下载文档原格式
家兔关节软骨细胞的分离与培养实验动物3周龄新西兰大白兔实验试剂胎牛血清, 胰蛋白酶, II型胶原酶, 台盼蓝, DMEM培养基, 甲苯胺蓝染色剂主要试剂配制方法一NaCI 克KCI 克KH2PO3 克Na2HPO3·12H2O 克精确称量上述药品并充分溶解于1000mL三蒸水中，用1mol/L HCI和1mol/L NaOH溶液调整pH值至一。
培养液将DMEM干粉一包溶于1O00mL三蒸水中，按说明书加入NaHCO3，并加入双抗(终浓度为:青霉素100U/mL，链霉素100U/mL)和维生素C(终浓度为:50mg/L)，调节PH到一，超净工作台内过滤除菌。
置一200C冰箱保存备用。
如需含血清的培养基，于使用前加入足量56℃水浴灭活30分钟的胎牛血清(FCS)。
.主要实验仪器倒置显微镜, 数码照相机, 二氧化碳培养箱(2300型),超净工作台(SW-CJ一IF型), 低温离心机型),电子天平(MAllo型)磁力搅拌器.2方法.兔关节软骨细胞的培养与传代将一只健康的三周龄新西兰大白兔耳缘静脉空气栓塞处死，备皮，用碘酒消毒背部及四肢皮肤，在无菌操作下，在超净工作台内用手术刀削下双侧膝关节软骨，以不渗血为度。
充分漂洗软骨小块。
用眼科剪将软骨组织剪成约lmm3小的碎块，收集置于离心管中，以PBS冲洗2次，向离心管加10一巧mLO.%胰酶。
吹打成组织悬液，装入50mL玻璃培养瓶。
放进二氧化碳培养消化1时。
消化后将培养瓶静置桌上，待软骨组织沉淀后，吸出胰蛋白酶。
将配好型胶原酶10mL以滤器过滤入培养瓶，加入胎牛血清。
放进二化碳培养箱消化4一6小时。
细胞从基质中释放于消化液中，经过滤除去未被消化的软骨碎片，将消化液置于离心管中100orpm、10min离心，弃上清液收集软骨细胞，加DMEM液，1000印m、10而n离心，冲洗2次，弃上清液，加入上述细胞培养液(含10%FBS的青霉素、链霉素的DMEM培养液)制成细胞悬液，滤网过滤，血球计数板计数，并把细胞悬液稀释成2x105/c时的密度，接种于25c衬的培养瓶中，血球记数板计数。
·论著·利用P L A、P G A、P L G A三种支架再生兔关节软骨陈哲峰范卫民刘峰【摘要】目的观察兔关节软骨细胞在聚乳酸(P L A),聚羟基乙酸(P G A),以及两者的共聚物P L-G A三种三维支架上的贴附和生长情况,利用组织工程技术培养工程化关节软骨。
方法多聚赖氨酸包埋P L A,P G A,P L G A三维细胞支架。
分离培养兔关节软骨细胞,体外扩增后种植到三种支架中。
在体外培养软骨细胞一支架复合物,4周终止培养,进行H E、M a s s o n组织学染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。
结果(1)体外培养发现,软骨细胞在P L G A支架材料内贴附生长良好,长期培养仍保持软骨细胞特性,其贴附生长能力,分泌Ⅱ型胶原能力较P G A,P L A支架组强。
(2)支架经过多聚赖氨酸包埋后,软骨细胞的贴附生长及分泌Ⅱ型胶原能力均较对照组好。
结论多聚赖氨酸处理的P L G A三维支架适合软骨细胞贴附生长和分泌Ⅱ型胶原,可作为软骨组织工程的细胞载体。
