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(第八章)第九章植物原生质体培养与体细胞杂交

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作物育种学第八章 远缘杂交育种

作物育种学第八章 远缘杂交育种
育性减退 异源染色体可能伴有不良性状 不能用于生产，但可用于创造异替换系和易位系
附加系染色体鉴定
（2）异置换系：物种的一对或几对染色体被另一物种的染色体所取代 来源：由附加系（2n+1）与单体（2n-1）杂交再自交得到 染色体的代换通常在部分同源染色体间进行 （如普通小麦的4D与长穗偃麦草的 4E） （部分同源染色体在基因剂量、位置、DNA序列有很大差异，差异程度 因不同染色体而异，它们在功能上有一定补偿能力） 特性：染色体数目未变 细胞学和遗传学上都比相应的附加系稳定 有时可在生产上直接利用
易位系鉴定
4、诱导单倍体 远缘花粉在异种母本上常不能正常受精，但有时能刺激母本 的卵细胞自行分裂，诱导孤雌生殖，产生母本单倍体。 亲缘关系较远的两个亲本因细胞分裂周期不同等原因，其杂 种会排除亲本之一的染色体，产生单倍体植株。 如普通大麦与球茎大麦杂交F1，其球茎大麦的染色体消减而 得到大麦单倍体。 通过远缘杂交己在许多物种中成功地诱导出孤雌生殖的单倍 体。所以，远缘杂交也是倍性育种的重要手段之一。
（5）嫁接法 不育F1杂种嫁接到栽培种上，提高杂种的育 性（马铃薯）
三、杂种后代的分离和选择： 1、分离特点：
（1）分离规律不强 异源染色体缺乏同源性，导致减数分裂过程紊乱，形成不同染色体数目和质 量的各种配子，性状分离复杂且无规律。 （2）分离类型、生殖丰富、并有向两亲分化的倾向 远缘杂交后代，分离出中间类型、偏亲类型、亲本类型、亲本祖先类型、超 亲类型以及单倍体、非整倍体等某些特殊类型； 染色体消失、无融合生殖、染色体自然加倍；
（2）放宽早代选择的标准
早期世代的一些不良性状随染色体、重组而减弱或消失；只要具有某 些可取的经济性状，可进一步改造。
（3）灵活地应用选择方法 难以采用系谱法 混合种植法：如果要把不同种或亚种的一些优良性状和适应性组合起来，培育

植物的原生质体培养

植物的原生质体培养

四、原生质体研究的趋势
1、低密度和单个原生质体培养； 2、单倍配子体如花粉原生质体培养；
3、计算机控制系统、流式细胞光度计
等技术的应用。
图示原生质体分离过程（以叶片为例）
加果胶酶 和纤维素酶
过滤、离心
以愈伤组 织为材料分离 原生质体。
以叶片为 材料分离原生 质体。
3、原生质体的收集和纯化：
酶解处理后得到混合液包括原生质体、细胞团和组织碎 片等，必须将杂质和酶液除去，才可以继续培养。
原生质体纯化方法有：离心沉淀法，漂浮法，接口法。
第一步：预处理即对烟草植株限制供水 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥 去外表皮切成4cm的小块 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶 0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol CaCl2. PH5.6 第四步：将小块烟叶放入混合酶液25 ℃处理 8~10小时 第五步：过滤、离心、洗涤（ 0.7 mol甘露醇液 含0.1 m mol CaCl2 ）。如此2~3次、得原生质 体
密度与培养基营养成分完全性。
三、原生质体的发育和植株再生
植物组织 去壁 原生质体 植物细胞
？ ？
愈伤组织
植株再生 完整细胞
？
胚状体
一般包括如下几个步骤： 1）细胞壁再生： 体积膨大，叶绿体重新排列，新的细胞 壁开始合成，细胞由球形变成椭圆形。
2）分裂：
一般在培养2-3天后细胞质
增加，细胞器增殖，DNA、 蛋白质等合成增加，细胞分 裂，形成小的细胞团，发育 成愈伤组织或胚状体。 3）植株再生
1）离心沉淀法 筛网过滤（400目）除去未消化的细胞、细胞 团和碎片后在适当试剂（甘露醇）内低速离心。 优缺点： 比较简单 但不易除尽一些完整的细胞，或引起原生质 的破碎

园艺植物育种学(9.1)--植物离体培养育种

园艺植物育种学(9.1)--植物离体培养育种
第八章 植物离体培养育种
园艺植物育种学—离体培养育种
第八章 植物离体培养育 种
第一节 植物离体培养的概念及应用 第二节 组织与器官培养 第三节 花药和花粉培养与单倍体育种 第四节 植物细胞培养及其突变体筛选 第五节 原生质体培养与体细胞杂交
园艺植物育种学—离体培养育种
第一节 植物离体培养的概念及其应用
三、植物离体培养在园艺植物育种中的应用 3 、获得体细胞杂种
通过原生质体融合途径可以部分克服有性 杂交种间的障碍，获得体细胞杂种。
不同种间、属间甚至科间通过该技术可以广 泛杂交，这对于无性繁殖的园艺植物具有更特殊的 意义。
对称融合、非对称融合。
园艺植物育种学—离体培养育种
第一节 植物离体培养的概念及其应用
一、植物离体培养的概念
植物离体培养（ Plant in vitro culture ）：即广义的植 物组织培养（ Plant tissue culture ），是指通过无菌 操作，将植物的组织、器官、细胞以及原生质体等 接种于人工配制的培养基上，在人工控制的环境条 件下进行培养，以获得再生的完整植株或生产具有 经济价值的其他生物产品的一种技术。是现代生物 技术的一个重要组成部分。
园艺植物育种学—离体培养育种
第二节 组织与器官培养
一、实验室 1 、无菌操作室 2 、培养室 3 、化学实验室、洗涤消毒室和细胞学实验室
园艺植物育种学—离体培养育种
第二节 组织与器官培养
二、培养条件 1 、培养基 2 、无菌操作 3 、培养的环境条件
园艺植物育种学—离体培养育种
第二节 组织与器官培养
二、培养条件 1 、培养基 种类：固体培养基 液体培养基 营养成分：无机成分、有机成分、天然复合物、

