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ＲＮＡｉ技术在植物基因功能研究中的应用摘要RNAi技术是研究基因功能的重要工具。
其原理是对某个已知基因，设计诱导其沉默的dsRNA，通过合适手段导入细胞或机体使产生干涉效应的信号分子siRNA，导致基因表达水平下降或完全沉默。
通过基因表型变化，鉴定该基因功能。
从RNAi的研究背景和作用机制出发，对近年来利用RNAi技术研究植物基因功能的概况、诱导方法和载体作一综述。
关键词基因沉默；RNAi技术；植物基因功能1RANi的研究背景1998年，Fire等[1]发现，过去利用正反义RNA阻断基因表达都是因体外制备的单链RNA中污染极少量双链RNA（dsRNA）所引起的，并发现在线虫中导入dsRNA，mRNA明显减少，推论存在某种机制特异地破坏降解内源mRNA，导致某个基因沉默，即转录后基因沉默（PTGS）。
在此情况下，启动子是活跃的但不能正常积累mRNA。
这种现象被称为RNA干涉（RNAi）。
研究表明RNAi 现象广泛存在大多数真核生物中，起到自行监控细胞中异常的mRNA、封闭该基因表达、抵御病毒感染及阻断转座子的作用。
RNAi技术是将人工合成或载体表达的小的双链RNA（siRNA）导入真核细胞，促使内源RNA降解，高效特异阻断体内特定基因的表达，诱使细胞表现出特定基因缺失表型，获得功能丧失或降低的突变体。
RNAi技术具有高度的特异性和高效的干扰活力，是研究基因功能的强有力的工具而被广泛应用。
2RNAi的作用机制对模式生物的研究发现[2]，生物体内外源或内源的dsRNA经酶切，可形成具有5’末端磷酸基、3’末端羟基和2个突出的单链核苷酸的信号分子siRNA，诱发RNAi机制。
最近研究中还发现，在植物中除了转录后水平沉默（PTGS），RNAi也能在基因的转录水平（TGS）上发挥作用。
2.1酶的作用参与RNAi发生的Dicer酶特异识别dsRNA，该酶依赖ATP，能将转基因和病毒感染等引入的dsRNA，逐步切割成含21-23个核苷酸siRNA，启动细胞内RNAi反应。
棉花VIGS流程棉花VIGS（病毒诱导基因沉默）是一种利用RNA干扰技术抑制植物宿主的基因表达的方法。
该技术可用于研究棉花病毒感染机制、病原菌-植物相互作用以及棉花基因功能的研究等。
下面是棉花VIGS流程的详细说明。
1. 构建病毒载体：选择适合的病毒载体是进行VIGS实验的第一步。
常用的病毒载体有烟草花叶病毒（Tobacco rattle virus，TRV）和番茄花叶病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）等。
将所需的人工合成的DNA片段插入病毒载体的适当位点，构建具有目标基因片段的病毒载体。
2.复制病毒载体：将构建好的病毒载体DNA转化到感受性细菌中，经过培养和筛选，得到大量的病毒载体。
3.植株接种：选择棉花的适合发育阶段的幼苗，对其进行病毒接种。
通常是在两片真叶之间的叶片表面用注射器注入病毒载体溶液。
同时将一部分棉花叶片用水作为对照组。
4.观察和记录：在接种后的一段时间内，观察和记录棉花植株的表型变化，如叶片的颜色，形态，生长状态等。
通常观察时间为接种后的7-14天。
5.提取RNA：在观察期结束后，选择受病毒感染的病株和对照组的叶片，将其快速冻结并粉碎。
通过RNA提取试剂盒等方法，从样品中提取总RNA。
6.制备cDNA：将提取的总RNA进行逆转录反应，合成cDNA。
逆转录反应需使用逆转录酶和随机引物。
7. 多重PCR（Polymerase Chain Reaction）：设计特异性引物，使用cDNA作为模板进行PCR反应，以检测目标基因的表达水平。
PCR反应条件和循环数根据具体实验设计进行调整。
8.分析PCR产物：将PCR产物进行凝胶电泳，用琼脂糖凝胶作为分离介质，通过电场作用将PCR产物分离开。
将凝胶置于紫外线扫描仪下进行鉴定和定量分析。
9.数据分析：根据PCR产物的大小和强度，分析棉花基因表达水平的变化。
与对照组相比，表达量较低的PCR产物对应的基因受到了抑制。
RNA干扰技术的应用前景一、简介RNA干扰技术是一种通过介导特定RNA序列降低或抑制目标基因表达的方法。
它通过引入外源性双链RNA（dsRNA）分子，激活内源性RNA干扰机制，从而导致靶向特定mRNA的降解和靶标基因的沉默。
这一技术已经被广泛应用于基础生物学研究和生物医学领域，取得了重要的突破。
本文将探讨RNA干扰技术的应用前景。
二、农业领域1.提高农作物抗性通过应用RNA干扰技术，我们可以有效地靶向关键基因进行沉默，从而提高农作物对病原体、害虫和环境胁迫的抵抗力。
例如，靶向病原性真菌基因的RNA干扰技术可以有效抑制病害的传播，提高农作物的产量和品质。
2.调控农作物发育RNA干扰技术可以通过沉默植物内源性基因的表达，实现对农作物发育的精确调控。
这种技术可以用于改善农作物的大小、形状、颜色等特征，从而提高农作物的市场竞争力。
三、医学领域1.基因治疗RNA干扰技术在基因治疗中具有重要意义。