【关键词】软骨细胞;细胞支架;多聚赖氨酸E x p e r i m e n t a l s t u d y o n r e g e n e r a t i o n o f a r t i c u l a r c a r t i l a g e o n P L A,P G A,P L G A s c a f f o l d b y t i s s u e e n g i n e e r i n g8/5).’2K2+,,A<);2%M%+,L I UA2+,N B2E-@3M2+3*K J@3’*E27%=Q,A%@Q3<K K%1%-327/*Q E%3-1,)-+G%+,C27%=-1U+%O2@Q%3D,)-+G%+,210029,8/I)<【A b s t r a c t】O b j e c t i v e T o s t u d y t h e a b i l i t y o f p o l y l a c t i c a c i d(P L A),p o l y g l y c o l i c a c i d(P G A),P L G A i ns u p p o r t i n g t h e g r o w t ho f r a b b i t c h o n d r o c y t e s,a n d t o r e c o n s t r u c t a r t i c u l a r c a r t i l a g eb y t i s s u e e n g i n e e r i n g.M e t h o d s C o a t e dP L A,P G A,P L G Aw i t h p o l y-l-l y s i n e,f r e e c h o n d r o c y t e s i s o l a t e d f r o m r a b b i t a r t i c u l a r c a r-t i l a g ew e r e s e e d e do n t o t h r e ek i n d s o f s c a f f o l d s a f t e r e x p a n s i o nb y i nv i t r o c u l t u r e.T h e c o m p l e xo f c e l l-s c a f f o l dw a s t h e n c u l t u r e d i n v i v o.A f t e r4w e e k s o f c u l t u r e,t h e c o m p l e xw a s a s s e s s e d b y h i s t o l o g i c a l s t a i-n i n g o fH-E a n dM a s s o n.I m m u n o h i s t o c h e m i c a l a n a l y s i sw a s p e r f o r m e d t o e v a l u a t e c o l l a g e n t y p eⅡs y n t h e-s i s.R e s u l t s(1)A r t i c u l a r c h o n d r o c y t e s w e r e w e l l d i s t r i b u t e d a n d a d h e r e d t o P G A,P L G A s c a f f o l d s a n dm a i n-t a i n e d t h e i r c h a r a c t e r i s t i c s o f a r t i c u l a r c a r t i l a g e t h r o u g h o u t t h e c u l t u r e p e r i o d.