当前位置：文档之家 › 第九章：原生质体培养与体细胞杂交

第九章：原生质体培养与体细胞杂交

  • 格式：ppt
  • 大小：4.27 MB
  • 文档页数：63

下载文档原格式

  / 63

合集下载

第九章++植物原生质体培养

第九章++植物原生质体培养

（五）复杂有机物
在原生质体培养中，常加入一些复杂有机物， 可以不同程度的提高再生细胞分裂频率，促进细胞 团的形成。 常用的有机物有谷氨酰氨、水解乳蛋白、水解 酪蛋白、肌醇、椰乳、酵母浸出物等。
二、培养方法
原生质体培养一般采用液体培养的方法，因为： （一）液体浅层培养
（二）平板法培养
（三）悬滴法培养 （四）固液结合培养法
的压力。
（一）渗透压保护剂
（二应注意的问题
（一）渗透压保护剂
原生质体分离及培养过程中渗透压的调节通常 利用糖或糖醇来控制， 常用的渗压剂有甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗 糖，其中甘露醇和山梨醇或其组合最常用。叶原生 质体分离时最常用的为甘露醇（浓度为 0.23~0.90M）。 有效的渗透浓度决定于原生质体分离期间叶细 胞的渗透压。内源细胞渗透压明显地受环境条件的 影响，并且能够用暗处理植株和幼叶组织等措施加 以控制。
三、酶处理
1、原生质体分离在很大程度上取决于所用酶的性质 和浓度 ，因此要做好酶种类、处理浓度的选择。 2、酶处理的适宜条件 （1）pH值 酶的活性与pH有关，用于分离原 生质体的大多数酶适宜的PH为4.7-6.0 。 （2）温度 对用来分离原生质体的酶类来说， 最适温度是40~50℃，但分离原生质体时以25~30℃ 为宜。 （3）光照 通常在黑暗或在低光强下分离原生 质体。
（二）应注意的问题
1、在酶处理液、原生质体清洗介质及原生质体 培养基中必须加入合适的渗透压保护剂。 2、原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中 稳定。较高水平的渗透压虽可阻止原生质体破裂， 但影响细胞的代谢、分裂和生长。 3、在分离原生质体时，可以使用电解质渗压剂， 但在原生质体培养时一般不用。 4、当用非电解质为渗压剂时，在酶液中加入某 些盐类，如Cacl2、KH2PO4、葡聚糖硫酸钾，可以 提高质膜的稳定性。

第9章原生质体杂交和体细胞杂交

第9章原生质体杂交和体细胞杂交
优点：
可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分 裂频率。
缺点：
操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需合适，温度偏高 则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不 易混合均匀。
琼脂糖珠培养
将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ul一 滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体 培养基并于摇床上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体 培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长 和发育。这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而 促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。
浮液滴于固体培养基表面。 优点：
固体培养基中的营养物质可缓慢释放到液体培养基中，如果 在下层固体培养基中加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物 产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。 缺点：不易观察细胞的发育过程。
固体平板培养
即琼脂糖包埋培养。低融点的琼脂糖可在约30℃融化与原生质 体混合而不影响原生质体的生命活动。混合后含有原生质体的培 养基铺于培养皿底部，封口后进行培养。
植物体细胞杂交
• 用两个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，且把 杂种细胞培育成新的植物体的方法。打破了不同种生物间 的生殖隔离限制，大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围。
植物体细胞杂交过程示意图
(1)
(2)
(3)
(1)
(4)
(5)
9.1 原生质体分离及纯化
• 一、原生质体分离
双子叶外植体
胚性细胞
5、电融合法
• 电融合法是将一定密度的原生质体悬浮液至于一个融 合的小室中，小室两端装有电极。在不均匀的交变电 场的作用下，原生质体彼此靠近，紧密接触，在两个 电极间排列呈珠状。电脉冲可使质膜发生可逆性电击 穿，从而导致融合。

原生质体融合和体细胞杂交的关系

原生质体融合和体细胞杂交的关系

原生质体融合和体细胞杂交的关系下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢!本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!原生质体融合和体细胞杂交是两种常见的生物技术手段，在植物学、生物学和生物技术领域得到广泛应用。