通过针对特定基因的干扰，可以有效地治疗一些遗传性疾病，如囊性纤维化、遗传性视网膜病变等。
此外，RNA干扰技术还可以抑制癌基因的表达，达到抗癌治疗的效果。
2.药物研发RNA干扰技术可用于药物的研发。
通过靶向特定基因的RNA干扰，可以筛选出具有特定治疗效果的候选药物。
这种技术可以促进药物的研发进程，提高新药的研发成功率。
四、病毒学研究RNA干扰技术在病毒学研究中起到了重要的作用。
通过利用RNA干扰技术，可以有效地抑制病毒的复制和传播，从而开发出新的抗病毒药物。
此外，RNA干扰技术还可以用于研究病毒的生命周期和致病机制，为病毒学研究提供了有力的工具。
五、遗传学研究RNA干扰技术在遗传学研究中的应用也愈发重要。
通过靶向特定基因的RNA干扰，可以对基因功能进行研究，揭示基因在生物体内的作用机制。
此外，RNA干扰技术还可应用于基因组学和转基因研究等领域。
六、总结RNA干扰技术作为一种先进的基因沉默技术，具有广泛的应用前景。
它在农业领域可以提高农作物抗性和调控农作物发育；在医学领域可以应用于基因治疗和药物研发；在病毒学研究领域可以用于抗病毒药物开发；在遗传学研究中可以揭示基因功能等。
RNA干扰在植物保护和生产上的应用RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种基因调控机制，能够通过特定的RNA分子干扰位于靶基因上的mRNA从而抑制基因的表达。
这种技术被广泛应用于植物保护和生产领域，已经成为植物科学研究和生产应用的重要工具。
一、 RNA干扰的基本原理和机制RNA干扰主要由两种RNA分子产生，即小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）。
这两种RNA分子都是由长链RNA（long RNA）分解而来，具有一定序列特异性，可以在靶基因的mRNA上结合并引发剪切作用或翻译抑制。
其中siRNA是由外源基因体系合成的双链RNA，在细胞内切割成20-25个核苷酸左右的小片段，具有强烈的靶向特异性；而miRNA主要来自内源基因体系的一些片段，在细胞内成熟后与Dicer、Argonaute等核酸酶结合成miRNA-RISC复合物，介导靶基因的翻译抑制。
RNA干扰的机制基于RNA分子的序列互补性。
当siRNA或miRNA与mRNA的互补序列匹配时，这些RNA分子就能与mRNA形成二级结构。
对于siRNA，主要与RNA诱导沉默复合物（RISC）结合后，介导靶mRNA的核糖核酸水解降解或翻译抑制；而对于miRNA，主要与miRNA-RISC复合物结合后介导靶mRNA 的翻译抑制。
这些过程都基于精确的靶向识别和序列匹配。
二、 RNA干扰在植物保护领域的应用RNA干扰技术在植物保护领域的应用有很多，其中包括基因沉默和基因免疫两方面。
基因沉默是指通过RNA干扰抑制目标基因的表达，从而影响其功能，如在植物中控制瘟疫病、白粉病等病害的基因沉默研究；而基因免疫则是指利用RNA干扰技术提高植物抵御病害的能力，如在植物中引入外源siRNA和miRNA靶向病毒、细菌等病原体的研究。
例如，基于RNA干扰技术研究的棉铃虫宿主植物基因GhPDS，能够减少布氏杆菌及其内毒素致病的危害。
棉花microRNA功能研究进展刘玉姣;裘波音;王汐妍;徐晓建;祝水金;陈进红【摘要】MicroRNAs(miRNAs)是一类重要的基因表达调节因子,在植物生长发育、逆境胁迫应答等方面起到重要作用.随着深度测序技术的广泛应用,棉花(Gossypium hirsutum)中miRNAs的功能探究成为目前的研究热点.文章主要综述了miRNAs在棉花生物和非生物逆境应答、纤维发育、形态建成方面的功能,并对今后的发展方向和重点作了展望.%MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression, and play essential roles in plant growth and development, response to adversity stress, etc.With the extensive application of deep sequencing technology, the function of miRNAs in cotton (Gossypium hirsutum) miRNAs has become a hot research topic.In this paper, the function of miRNAs in response to biotic and abiotic stress, fiber development and morphogenesis were reviewed.Eventually, the future research direction and emphasis were looked forward.