(2)C h o n d r o c y t e sw e r ew e l ld i s t r i b u te d a n d a d h e r e d t o s c af f o l d s a f t e r c o a t e dw i t h p o l y-l-l y s i n e,a n d s e c r e t e dm o r e t y p eⅡc o l l ag e n i n c o n-t r a s t t o n o n-c o a t e d s c a f f o l d s.C o n c l u s i o n P L G A s c a f f o l d c o a t e dw i t h p o l y-l-l y s i n e c a n s u p p o r t t h e c h o n d r o-c y t e p r o l i f e r a t i o nw i t hm a i n t e n a n c e o f t h e i r p h e n o t y p e,a nd c a n be s u i t a b l e c a r r i e r sf o r t i s s u e e ng i n e e r i n g o fa r t i c u l a r c a r t i l a g e.【K e y w o r d s】C h o n d r o c y t e;S c a f f o l d;P o l y-l-l y s i n e[(%-+,Q9C27(,<9,9Q32005,31(8):599S601N]由于软骨自身修复能力有限,创伤等病因导致关节软骨缺损后,常继发成为骨关节炎。
目的探讨兔软骨细胞培养方法。
方法采用胶原酶Ⅱ分段消化法从4周龄新西兰兔的关节软骨中分离出软骨细胞并进行原代和传代培养。
每日在倒置显微镜下观察细胞形态及其生长情况。
并用甲苯胺蓝异染色进行细胞表型鉴定。
结果软骨细胞形成单层的时间原代培养1周左右,传代培养约4~5天,细胞以圆形或上皮样细胞形态为主。
甲苯胺蓝染色证实细胞可合成蛋白多糖,异染反应主要集中在细胞集落样生长区,异染程度以原代培养最为显著。
结论采用本方法培养兔软骨细胞是可行的。
软骨细胞是关节软骨破坏过程中的靶细胞,研究靶细胞的变化是探索关节软骨破坏、病理和治疗的重要方法,本实验的目的是建立体外软骨细胞培养体系,为进一步实验创造条件。
1材料与方法1·3动物: 4周龄健康新西兰兔。
1·4软骨细胞的分离和培养1·4·1软骨细胞的分离步骤:I)一只健康4周龄新西兰兔脱颈处死,备皮,用碘酊酒精背部皮肤消毒,无菌操作沿背部中线剪开并剥离皮肤,更换手术器械及手套,以防碘酊等有机物污染。
(30min) II)游离并用骨剪截取膝关节,置入无菌平皿,带入超净工作台III)在超净工作台作如下操作:1)先用双抗的pbs充分漂洗,直到没有碘伏的颜色(5min),离断髌韧带,内外侧副韧带以及前后交叉韧带,切开膝关节,刮除关节周围附着的组织如肌肉、脂肪、骨膜、滑膜, pbs液充分漂洗。
2)用尖刀片充分利用软骨的弹性,削下每个关节表面的软骨,不要误带软骨下骨和骨膜,一般以不渗血为度。
3)充分漂洗软骨小块,更换洗液3次(pbs液)。
4)用眼科小剪刀剪碎至1 mm3大小,用小刮匙把软骨小块转移至小锥形瓶中。
5)加入0·2%Ⅱ型胶原酶5 ml,置磁力搅拌器上37℃消化45 min,将游离出的带有酶溶液的软骨细胞用悬液吸管吸出, 120目尼龙网筛过滤。
6)所得滤液放入一无菌离心管内, 1200 r/min离心8 min,弃上清,加入5 ml含有血清的DMEM培养液混匀以终止消化。
基本技能操作经验总结（一）家兔的给药、基本手术及相关仪器的初步使用1.家兔的捉拿【实验方法】先轻轻打开笼门，勿使其受惊，随后手伸入笼内，从头前阻拦其跑动，一只手迅速抓住兔的颈背部的皮毛，慢慢提起家兔，然后用另一只手轻轻托住臀部，尽量使兔处在舒适、放松的状态。