细胞工程植物原生质体培养和体细胞杂交

细胞工程植物原生质体培养和体细胞杂交

PPT文档演模板
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
(三) 渗透压稳定剂
➢ 常用：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖和盐类 等。
➢ 不同物种原生质体分离时，所需的渗透压稳定 剂也不同。
➢ 原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中更 为稳定。
➢ 较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和 出芽，但同时也可能会抑制原生质体的分裂。
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
PPT文档演模板
•马铃薯原生质体再生植株
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
四、原生质体培养过程中的遗传变异
• 适应性变异 为非遗传变异，会随着环境条件的改变丧失其变异 特征。
漂浮法 不连续梯度法
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
沉降法
• 方法：比重小的等渗溶液中，对酶解物先过滤， 再低速离心，使完整的原生质体沉降于管底。
• 渗透压调节剂：甘露醇。 • 筛网过滤：除去大的组织碎片和残渣，孔径
44~169μm，依原生质体大小来定。 • 离心：900~4500r/min。
PPT文档演模板
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
（二）酶的种类、组合和酶解时间
• 草本植物：2~3种酶混合液。纤维素酶为 0.5%~3%，果胶酶为0.1%~1%。
• 木本植物 ：纤维素酶同草本，果胶酶更多。 • 成熟花粉粒和四分体小孢子：除纤维素酶类和果
胶酶类外，尚需降解胼胝质层的蜗牛酶和胼胝质 酶，浓度为0.5%~2%。
➢ 温度： 一般为24~30℃，但不同物种间差异比较大。
PPT文档演模板
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
三、原生质体再生过程
1、细胞壁再生 2、细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成 3、植株再生

植物原生质体的培养与体细胞杂交

植物原生质体的培养与体细胞杂交

。异变因基和体色染、异变征特态形为现表要主。代后给递传地定稳能 �异变因基和体色染及涉因异变传遗�征特异变其失丧而变改的件条境环随它�异变传遗非 为异变性应适 。异变性传遗和异变性应适括包 �异变的泛广着在存中程过养培体离物植 异变传遗�二� 。株植成育发接直后构结体 状胚成形或根定不和芽定不成形可 �中基养培化分到移转织组伤愈的成形养培体质生原 生再株植、3 。致所衡平不的裂分质胞和裂分核是能可这 �象现裂分丝有的常正不生发会中程过养培体质生原 。大很化变率板植体质生原此因 �裂分丝 有胞细行进能都定一不胞细生再但 �提前的裂分丝有则规行进是在存的壁胞细体质生原 裂分胞细、2 。大增积体或芽现出会常 体质生原的全不育发壁胞细而 �裂分丝有胞细的常正行进步一进体质生原的壁胞细整完生再 。成完生再壁胞细天数至天两 �壁胞细生再始开后时小数养培经体质生原 �下况情常正 。件条 决先的裂分胞细是生再的壁胞细而 �力能在潜的裂分和生再有具都体质生原的力活有具 生再壁胞细、1 程过生再体质生原�一� 。程过的株植整完 出化分体状胚过通或织组伤愈过通或后最 �团胞细成形裂分续持胞细生再 �壁胞细复恢快很 �下件条养培的好良和法方养培的当适在体质生原的化纯、离分指是程过生再体质生原 异变传遗与程过生再体质生原、六 。法方种一的养培荡震�后珠糖脂琼成形待�中 液养培入滴滴液的右左 lm5.0 以后然 �匀均合混液体质生原的纯提与液糖脂琼的温适用 养培珠糖脂琼、4 。法 方的面表基养培脂琼体固在布涂 �合混液浮悬体质生原的度浓定一与脂琼的积体等将指是法 养培层双体固-体固�散扩的分成害有和放释步逐的分成养营于利又�长生的体质生原于利 既�合结的养培体固与养培体液是。法养培层双体固-体液为法方养培的面表基养培脂琼体 固在布涂液浮悬体质生原度浓定一将。养培层双体固-体固和养培层双体固-体液为分又 养培层双、3 。法方的 养培止静层浅中皿养培于置 lm4—3 出取�度密胞细定一到整调液养培用体质生原将是 养培层浅体液、2 。察观点定于便 �动游其免避�定固置位体质生原使。法方的板平体固层薄成制内皿养培在�合混基养培脂 琼的℃54 于处的积体等与度密胞细定一照按体质生原的积体定一将指�养培板平叫又 养培层薄体固、1