【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2017(029)006【总页数】7页(P1050-1056)【关键词】miRNAs;棉花;逆境胁迫;纤维发育【作者】刘玉姣;裘波音;王汐妍;徐晓建;祝水金;陈进红【作者单位】浙江大学农业与生物技术学院/浙江省作物种质资源重点实验室,浙江杭州 310058;温州科技职业学院,浙江温州 320056;浙江大学农业与生物技术学院/浙江省作物种质资源重点实验室,浙江杭州 310058;浙江大学农业与生物技术学院/浙江省作物种质资源重点实验室,浙江杭州 310058;浙江大学农业与生物技术学院/浙江省作物种质资源重点实验室,浙江杭州 310058;浙江大学农业与生物技术学院/浙江省作物种质资源重点实验室,浙江杭州 310058【正文语种】中文【中图分类】S562MicroRNAs(miRNAs)是一类具有调控功能的内源非编码单链小分子RNA，长度一般为20～24 bp，通过碱基互补配对的方式识别靶标mRNA，通过诱导靶基因的切割降解或抑制翻译来调控靶基因的表达[1]。
RNA干扰在植物抗病中的应用研究RNA干扰是一种基于寡核苷酸分子的基因沉默技术。
近年来，随着生命科学的发展，RNA干扰技术已经成为研究细胞、分子和基因功能的重要工具。
同时，RNA干扰技术具有很强的应用价值，目前已被广泛应用于植物、动物和微生物的研究中。
其中，RNA干扰在植物抗病中的应用研究更是备受关注。
RNA干扰首先被发现是在植物中的，因此，RNA干扰技术在植物领域的应用比其他领域要广泛得多。
RNA干扰技术是通过RNA介导的靶向基因沉默来实现抗病的。
RNA干扰技术主要有两种方式：一种是由小RNA在转录后切割RNA分子来实现靶向基因沉默；另一种是通过RNA介导的DNA甲基转移来沉默靶向的基因。
这两种方法都可以在植物抗病的研究中得到应用。
RNA干扰技术在植物病害抗性中的应用，不仅可以用于研究分子机制，还可以用于筛选侵染物敏感性基因、抗性基因和与植物与侵染物互作的信号通路分子。
目前，越来越多的研究人员使用RNA干扰技术来探究植物是否具有抗病性，以及如何提高植物的抗病能力。
除此之外，RNA干扰技术还可以用于解析病原体对植物产生的作用，并且可以防止某些病原体进攻植物。
例如，很多植物病原体会通过靶向寄主植物的抗性基因，来降低植物的抗病性。
通过利用RNA干扰技术来沉默这些病原体会降低植物感染的机会，从而提高植物的抗病能力。
RNA干扰技术在植物抗病中的应用研究还可以用于改良植物的基因组。
通过RNA干扰技术沉默抗病基因，可以将这些基因靶向到植物的某个特定部位，从而影响植物的生长和发育。
这种方法可以促进植物的进化，并且促使植物抵御更多的病害。
总结来说，RNA干扰技术是一种重要的基因沉默技术。
RNA干扰技术不仅可以用于研究植物与病原体的互作关系，而且还可以用于提高植物的抗病能力。
随着技术的不断改进和发展，RNA干扰技术在植物抗病中的应用前景将不断得到拓展。
基因干扰（RNAi）是一种在动物、植物和微生物中高度保守的基因表达调控工具。
1998年，Fire等首次在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中证明了触发基因沉默的关键因子是双链RNA（dsRNA），而非单链RNA。
具体而言，dsRNA被Dicer-like蛋白随机剪切成长度为21～24 nt的小RNA （siRNA或miRNA），siRNA与Argonaute蛋白（AGOs）结合形成RNA 诱导的沉默复合体（RISCs），该复合体与目标RNA链互补，诱导mRNA降解或抑制翻译进程。
利用RNAi技术靶向有害生物的必须基因，实现高效的基因沉默，可有效控制病虫害的发生。
基于RNAi技术创制的新型核酸农药被称为农药史上第三次革命，与传统化学农药相比，具有靶向性高、易降解、靶点丰富及可灵活设计等优势。
目前，RNAi在植物病虫害防控领域的应用主要通过4种途径实现（图1）：（1）HIGS，即培育表达dsRNA的转基因植物以防治病虫害；（2）VIGS，即利用病毒或微生物表达和递送靶标生物dsRNA 的方法；（3）SIGS，即创制喷洒型RNA农药，直接喷施于植物表面以控制病原菌和害虫；（4）NDGS，即利用纳米载体递送dsRNA以诱导靶标基因沉默的方法。
图1 RNAi在植物病虫害防控领域的4种应用策略示意图本文介绍了以RNAi为核心的病虫害防治技术的研究现状，分别论述了基于HIGS、VIGS、SIGS和NDGS策略的RNAi技术用于防治植物病虫害的应用实例及商业化情况，并对核转基因技术培育转基因作物和创制喷洒型RNA 农药的瓶颈问题进行总结，点明了叶绿体介导的RNAi技术和纳米载体递送dsRNA策略的优势。
dsRNA的合成成本、保护剂和载体制备工艺、转基因植物和载体的生物安全性评估，仍然是未来在研发和商业化生产中需要关注的问题。
01利用HIGS策略防控病虫害1.1 核转基因技术的应用研究人员已成功实现利用转基因植物表达调控病虫害生长发育关键基因dsRNA，降低靶基因的表达量，导致靶标生物死亡或发育畸形，从而控制病虫害发展的策略。
