乙肝病毒耐药基因测序

DNA测序与线性反向探针杂交法检测HBV P基因耐药突变的比较【摘要】目的基于多重pcr和反向线性杂交原理，建立hbv基因分型及耐药突变检测的新方法。

方法对深圳地区的hbv进行基因分型，并对其常见耐药突变位点进行快速检测，了解其流行现状和流行规律。

结果在45份标本中dna序列测定法检测到碱基突变73个，其中与 lam相关突变24份（53.33%），与 adv 相关突变3份（6.66%），与ldt相关突变1份（2.22%），与etv相关突变1份（2.22%）；选取21份血清，其中与线性反向探针杂交检测结果一致的突变为85.71%（18/21），氨基酸位点一致为97.39%（224/230）。

结论检测hbv不同基因型与致病性及药物应答的关系，能够为研究hbv的流行病学规律提供新的方法，为hbv感染的治疗提供用药指导，从而也为hbv的感染控制提供新的诊断工具。

【关键词】慢性乙型肝炎；乙肝病毒；核苷/酸类药物；耐药性突变；dna测序；线性反向探针杂交法【中图分类号】r450【文献标识码】a【文章编号】1004-5511（2012）06-0346-02全世界大约有3.5亿乙型肝为病毒（hbv）携带者，每年约有80万人死于hbv 慢性感染所引发的重型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等相关疾病。

乙型肝炎病毒（hbv）可在慢性持续性感染、机体免疫、压力或抗病毒治疗药物作用过程中发生变异［1］。

近年来，临床上开始广泛采用采用核苷/酸类药物治疗乙型肝炎，核苷/酸类药物方拉米夫定(lam)、阿德福韦酯(adv)、替比夫定(ldt)、恩替卡韦(etv)等简便、副作用少、能迅速抑制hbv复制。

但其耐药性问题也日益突出。

本研究采用基于巢式 pcr 的 hbv p 基因序列测定法检测慢性乙型肝炎患者血清 hbv 基因变异情况，并与线性反向探针杂交法检测结果比较，同时对新发现的若干 hbv dna 耐药突变位点进行分析。

现将实验结果报告如下。

精心整理一亿国人都是乙肝感染者，他幸运的在美国找到了特效药本文非小说，而是科普文章。

患者真实资料来自“MORE Health 爱医传递”，患者名字为匿名。

1有的毛病，大家都知道不好，却不愿意放弃，比如吸烟。

中国有如果肝功能正常，就意味着还没有肝炎症状，只是乙肝病毒携带者，需要定期检查，以防肝功能损伤、肝硬化、甚至肝癌。

但是，因为齐遇准备要进行肾脏移植手术，所以就先对乙肝病毒进行了治疗，使用的药物是拉米夫定（Lamivudine）。

拉米夫定属于核苷类逆转录酶抑制剂，可以用来抑制HIV病毒的合成，同时也被批准用来治疗乙肝病毒。

2009年4月，齐遇进行了肾脏移植手术，术后肾功能正常，乙肝病毒HBV检测指标转为阴性。

2012年6月，齐遇到医院复查，发现乙肝病毒升高，病毒DNA检查结果（tenofovirdisoproxil fumarate, TDF），每天300mg，但服药后不久发现微量白蛋白尿，尿液中β2-MG也升高，意味着肾功能出现了问题。

更糟糕的是，12月的检查发现，齐遇的谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）突然分别升高到118和71，说明肾功能、肝功能都出现了问题。

一个月后，肝功能指标稍有改善，但仍然偏高。

在服用替诺福韦治疗后，乙肝病毒量倒是下降了，2016年12月检查时降到21,999 IU/mL, 2017年1月继续降到检查时降到3640 IU/mL。

耐药的现象。

在这种情况下，更换为替诺福韦治疗是合适的，但是因为齐遇出现了微蛋白尿，确实需要担心药物对肾脏的不良反应。

TAF属于替诺福韦的前体药，在体内稳定性高，并能转换成为有活性的恩替卡韦。

TAF在2016年11月被美国食药监局批准，成为治疗乙肝的新药。

在此之前，TAF与恩替卡韦完成了两项头对头的临床试验，通过这两个共招募了近1300名慢性乙肝患者的研究证明，不管患者乙肝e抗原是否阳性，25mg 剂量的TAF与300mg 剂量的恩替卡韦治疗效果都相同，治疗48周后，90%以上的所降低。

乙型肝炎现状如何？乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，主要存在于肝细胞内，可引起肝细胞炎症、坏死和纤维化。

乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性分布,全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病.我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万例。

乙型肝炎病毒（HBV)基因分型的临床意义HBV根据DNA差异可分为A、B、C、D、E、F、G、H八种类型，不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异，其中，我国以B型和C型为主,感染HBV基因型B的患者发生肝纤维化及肝细胞癌的平均年龄要比感染HBV基因型C的患者的年龄大。