第九章 新品种培育概述

第九章 新品种培育概述

四、多倍体和单倍体
1.染色体工程：多倍体育种和单倍体育种
人的染色体
• 1.特纳氏综合症（Turner）是常见的女性性染色体异常疾病。 常见的核型是45,X,少数是嵌合体,出生率1/2500～1/5000。 身材矮小，原发性闭经，性幼稚，蹼颈，后发际低，宽乳距, 肘外翻是本病的主要临床特征。 • 2.克氏综合征（Klinefelter Syndrome） 是常见的男性性染 色体异常疾病，典型的核型为47，XXY。表型特征有睾丸发育 不全。身材修长，乃足跟至趾骨间的距离增长所致。男子乳 腺发育、阴毛呈女性型分布，阴茎及睾丸均小。严重者伴有 智力迟钝、隐睾及尿道下裂等。本病发生率较高,在新生活婴 中的发生率是1.4～2.9％，是男性不育症中常见的一种。 • 3.爱德华综合征Edwards：染色体异常为18三体。表型特征有 智力低下、小头、前额窄、枕部突、小颌且张口范围小，腭 弓高窄、低位耳、肾畸形、肌张力增高及手紧握等。
臂部分或全部缺失。表型特征有：婴儿时期哭声似猫叫，因 而得名，可有喉器小和会厌小等喉部发育异常。严重智力低 下，小头、圆形脸、眼距宽、眼裂下斜、耳位低、内眦赘皮， 贯手等多种畸形，约一半患者有先天性心脏病，智力低下， 生活能力差，常早亡。4P-综合征类似5P-综合征，但常常更 为加重，还可呈尿道下裂,腭裂、严重的精神以及运动障碍， 癫痫发作等，属少见病例。 • 6.染色体断裂综合征：可见大量染色体断裂，多由于范可尼 （Fanconi）综合征与Bloom综合征。
植物组织培养与诱变育种相结合的关键问题：
第一,确定适合的诱变剂； 第二,确定适合的诱变材料(或靶细胞或靶组织)。选择诱变 的植物组织培养材料要考虑其分散程度和整齐度,以 及再生能力和再生途径,还要考虑能否获得足够大的

第九章 生物技术在药用植物育种上的应用1

第九章 生物技术在药用植物育种上的应用1

人造血液及其生产
通过基因工程的方式 创造了能合成人干扰素的 大肠杆菌，每1Kg的培养液 可提取4～20mg干扰素，若 从人血中提取干扰素， 300L血才提取1mg！
1983 SCIENCE Cover – Transgenic Mice 1997 TIME Cover - DollyScience Vol来自 222, Nov. 1983
殊环境下的药用植物引种困难等问题，生物技术
在药用植物育种上的应用研究已成为当今中药研 究的热点，如育出了茎尖地黄新品系，已在产区 应用，并将使传统中药进入一个崭新的时代。
什么是生物技术？

生物技术（Biotechnology ）：
Bio Biology Technology Application The application of Biology for the benefit of humans
一、离体培养技术（in vitro culture）
植物细胞的全能性（Cell Totipotency） 一个植物细胞能产生一个完整植株的固 有能力称之为细胞的全能性。 即广义的组织培养，是现代生物技术的一个 重要组成部分，它是指运用无菌操作技术，将 从植物体分离的符合需要的组织、器官或细胞 （包括去壁后的原生质体）等，接种在人工培 养基上，置于人工控制的环境条件下进行培养， 以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的 其它生物产品的技术。
S – sensitive plants R – resistant plants
Biotechnology:
A collection of technologies
The Applications of Biotechnology