【注意事项】避免抓住耳朵提拿家兔，这样不但会损伤家兔的耳朵，而且易引起家兔的紧张并激起挣扎和反抗。
抓取动物时手法不当，动作过激导致家兔惊吓，产生强烈挣扎而长时间处于激动状态，大脑皮层细胞兴奋阈值增加，肾上腺素的释放，大脑中枢电位频率增高，大脑皮层运动区过度兴奋，导致麻醉效果不佳。
2.家兔的称重与放置【实验方法】兔笼放置在电子秤上，去皮。
将兔子脖子卡住兔笼头端的凹槽，盖上兔笼盖，使兔子呈趴伏状，记录数据。
压住兔笼盖和后座，将兔笼转移到操作台准备实验。
【注意事项】兔笼重量提前去皮；尽量避免头尾不对应；时刻注意压住兔笼盖，避免转移途中兔子挣脱。
3.耳缘静脉麻醉【实验方法】穿刺前准备工作：穿刺前应拔除待穿刺血管部位的兔毛，轻柔或以手指轻弹待穿刺的血管使其充血扩张，或用酒精棉球涂擦待穿刺的血管使血管扩张。
穿刺手法：左手食指和中指夹住静脉的近端，拇指绷紧静脉的远端，无名指及小指垫在下面，右手持头皮针尽量从静脉的远端刺入。
若回抽注射器有暗红色血液流出或注射时若无阻力、无隆起现象，说明针头在血管内。
移动拇指于针头上以固定针头，放开食指和中指，将药液缓慢注入，然后拔出针头，用手压迫针眼片刻。
注：本实验所用麻醉药——乌拉坦用药剂量为1000 mg/Kg。
【注意事项】1. 进针部位宜选择在耳缘静脉远心端的血管段，若穿刺失败，可向近心端前移一段再进行穿刺；2.可利用酒精棉球擦拭使耳缘静脉血管扩张，便于操作；3.静脉注射必须缓慢（大概每分钟推送5ml ），同时观察家兔肌肉紧张、角膜反射和对皮肤夹捏的反应，当这些活动明显减弱或消失时，应立即停止注射。
在注射麻醉药物时，可先用麻醉药物总量的三分之二，密切观察动物生命体征的变化，若已达到预计麻醉效果剩余药液可暂不注射，以避免麻醉过深抑制呼吸中枢导致动物死亡；4.实验动物的固定【实验方法】将动物麻醉后，仰卧位固定于手术台上，颈部伸直，口腔与气管成一直线，保持气管畅通。
第一次是1周前，把兔子（2.57kg）关在兔笼里，左侧卧位，剪刀尽量把毛剪掉，PVP消毒整个腰部臀部，助手抓住双脚，穿刺点取脊柱右边骨性突出部位（髂后棘），利多卡因局部麻醉至骨膜，左手拇指食指拎起皮肤，右手先将12号穿刺针穿过皮肤，再在左手触摸下找骨性突出部位，垂直脊柱穿刺，开始有接触骨面的粗糙感，后来穿刺过程中突破感强烈，穿刺针固定牢靠，用预先肝素湿润的20ml针筒一次即顺利抽出5ml骨髓，呈深暗红色，较稠，与外周血比较明显不同。
带到实验室经ficoll离心取单核细胞层接种培养后有细胞贴壁生长。
第二次就是今天，同一只兔子，采用乌拉坦1g/kg，耳缘静脉注射全身麻醉，麻醉效果很差，穿刺过程中兔子挣扎剧烈，增加0.5g后仍需要助手抓住双脚。
然后悲剧的事情发生了，先是穿刺右坐骨结节，操作步骤同1周前，每次穿入有突破感后，用预先肝素湿润的10ml针筒抽吸，只能抽出0.1ml左右深暗红色液体，在髂后脊上下穿刺5、6次后只抽出1ml骨髓。
浑身都在冒汗，于是决定根据文献记录，从股骨大转子沿股骨方向穿刺取骨髓。
仍然用左手食指中指摸到骨性标志，拎起局部皮肤先将穿刺针刺入皮下，再摸到穿刺点，沿股骨方向穿刺，有突破感后接针筒反复抽吸有时是干抽，最终抽出2ml左右骨髓。
继续冒汗，随即出现了文献中没有记载的方法，将兔子俯卧位，在助手帮助下用剪刀在左髂后棘部位皮肤上作1cm切口，逐层剪开组织直至暴露白乎乎的髂后棘，定位明确后用骨穿针穿刺，顺利抽出2ml骨髓后兔子突然纵声“嗷嗷”大叫，我和助手对视5秒钟，本来还想研究下穿刺的问题，只好决定今天停止这惨绝人寰的暴行，将切口缝合肌注40WU青霉素后带着寒碜的5ml骨髓撤退。
我分析今天穿刺不顺利的因素如下：1、穿刺针有突破感，但并未真正在骨髓腔内，可能太用力穿到对面骨质中去，应该慢慢退针多次试抽，也可能方向完全不对没有进入骨髓腔，应改变方向再次穿刺；2、要么局麻，要么全麻+局麻，反正乌拉坦效果不佳，或者药物过期了（已经放了1个月了），也可以重新配点来再试试。