通过分型检测，可判断病毒复制活跃程度及突变发生率情况.研究表明，与HBV—B型相比,C型复制较活跃，不易发生HBeAg血清转换；HBV—B型易产生前C区突变，C型核心启动子区变异发生率更高，与重型肝炎发病机制密切相关，可作为肝癌高危指标之一.同时,HBV-B、C型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量.乙肝的治疗方式有哪些?HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类。

由于干扰素需要反复注射，且副作用较多,近年来,核苷(酸）类似物（NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者,是长期治疗的合理选择.但随着治疗时间的延长,往往会出现病毒耐药株，从而需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，指导临床用药。

乙肝病毒产生耐药的机理是什么?HBV对某种药物的耐药性一般是指由HBV基因组上某些位点的变异导致这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用。

通常分为以下几种：(1）原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异,导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降；（2）继发性耐药变异(又称补偿性耐药变异)：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降,在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异,这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降；（3）基因型耐药:指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异；（4)表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。

武汉地区157例乙型肝炎病毒基因分型和耐药性分析宋仕玲;桂文甲;周洪清;黄艺芬;尹淑芬;李靖;吴淑坤【摘要】目的了解武汉市乙型肝炎病毒基因型分布特点和乙型肝炎病毒耐药情况.方法采用基因测序法检测武汉市区157例患者HBV基因型,目标检测基因型为A～H等8个基因型,检测HBV 11个耐药位点:rtL80、rtL169、rtV173、rtL180、rtA181、rtT184、rtA194、rtS202、rtM204、rtN236和rtM250,判断对HBV耐药的核苷类似物.结果武汉市区157例HBV感染者中,检出3种HBV基因型,其中B型占72.61％,C型占26.75％,D型占0.64％.共有68例(43.31％)耐药,其中B 型70.59％,C型29.41％,基因B型和C型的HBV相比,耐药发生差异无统计学意义(x2 =0.379,P＞0.05).对拉米夫定耐药41例,占全部耐药病例的60.29％,其中B型占73.17％,C型占26.83％;204I位点耐药17例,180M+204I位点耐药6例,180M+ 204V位点耐药12例,180M+ 204V/I位点耐药6例.对阿德福韦酯耐药20例,占全部耐药病例的29.41％,基因B型占75.0％,基因C型占25.0％,耐药位点为236T为9例,耐药位点为181T/V为7例,236T和181T/V联合耐药4例.对恩替卡韦耐药5例,占全部耐药病例的7.35％,基因B型3例,基因C型2例.拉米夫定和阿德福韦酯联合耐药2例,占全部耐药病例的2.94％,均为基因C型.替比夫定耐药与其他核苷类似物耐药分析结果重复,共32例,占47.06％,基因B型75.0％,基因C型25.0％.结论武汉市区157例乙型肝炎病毒感染者中男性较多,感染HBV 主要基因型为B型,其次为C型,患者主要表现为拉米夫定、替比夫定和阿德福韦酯耐药.临床应根据患者HBV基因型和耐药情况个体化制定治疗方案.【期刊名称】《胃肠病学和肝病学杂志》【年(卷),期】2015(024)008【总页数】4页(P969-972)【关键词】肝炎病毒;乙型;HBV DNA;基因型;耐药【作者】宋仕玲;桂文甲;周洪清;黄艺芬;尹淑芬;李靖;吴淑坤【作者单位】武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061【正文语种】中文【中图分类】R512.6+2乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)基因型测定对评估慢性乙型肝炎感染者的疾病进展和制定最佳抗病毒治疗方案很重要，相比而言，肝硬化和原发性肝癌患者感染的乙型肝炎病毒基因分型更多为基因C型和D 型［1-3］。

临床分析乙肝病例的肝炎病DNA分析乙肝是一种常见且慢性的病毒性肝炎，由乙型肝炎病毒（HBV）引起。

本文旨在通过DNA分析来深入了解乙肝病例的病情情况，并为临床治疗提供依据。

一、病例概况本次分析的乙肝病例为一名28岁的男性患者，主要症状为疲劳、食欲不振以及黄疸。

该患者初次发病为3个月前，经过初步检查后被确诊为乙肝。

二、乙肝病毒检测为了确认该患者的乙肝病毒感染情况，我们采用了血清学检测和肝炎病毒DNA分析两种方法。

1. 血清学检测利用乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝表面抗体（Anti-HBs）、乙肝e抗原（HBeAg）、乙肝e抗体（Anti-HBe）以及乙肝核心抗体（Anti-HBc）等血清标志物，对该患者进行了血清学检测。