原生质体培养与体细胞杂交

原生质体培养与体细胞杂交

看护培养
在适宜的培养条件下，原生质体数小时后开始形成新的细胞壁。这时，在显微镜下可见原生质体由圆球形逐渐变为方形、多边形等。约24-36h后，原生质体开始发生第一次分裂；以后随着细胞分裂，原生质体就形成细胞团。
01
但是，在细胞分裂开始以后，培养基中的甘露醇或山梨醇的浓度要逐渐降低，否则会影响细胞的继续生长、分裂。待原生质体形成的细胞团（愈伤组织）达到1mm时，应将细胞团转移到新鲜的培养基上继续培养。所形成的愈伤组织就可以按照普通的愈伤组织进行培养和植株再生。
第九章 原生质体培养与体细胞杂交
点击此处添加副标题
原生质体的获得 原生质体的培养 体细胞杂交
202X
原生质体的获得
点击此处添加副标题
原生质体的概念 原生质体的用途 原生质体的分离
202X
原生质体的概念
指植物细胞除去细胞壁以外的部分
植物原生质体是没有细胞壁的裸露细胞，它在一些研究方面具有独特的优势。
原生质体的分离 ——酶解法 注意事项 酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进行灭菌，并且随配随用.
原生质体的分离 ——酶解法 酶解就是将无菌材料放入酶解液中、释放出原生质体的过程。 有菌材料，则必须进行表面消毒处理。叶片、幼茎和根等材料要切成小片，叶片最好撕去下表皮。 悬浮细胞则要离心后再酶解。
01
03
02
原生质体的培养方法
原生质体的培养方法
液体—固体结合培养 液体浅层—固体平板培养双层培养法：培养皿底部铺一层琼脂或琼脂糖培养基，再将原生质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。优点是固体培养基中的营养可以缓慢释放倒液体培养基中。如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸附培养物分泌的有毒物质，促进原生质体的生长和分裂。

植物原生质体培养及细胞融合

植物原生质体培养及细胞融合

2．染色观察
• 取一滴0.02％的FDA液与一滴原生质体悬 浮液在载玻片上混匀，25E室温染色5～ 10min。用荧光显微镜观察，激发光波长 330～500nm，活的原生质体产生黄绿色 荧光。用计数器计算存活百分率。
(二)酚藏花红染色法
• 酚藏花红(phenosafranine)是一种碱性 染料，溶于水显红色并带黄色荧光，其 最大激发和射波长分别为527nm和588nm 。酚藏花红能被活的原生质体吸收而呈 红色，无活性的原生质体因无吸收能力 而五色。
(三)不连续梯度离心法
• 在离心管中首先放人不同浓度的Ficoll 溶液，构成不同的浓度梯度，在上部滴 人1～2ml酶一原生质体混合液，在150g 下离心5min，不同比重的原生质体漂浮 在不同的浓度梯度的界面上，用吸管收 集原生质体，悬浮洗涤备用。该方法的 优点是获得的原生质体大小均匀致，纯 度高；缺点是操作繁杂，原生质体的收 率低。
(五)分离方法 • 1．机械分离法 • 但由于该方法获得的原生质体产量低， 不能满足实验需要，而且液泡化程度低 的细胞不能采用该方法，因此，机械分 离法没有得到广泛应用。 • 2．酶分离法
• 1960年，德国诺丁汉大学的Cocking首先利用 纤维素酶从番茄幼苗根尖中分离获得原生质体 ，而且收率高、完整性好、活力强。经过数十 年的不断完善，目前酶分离法已成为植物原生 质体分离最有效的方法。 • 酶分离法又分为两步法和一步法。两步法是先 用果胶酶处理材料，游离出单细胞，然后再用 纤维素酶处理单细胞，分离出原生质体。其优 点是所获得的原生质体均匀一致、质量好。但 由于操作繁杂，目前已逐渐被淘汰。 • 一步法是将纤维素酶和果胶酶等配制成混合酶 溅处理材料，一步获得原生质体。因操作简便 ，目前几乎均采用该方法。

第九章原生质体培养

第九章原生质体培养


另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解 壁过程中对细胞器的破坏。近年来多采用在盐 溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作 渗透稳定剂的培养基中培养。 此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾， 它可提高原生质体的稳定性。这种物质可使 RNA酶不活化，并使离子稳定。
四.植物材料的预处理 对原生质体材料进行预处理能提高原生 质体的分裂频率；也可以逐步提高植物材 料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。 这些处理包括：暗处理、预培养、低温处 理等。
由于不同材料的生理特点不同，在研究游 离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞， 找出适宜的渗透浓度。例如，游离小麦悬浮细 胞的原生质体的酶液中须加入0．55mol／L甘 露醇，游离水稻悬浮细胞的原生质体的酶液中 只加0.4~0.45mol／L的甘露醇，两者差别较 大。
酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表 皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。去表 皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉 轻轻撕下表皮。如果去表皮很困难，也可直接将 材料切成小细条，放入酶液中。 对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不 均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将 原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行 酶解。
2.酶溶液的pH值 酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影 响很大。用菜豆叶片作培养材料时，发现原始pH 值为5．0时， 原生质体产生得很快，但损坏较严 重，并且培养后大量破裂。当pH值提高到6．0时， 最初原生质体却产生少，但与pH值为5．0时处理 同样时间后相比，原生质体数量显著增加。原始 pH值提高到7.0时生活的原生质体数量进一步增 加，损伤的原生质体也少得多。

