4、临床免疫检测包括：体液免疫、细胞免疫、病原体血清学、肿瘤标志物、自身抗体、特定蛋白等，传染病三项ELISA法以酶标仪比色测定结果，保存原始记录。

5、临床微生物检测：开展项目包括涂片、培养、鉴定、药敏等试验及耐药性的检测、常见细菌鉴定要求到种，药敏试验用药的选择有制度和依据，细菌培养阳性率A30%。

6、参加省临检中心室间质评的血细胞分析、尿干化学、细菌鉴定和药敏、生化25项、免疫（乙肝五项、丙肝抗体、HIV抗体）、凝血等项目年年优秀，均获得质评合格证书。

附：检验科检测项目列表。

临床免疫学检验技术名词解释、问答部分名词解释1.Antigen and antibody reaction(抗原抗体反应):是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。

它既可以发生在体内，也可以发生在体外。

2.Zone of equivalence(等价带)：抗原抗体反应曲线的高峰部分是抗原抗体分子比例合适的范围，成为抗原抗体反应的等价带。

在此范围内，抗原抗体充分结合，沉淀物形成快而多。

3.McAb：monoclonal antibody：单克隆抗体：是指仅识别单一抗原表位的B杂交瘤细胞产生的同源抗体，具有特异性强、效价高、生物活性单一、理化性状高度均一等特点。

4.PcAb：polyclonal antibody：多克隆抗体：含有多个抗原表位的抗原物质刺激机体免疫系统时，体内多个B细胞克隆可被活化，产生的抗体为多克隆抗体。

5.Genetic engineeling antibody:基因工程抗体:是指应用DNA重组及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同的需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体，主要包括人源化抗体、小分子抗体、双价特异性抗体和抗体融合蛋白等类型。

6.Adjuvant：佐剂：是指先于抗原或与抗原一起注入机体，能够增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的物质。

7.滴度(效价)：血清标本进行一系列倍比稀释后进行反应，以出现明显凝集反应的血清最高稀释度、即滴度。

8.凝集反应：是指细菌或红细胞等颗粒性抗原与相应抗体在适当条件下结合形成的凝集现象。

现也指颗粒性抗原或抗体与相应抗体或抗原的反应。

9.Precipitation：沉淀反应：是指可溶性的抗原和抗体特异性结合后，所形成的复合物以沉淀的形式出现。

10.Fluorescence dyked：荧光淬灭：指荧光分子在某些理化作用下，荧光分子的辐射能力受到激发光较长时间的照射后会减弱的现象。

11.Stokes位移:相同电子跃迁在吸收光谱和发射光谱（如荧光光谱）中最强波长间的差。