兔软骨终板细胞的分离培养及退变模型的建立张勇;徐永清;王非;陆华拓;朱崇涛;唐辉;游永刚【期刊名称】《西南国防医药》【年(卷),期】2009(019)008【摘要】目的:体外分离单层培养兔软骨终板细胞,并通过传代建立软骨终板退变模型.方法:利用酶联合消化法分离软骨终板细胞,比较不同消化时间后,细胞收获数量及存活率,通过传代观察细胞形态变化,并应用甲苯胺蓝染色鉴定软骨终板细胞的表型.结果:Ⅱ型胶原酶消化3 h后,收获细胞数量最多,且细胞存活率最高;随着传代,软骨终板细胞由三角形逐渐向长梭形转变,蛋白多糖分泌减少,出现反分化等退变现象.结论:体外可单层培养兔软骨终板细胞,通过传代能够建立退变模型.【总页数】4页(P761-763,封4)【作者】张勇;徐永清;王非;陆华拓;朱崇涛;唐辉;游永刚【作者单位】成都军区昆明总医院全军骨科中心〈昆明医学院教学医院〉,云南,昆明,650032;成都军区昆明总医院全军骨科中心〈昆明医学院教学医院〉,云南,昆明,650032;广州军区广州总医院骨科,广东,广州,510010;成都军区昆明总医院全军骨科中心〈昆明医学院教学医院〉,云南,昆明,650032;成都军区昆明总医院全军骨科中心〈昆明医学院教学医院〉,云南,昆明,650032;成都军区昆明总医院全军骨科中心〈昆明医学院教学医院〉,云南,昆明,650032;成都军区昆明总医院全军骨科中心〈昆明医学院教学医院〉,云南,昆明,650032【正文语种】中文【中图分类】R681.5【相关文献】1.退变兔椎间盘软骨终板细胞培养及其形态学和生物学特征 [J], 屈开钛;徐永清;王非2.补阳还五汤对兔腰椎间盘退变模型中软骨终板的影响 [J], 吕存贤;吴永琴3.IL-6对体外培养的兔软骨终板细胞生物学行为的影响 [J], 叶伟;马若凡;丁悦;黄东生;陈为坚;彭焰;刘尚礼4.大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞体外自然退变模型的建立 [J], 石继祥;王拥军;施杞;周泉;孙鹏;卞琴;周重建5.兔膝关节骨性关节炎模型的建立及软骨细胞的分离、培养 [J], 赵强;王一洲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
目的探讨兔软骨细胞培养方法。
方法采用胶原酶Ⅱ分段消化法从4周龄新西兰兔的关节软骨中分离出软骨细胞并进行原代和传代培养。
每日在倒置显微镜下观察细胞形态及其生长情况。
并用甲苯胺蓝异染色进行细胞表型鉴定。
结果软骨细胞形成单层的时间原代培养1周左右,传代培养约4~5天,细胞以圆形或上皮样细胞形态为主。
甲苯胺蓝染色证实细胞可合成蛋白多糖,异染反应主要集中在细胞集落样生长区,异染程度以原代培养最为显著。
结论采用本方法培养兔软骨细胞是可行的。
软骨细胞是关节软骨破坏过程中的靶细胞,研究靶细胞的变化是探索关节软骨破坏、病理和治疗的重要方法,本实验的目的是建立体外软骨细胞培养体系,为进一步实验创造条件。
1材料与方法
1·3动物: 4周龄健康新西兰兔。
1·4软骨细胞的分离和培养
1·4·1软骨细胞的分离步骤:
I)一只健康4周龄新西兰兔脱颈处死,备皮,用碘酊酒精背部皮肤消毒,无菌
操作沿背部中线剪开并剥离皮肤,更换手术器械及手套,以防碘酊等有机
物污染。
(30min) II)游离并用骨剪截取膝关节,置入无菌平皿,带入超净工作台
III)在超净工作台作如下操作:
1)先用双抗的pbs充分漂洗,直到没有碘伏的颜色(5min),离断髌韧
带,内外侧副韧带以及前后交叉韧带,切开膝关节,刮除关节周围