④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1~2个 小时。 原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补， 不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激 活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用 一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的 不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分 化条件等。

体细胞杂交

体细胞杂交
Fujita将淡红紫色的野生型条斑紫菜与绿 色突变型的条斑紫菜的原生质体融合，培育 出长达60cm左右的嵌合叶状体。
遗传育种学 Genetic thremmatology
在鱼类，易泳兰等把大鳞副泥瞅×鳗尾泥 鳅杂交囊胚细胞与大鳞副泥鳅卵融合，培育 了15.7％(6尾)的融合鱼。
将鲤鱼囊胚细胞与红鲫鱼卵融合，培育了 3.5%融合鱼苗，工作还表明，鱼类囊胚细胞 与末受精卵的电融合可以简化细胞核移植操 作过程，一次可以处理卵数相当于一次核移 植卵数的2-3倍。
4.2、植物育种 马铃薯与番茄、拟南芥菜与本油菜
等是些属间有性不亲和的组合，经细胞 融合技术和组织培养技术，已培养出前 所未有的再生植株
遗传育种学 Genetic thremmatology
4.3 水产生物方面的应用
张大力等将长石莼与囊礁膜原生质体融 合，并将其融合体培养了20天，形成自养细 胞团。
4
机理
在高浓度(40％以上)的聚乙二醇溶液 中，由于PEG与水之间的氢键作用，使 溶液中自由水消失，导致细胞脱水而发 生膜结构的变化，由此形成膜蛋白质的 外壳，引起细胞融合。
1
遗传育种学 Genetic thremmatology
遗传育种学 Genetic thremmatology
遗传育种学 Genetic thremmatology
2
遗传育种学 Genetic thremmatology
电融合实例
刘沛霖以大鳞副泥鳅的囊胚细胞为材料，在
9～15℃室温下，电场液用0.02mol/L甘露醇加 1mmol/L氯化钙配成，细胞密度为（2.5 ～ 3）X 104，细胞膜紧密接触2 ～ 5min，脉冲处理1～3 次，时间常数10 ～50us，融合率为46.72%，细胞 存活率达88.6%

马铃薯原生质体培养和体细胞杂交

马铃薯原生质体培养和体细胞杂交

• 一、马铃薯原生质体的分离与纯化
• 马铃薯原生质体分离、培养和植株再生都必须在无菌条件下进 行。
• （一）外植体的选择
• 要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组 织作材料。细胞悬浮培养物是最常采用的作为分离原生质体的 材料。而叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料。
• 马铃薯试管苗叶片、实生种子子叶和下胚轴都是获得马铃薯原 生质体的常用供体材料。
项目十 马铃薯原生质体培养
和体细胞杂交
• 知识目标 • 1.了解马铃薯原生质分离、培养的基本理论和方法； • 2.掌握马铃薯体细胞杂交的原理和方法。
• 技能目标
• 掌握马铃薯原生质分离、原生质体培养、体细胞杂 交的方法技术。
• 原生质体是去除细胞壁的裸露植物细胞。 • Klereker在1892年首先用利刃对细胞进行机械切割
• 最简便的固液结合培养方法是在培养皿的底部先铺一 薄层含凝胶剂的固体培养基，再在其上进行原生质体 的液体浅层培养。固体培养基中的营养成分可以慢慢 地向液体中释放，以补充培养物对营养的消耗，培养 物所产生的一些有害物质，也会被固体部分吸收，对 培养物的生长更有利。
• （二）马铃薯原生质体的培养过程
• 2. 液体浅层培养
• 即含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层。 是目前较常用的一种方法。其优点是方法操作简便， 对原生质体伤害较小，便于添加培养基和转移培养 物。缺点是原生质体在培养基中分布不均匀，容易 造成局部密度过高或原生质互相粘连而影响进一步 的生长发育．并且难以定点观察。
• 3. 固液结合培养法
• 目前常用的融合方法有：
• (一) 物理方法
• 主要采用电融合的方法。这是70年代末80年代初开始发 展起来的一项融合技术。
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