结果显示，该患者血清中检测到HBsAg和HBeAg阳性，Anti-HBs 和Anti-HBe阴性，Anti-HBc阳性。

这一结果表明患者处于乙肝慢性感染期，具有传染性。

2. 肝炎病毒DNA分析为了进一步了解乙肝病例的病情，我们进行了肝炎病毒DNA分析。

在此次分析中，我们采用了PCR技术来扩增乙肝病毒的DNA样本。

通过PCR扩增后，我们将PCR产物进行凝胶电泳分析。

结果显示，在该患者的血清中检测到了明显的乙肝病毒DNA带，进一步证实了该患者的乙肝病毒感染。

三、病毒载量分析病毒载量是乙肝病例中一个重要的指标，用于评估病毒的活跃程度。

通过对该患者的血清样本进行病毒载量分析，我们可以更好地了解该患者的病情情况。

本次病毒载量分析采用了实时定量PCR技术。

经过实验测定，该患者的病毒载量为1.5×10⁶ IU/mL，属于中等水平。

这一结果提示该患者的病毒活跃性相对较高，需要进行积极的治疗干预。

四、基因型分析乙肝病毒可分为多个基因型，不同基因型可能对治疗效果和预后产生影响。

为了了解该患者的乙肝病毒基因型，我们采用了基因测序技术。

通过测序分析，我们确定了该患者感染的乙肝病毒基因型为B型。

MLPA结合RT-PCR快速检测乙型肝炎病毒拉米夫定及阿德福韦耐药乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)耐药的产生成为长期治疗慢性乙型肝炎成功与否的主要障碍。

目前检测HBV耐药的方法多种多样，但都因存在一些缺陷，其临床应用受到限制，例如灵敏度低、耗时长、成本高等缺点。

在本论文中，我们建立了一种可以同时检测HBV拉米夫定(lamivudine, LAM)及阿德福韦(adefovir, ADV)耐药突变株(rtM204V, rtM204I, rtA181T, rtA181V, rtN236T)的多重连接探针-实时荧光PCR(multiplex ligation-dependent probereal-time PCR, MLP-RT-PCR)方法。

该方法结合了多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)技术的灵敏、特异、高通量和实时PCR方便快捷、实时检测的特点。

通过检测临床116例慢性乙肝患者DNA样本对MLP-RT-PCR方法进行了方法性能评价，其中检测出LAM耐药突变41例(35.3%)，ADV耐药突变17例(14.7%)及两者共同耐药突变5例(4.3%)。

检测结果与金标准直接测序方法比较，MLP-RT-PCR检测rtM204V、rtM204I、rtA181T、rtA181V和rtN236T的符合率分别为95.7%(111/116)、98.3%(114/116)、99.1%(115/116)、98.3%(114/116)和99.1%(115/116)。

MLP-RT-PCR方法检测低比例突变株的灵敏度比直接测序方法更高，能够检测0.1%以上的rtM204V、rtM204I、rtA181T和rtN236T突变株，1%以上的rtA181V 突变株。

MLP-RT-PCR发现了4例低比例临床突变株，并进一步被TA克隆测序方法确证。

检测耐药基因突变的金标准
检测耐药基因突变的方法可以根据疾病和基因突变的特定情况而有所不同。

以下是一些常见的方法和标准：
1. 基因测序（DNA测序）：通过对患者样本中与耐药相关的基因进行测序，可以检测到具体的基因突变。

这种方法可以准确地确认特定基因的突变，但耗时较长且费用较高。

2. 蛋白质测序（蛋白质质谱分析）：通过测量患者样本中耐药相关蛋白质的水平和结构变化，可以间接地推断是否存在耐药基因突变。

这种方法通常用于确定蛋白质相关的耐药机制。

3. 定量PCR（qPCR）：通过量化耐药相关基因的拷贝数来推断耐药基因突变的存在。

这种方法可以快速、灵敏地检测到基因拷贝数的变化，但无法准确地确定具体的基因突变。

4. 组织培养和药敏试验：通过将患者样本中的微生物培养起来，并测试其对不同抗生素的敏感性，可以确定具体的耐药基因突变。

这种方法通常用于细菌等微生物的耐药检测。

龙源期刊网 利用一代测序进行HBV基因分型和耐药检测
作者：鲁旖
来源：《健康必读（上旬刊）》2019年第10期
【摘 ;要】目的：建立利用一代测序进行乙型肝炎病毒基因分型和耐药分析的方法。

方法：查阅文献及利用NCBI设计引物，摸索和优化PCR扩增条件，PCR产物用一代测序进行测序分析。

结果：本方法所用引物及PCR产物能用于一代測序进行HBV基因分型和耐药检测。

结论 ;建立了利用一代测序进行乙型肝炎病毒基因分型和耐药分析的方法，为临床诊治提供个性化诊疗依据。

【关键词】乙型肝炎病毒;基因测序;基因分型
【中图分类号】R54 ;;;;;【文献标识码】A; ;;;;【文章编号】1672-3783（2019）10-0286-02
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）基因组DNA是不完全双链的环状DNA，由一条不完整的正链和一条不闭合的负链组成。

;;HBV基因型包括A～I，我国以B型和C为主。