附着的组织如肌肉、脂肪、骨膜、滑膜, pbs液充分漂洗。
2)用尖刀片充分利用软骨的弹性,削下每个关节表面的软骨,不要
误带软骨下骨和骨膜,一般以不渗血为度。
3)充分漂洗软骨小块,更换洗液3次(pbs液)。
4)用眼科小剪刀剪碎至1 mm3大小,用小刮匙把软骨小块转移至
小锥形瓶中。
5)加入0·2%Ⅱ型胶原酶5 ml,置磁力搅拌器上37℃消化45 min,
将游离出的带有酶溶液的软骨细胞用悬液吸管吸出, 120目尼龙
网筛过滤。
6)所得滤液放入一无菌离心管内, 1200 r/min离心8 min,弃上清,
加入5 ml含有血清的DMEM培养液混匀以终止消化。
7)1200 r/min离心5 min,弃去上清液,只留下细胞球,并加入少量含
有血清的培养液吸打后先封口置放。
8)原消化瓶中再加入0·2%Ⅱ型胶原酶5 ml,如前法消化45 min,
消化后的处理同上。
9)然后把2次消化所得的软骨细胞悬液合并在一起,台盼蓝染色检
查死亡细胞比例,血球计数板计数, 并把细胞悬液稀释成(2~3)×
105细胞/ml,接种于培养瓶中。
1·4·2原代培养:
I)将消化所得的细胞悬液以(2~3)×105细胞/ml接种于25 cm2培养瓶中,共
接种3瓶,每瓶加5 ml的细胞悬液。
II)把培养瓶置于CO2培养箱中培养(温度37℃,饱和湿度, 5%CO2, 95%空气)。
III)48 h后视细胞贴壁情况更换培养液,以后每两天更换培养液1次。
1·4·3传代培养:
I)当倒置显微镜观察软骨细胞汇合成片,长满大部分培养瓶壁后,倾去培养液,
加入0·25%胰蛋白酶2 ml,室温下静置5~10 min,
II)在倒置显微镜下若观察到细胞重新变成圆形,个别细胞开始浮游,此时应迅速而轻柔地弃去胰蛋白酶溶液而不使瓶底细胞随胰蛋白酶溶液流失。
III)重新加入新培养液,吹打细胞使其散开形成软骨细胞悬液,按前述方法分瓶培养或冻存以备用。
1·4·4软骨细胞的组织化学染色鉴定:
I)倾去培养瓶中的培养液后用生理盐水漂洗,置入10%中性福尔马林中固定
过夜。
II)70%乙醇固定20 min以除去四价铵离子,以免阻碍染色。
用0·04%甲苯胺蓝染色20 min,迅速用无水乙醇漂洗1次,空气干燥,倒置显微镜下观察摄影。
2结果
2·1倒置显微镜观察:
I)分离培养的原代软骨细胞呈圆球形,台盼蓝排斥试验示活细胞率约90%左
右。
II)悬浮12 h逐渐开始贴壁, 24 h后大部分贴壁,首先细胞伸出短小的生长突,呈扇形;扇形生长突不断扩大,细胞的两侧或三边都可伸出生长突。
III)此时细胞在倒置显微镜下呈片状贴附,形态呈梭形、或三角形、或多角形,胞浆内可见折光的颗粒,周围有细长的突起,胞核明显呈圆形或椭圆形,核仁清晰,原代培养的软骨细胞7天即可长满瓶壁,部分区域呈多层生长。
IV)在集落生长区和多层生长区细胞被分泌的基质所包埋,形成肉眼可见的结节样组织。
V)传代培养的软骨细胞一般24 h即可完全贴壁,细胞伸出伪足,充分铺展。
VI)传一代的软骨细胞5天左右即可形成单层,细胞仍以圆类、类上皮细胞样外观为主。
VII)随着传代次数的增加,细胞中梭形细胞增多,分泌和增殖能力下降,传代周期延长。
2·2甲苯胺蓝染色形态学观察:
I)原代培养的软骨细胞培养7天后染色见:单层生长区和多层生长区域细胞
正染成浅蓝色,有2~3个核仁,核仁呈紫蓝色。
集落样生长区和多层生长区的中心部分细胞及细胞外基质异染成紫红色,细胞核正染成深蓝色,而其边缘部位异染不及中心区域。
II)细胞经多次传代后主要以单层生长方式为主,甲苯胺蓝染色以正染浅蓝色为主。
许多细胞呈核负染,表明软骨细胞分泌的蛋白多糖等细胞外基质与细胞传代次数有关。
3.注意事项