优点： 融合成本低，勿需特殊设备； 融合子产生的异核率较高； 愈伤组织 融合过程不受物种限制。
不定芽 缺点： 融合过程繁琐 根形成 PEG 可能对细胞有毒害。
50
诱导融合方法
（二）电融合法：利用改变电场来诱导原生
质体彼此连接成串，再施以瞬间强脉冲使质膜 发生可逆性电击穿而使原生质体融合的方法。
29
2、培养方法
30
液体浅层培养
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄 层，封口后进行培养。 优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易 于添加新鲜培养基转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质 体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发 育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情 况。
19
1、原生质体的纯化方法
（3）梯度离心法：利用比重不同的溶液，经离心 后使完整无损的原生质体处在两液相的界面之间， 而细胞碎片等杂质则沉于管底。用这种方法可以 获得更为纯净的原生质体。
20
原生质体的纯化步骤

用300-400目不锈钢网过滤酶解材料,弃去残渣
600rpm, 5-10min

吸去上清 原生质体重悬于0.16mol/L CaCl2· 2H2O溶液中
46
机理：

1、NaNO3诱导融合
原生质体表面带有负电荷(-10～-30mV)，同性 质电荷彼此凝聚的原生质体质膜无法靠近到足 以融合的程度。 NaNO3中的钠离子能中和原生质体表面的负 电荷，使凝聚的原生质体质膜紧密接触，促进 细胞融合.

融合率 0.1%-4%。
47
2、PEG（聚乙二醇）与高pH、 高Ca2+相结合诱导融合

PEG，能与水、蛋白质、糖等具有正极性基团的极 性物质形成氢键，在相邻原生质体表面间作为分子 桥，使原生质体发生粘连

当PEG分子被洗脱时，膜电荷发生紊乱而重新
分配。此时，一种原生质体上带正电的基团可
能与另外一个原生质体中带负电的基团相连，
导致原生质体融合。
48
2、PEG（聚乙二醇）与高pH、 高Ca2+相结合诱导融合


在容器底部缓慢注入20%蔗糖溶液
600rpm, 5-10min

收集两层液面之间的纯净的原生质体
21
Leaves were cut in thin stripes and digested in an enzyme solution
Purification of protoplasts
Purified protoplasts
40
1978年，Melchers获得了第
一个属间细胞杂种（番茄＋
马铃薯）；
Tomato+Potato= Pomato
41
二、研究意义

◆杂交优势：两个遗传基础不同的植物或动物 进行杂交，其杂交后代所表现出的各种性状均 优于杂交双亲，比如抗逆性强、早熟高产、品 质优良等。
性，使有性杂交根本无法获得的种间、属间、 科间远缘杂种成为现实。
55
Fusion phases of oat protoplasts (Avena sativa)
56
四、融合细胞的筛选

互补选择法:指利用两个亲本具有不同遗传和
生理特性, 在特定培养条件下,只有发生互补作用 的杂种细胞才能生长的选择方法。

抗性互补选择法 叶绿体缺失互补选择法 营养代谢互补选择法 生长互补选择法
矮Байду номын сангаас牛+爬山虎融合体的选择
57
抗性互补选择
抗A不抗B 型细胞 融合体
抗B不抗A 型细胞
含A、B 培养基
杂种细胞
58
白化互补选择法
以矮牵牛为例： 白化苗原 生质体1
融合
杂种细胞
限定培养基
白化苗原 生质体2
绿色愈伤组织 或幼苗杂种
59
营养缺陷型互补选择
Gly-型细胞 融合 Pro-型细胞
培养
Gly-、Pro-培 养基
融合效率高。
53
3、电融合的基本过程
细胞膜的接触：当原生质体臵于 电导率很低的溶液中时，电场通 电后，电流即通过原生质体而不 是通过溶液，其结果是原生质体 在电场作用下极化而产生偶极子 ，从而使原生质体紧密接触排列 成串；
原生质体成串
54
膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给 予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从 而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。
琼脂糖珠培养
将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸 管以大约50ul一滴的量滴于直径6cm的培养皿， 待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床 上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体 培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于 其进一步的生长和发育。这种方法由于改善了 培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质 体的分裂和细胞团的形成。


作用：改变细胞和细胞壁的生理状态；增加细 胞膜的强度；减轻酶溶液中杂酶对原生质膜的 损伤。 方法：暗处理；预培养；预质壁分离；
8
（三）原生质体的分离方法
1、机械法：
原生质体得率 极低，难以大 量制备
2、酶法：
大量获得植物 原生质体的有 效方法
9
（1）酶的类型
A. 纤维素酶，如Onozuka R-10及RS，国内常用的为EA3867，其中含少量果胶酶，0.5-2.0％ ；
B.半纤维素酶，如Rhozyme HP150，用于悬浮细胞、豆 科根瘤、幼苗子叶及根细胞原生质体的分离; C.果胶酶，如Macerozyme R-10 又叫离析酶，主要含果 胶酶，活力较高，其含杂酶较多，用量不超过2％，作用 时间长有毒害作用；此外亦用Pectalyase Y-23，也叫离 析软化酶，活力极高，叶片用量一般为0.1-1.0％，悬浮 细胞为0.05％； D.崩溃酶（Driselase)，为一种粗酶制剂，具有纤维素 酶及果胶酶活性；
第九章 原生质体培养 与体细胞杂交
第一节 原生质体培养
一、 原生质体概述
（一）定
原生质体(protoplast)—
义
脱去细胞壁、裸露的植
物细胞。原生质体是为
质膜所包围的裸露细胞。
4
（二）原生质体特点
原生质体无细胞壁障碍，便于 进行有关遗传操作；在诱导条件 下易发生融合，形成杂种细胞； 具全能性,能再生细胞壁,能进
固体平板培养
即琼脂糖包埋培养。低融点的琼脂糖与原生 质体融化混合，将含有原生质体的培养基铺于 培养皿底部，封口后进行培养。 优点： 可以跟踪观察单个原生质体的发育情 况，易于统计原生质体分裂频率。 缺点：操作要求严格，尤其是混合时的温度掌 握必需合适，温度偏高则影响原生质体的活力， 温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合 均匀。
原生质体的分离与纯化录相
23
五、原生质体的活力测定
1、目测法
根据形态待征判断
其活力：原生质
体呈绿色（若来
源于叶片）及圆 而鼓者为活原生 质体。
25
2、染色法
（1）FDA （荧光素双 醋酸酯, ）染色法(0.01%) 原理:FDA本身无荧光，
无极性，能自由穿越细胞
质膜，在活细胞内，FDA 被酯酶裂解，分解形成荧 光素，荧光素不能自由穿 越细胞质膜。
14
（2）酶液的pH值
酶液pH值相当重要，纤维素酶及果胶酶 单独使用时，其pH分别以4.0-5.0及5.8为宜； 混合使用时pH5.8-pH6.0为宜，降至4.8以下
则原生质体破裂。酶液配制后需以0.45μm微
孔膜过滤除菌，而不可采用加热灭菌法。
15
四、原生质体的纯化
1、原生质体的纯化方法
采用40-300μm的网筛过滤细胞混合液，除去未消化的细胞、 细胞团、碎片， 收集滤液，进行以下纯化方法。 （1）沉降法：在适当溶剂内低速离心使原生质体下沉于 离心管底部，细胞碎片留在上清液中，如此收集得到的原 生质，反复3-4次。 （2）漂浮法：原生质体比重较小，能在具有一定渗透压 的溶液（如25%的蔗糖溶液）中漂浮，然后用吸管收集。
51
1、电融合法的原理
在直流电脉冲的诱导下，原生质体质 膜表面的电荷和氧化还原电位发生改 变，使异种原生质体黏合并发生质膜 瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到 闭和成完整的膜形成融合体。
52
2、电融合法的优点
与PEG融合比较起来，电融合有三大优点：
不存在对细胞的毒害问题；
融合技术操作简便；
31
液体-固体双层培养
在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基， 再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。 优点：固体培养基中的营养物质可缓慢释放到 液体培养基中，如果在下层固体培养基中加一 定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一 些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的 形成。 缺点：不易观察细胞的发育过程。
3、植板密度

初始植板密度一般为: 1×104/ml~ 1×105/ml
35
4、原生质体再生植株的过程
细胞壁再生
细胞分裂与生长
愈伤组织或胚状体的形成 再生植株
36
A-D当归(Angelica sinensis(Oliv) Diels)原生质体培养成再生苗 E-H,红豆草(Onobrychis vicaefolia Scop) )原生质体培养再生植株

钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生 质体膜的结合； 高pH又能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合,但对

细胞有毒害；

在高Ca2+和pH溶液的作用下，将与质膜结合的PEG分 子洗脱，将进一步加剧电荷平衡失调，从而提高融合的
几率。

融合率10-50%
49
培养过程：