i.软骨细胞是关节软骨内的唯一细胞成分,只要很好地进行机械解离和
化学解离,注意原代培养和传代培养的方法,就能很好地进行软骨细
胞的分离和培养。
ii.机械解离非常重要,往往决定实验是否成功,解离时不要误带软骨以外的组织,尽可能把软骨切碎至小于1mm3大小。
iii.化学解离主要是用酶法解离,注意消化时间,时间太短软骨细胞不能充分游离,影响软骨细胞的收获量;时间太长死亡的软骨细胞数就会
增多,同样影响软骨细胞的收获量,不利于培养。
iv.换培养液时间一般来讲,生长良好的细胞约两天左右应更换一次培养液,要特别注意培养液的pH值变化, pH值低于6·4时软骨细胞会发
生死亡。
v.常规的培养方法操作步骤较多,且需要多种酶消化,增加了细胞污染的可能性[4-6]。
我们的方法是单用Ⅱ型胶原酶分阶段进行消化,每次
消化45 min,收集一次细胞,并尽快加含有血清的培养液来终止消化,
并加血清培养液保护。
经过二次45 min消化基本上可完全收获细胞。
然后把二次消化的细胞集中在一起计数,分瓶培养。
vi.因为胶原酶接触时间过长对软骨细胞有毒性作用,所以不能一次消化2~3 h或5~7 h才收获细胞。
vii.和大多数软骨细胞一样,兔软骨细胞最适pH值为7·4,所以要经常检查培养液的pH值,如培养液变黄要及时换培养液。
viii.培养液放置于冰箱中保存后常偏碱性,要用盐酸及时调整。
在软骨细胞培养的过程中始终要防止污染,注意无菌操作。
ix.软骨细胞在体外培养过程中有两种转归:一是继续维持表型,具有分泌Ⅱ型胶原纤维和硫酸软骨素蛋白(CSPG)的能力;二是发生反分化,细
胞不仅形态发生改变,而且所分泌的胶原纤维不再是Ⅱ型而成为Ⅰ型,
CSPG的合成能力也随之丧失[7]。
x.我们根据软骨细胞的表型鉴定,认为三代以内的软骨细胞活性较高,保持软骨细胞的表型,是实验研究的理想细胞。
三代以后的软骨细胞
逐渐发生反分化,细胞体积增大,出现许多指状突起,胞核增大,细胞增
殖速度明显减慢,可作为软骨细胞退行变的研究模型。
所以研究药物
的最佳反应和组织工程软骨最好选用三代以内的软骨细胞。
一、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。
如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。
此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
用品：
1. 4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。
使用时。
用PBS稀释至0.4%。
2. 吸管、血细胞计数板、显微镜
步骤：
1、制备单细胞悬液。
并作适当稀释（10 *6 细胞/ml）
2、染色：取9mL细胞悬液移入试管中，加1mL0.4%台盼蓝溶液，混匀。
3、观察
注意事项：台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。
否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。
台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时，细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色，在显微镜下观察即可，活细胞不被染色。
方便易用，因此在实验室中比较常用，尤其在心肌细胞原代培养中。
台盼兰染色法价格低廉，操作简单，又不用无菌操作，做这个实验只要是把显微镜调好了，细胞浓度调好了就不会有问题，是一个养细胞的入门实验，所以很适合初学者做。