修改第八章原生质体培养和融合

修改第八章原生质体培养和融合

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8
使用的酶主要有： 纤维素酶(Cellulase)、 果胶酶(Pectolyase)、 离析酶(Macerozyme )、 半纤维素酶(Hemicellulase) 崩溃酶(Driselase)， 其中纤维素酶和果胶酶是最必要的。
a
9
酶液中的渗透压是原生体分离的另一个因素，植物细 胞去壁后，必须由合适的渗透压替代细胞壁维持的机械压力， 酶液中的渗透压过低会使细胞吸涨而破裂；渗透压过高，细 胞除受到渗透压力而破裂外，还会损害细胞生长代谢 。
培养基，将适当密度的原生质体悬浮液加在含琼脂的培养基上。 液层较浅，有利于通气，而且固体培养基中的养分可以释放到 液层中去，以补充培养物对养分的消耗。另外培养物中的代谢 产物对原生质体的生长不利，可以为固体层所吸收，降低或消 除毒害。
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13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液
原生质体纯化(以柑桔原生质体为例，界面法)
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果胶酶和 纤维素酶
过滤、离心
原生质体制备流程（以叶片为例）图
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第二节 原生质体的培养
一、原生质体培养的方法 1. 液体培养
培养基中不加凝固剂，仅仅用液体培养基按所需植板密度重悬 原生质体后，直接植板在培养皿中即可。 液体浅层培养法是目前 原生质体培养中广泛应用的方法之一。 优点：操作简便，对原生质体伤害小，有利于通气。 缺点：容易使原生质体互相粘连、聚集，导致原生质体损坏；并且 难于定点观察监测单个原生质体的发育过程。
a
13
***沉降法：利用密度不同沉降速率不同的原理，低速离心使 原生质体沉于离心管底。此法方便，但不易除尽一些完整的 细胞或破碎的原生质体。 ***界面法利用原生质体和破碎细胞比重不同，低速离心条件 下完整的原生质体漂浮于密度不同的两相分界处，碎片留在 低层相中，可从两相界面收集到高纯度原生质体。

植物原生质体培养

植物原生质体培养

原生质体的培养1. 原生质体的分离与纯化原生质体培养的意义(1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。

原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。

在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。

营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。

(2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。

这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。

两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。

首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。

一、原生质体(protoplast)的分离（一）材料来源原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。

自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。

通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。

原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。

1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。

他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。

然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。

植物体细胞杂交技术方法

植物体细胞杂交技术方法
hu等介绍了微流控芯片的细胞电融合总结了微流控芯片的细胞电融合具有操控精准细胞配对和融合的效率高细胞活力高较低的样品污染焦耳热效应较小的优点同时详细讨论了微流控芯片电融合的一些重要参数与微流控芯片上的细胞分离和培养
植物体细胞杂交 技术方法
植物体细胞杂交是依据植物细胞全能性将细胞融 合技术和植物组织培养技术相结合而发展起来的一项 植物育种技术。植物体细胞杂交首先要将2种异源植物 体细胞除去细胞壁，制备出完整的有活力的原生质体 然后通过刺激使2种异源原生质体融合成具有生物活性 的杂种细胞，进而组织培养成杂种植株并进行优良性 状植株的选择与繁育。植物体细胞杂交包括一系列相 互依赖的步骤，即原生质体的制备、原生质体的融合 、杂种细胞的选择、杂种细胞的培养、由杂种愈伤组 织再生植株以及杂种或胞质杂种植株的鉴定等。
人们越来越关注健康，通过植物体细胞杂交获得的 抗病、抗虫与优良种质为减少农药使用，建立绿色优质 食品提供了广阔的发展前景。并且植物体细胞杂交育种 可以达到转基因育种的一些优良效果，而不会让人们有 对转基因食品一样的担心。植物体细胞杂交的潜力还需 要科研工作者继续开发与探索。
Guide us Write a ห้องสมุดไป่ตู้ew life
我国称猴桃育种工作者在实生选育工作中也做出了 辉煌的成绩.到目前为止，从自然野生群体及实生群体中 选育出了1 000多份优良品系，近100份通过品种审定， 部分品种已被广泛应用于生产，如“秦美”、“米粮1 号”、“徐香”、“金冠”、“魁蜜”、“金魁”等.近 年来，通过实生选种选育了一批具有优良性状的称猴桃 新品种，如“红阳”、“金桃”、“豫称猴桃2号’等 。
电融合法
电融合法是在20世纪80年代初由Zimerman等创造并发展起 来一种物理融合方法。由于电融合较之化学融合有操作简便、快 速、同步性好、可以大量试验、无毒害作用等特点，己经被大量 使用。20世纪90年代国内外还同时开展了空间电融合技术的研 究，试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术。但是，利用电 融合需要时间确定材料的最适融合条件，更主要的是电融合需要 昂贵的设备。2005年Olivaresruster等将电融合法与PEU融合法 结合起来作为一种新的方法一电气化学法，并使用此法成功得到 柑橘的体细胞杂种，且得到再生植株。同时表明电气化学融合是 一个可靠、可重复的方法，还能促进融合细胞的分裂，提高胚胎 发生率。

植物体细胞杂交技术的几点疑问解析

植物体细胞杂交技术的几点疑问解析

植物体细胞杂交技术的几点疑问解析展开全文植物体细胞杂交是指将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。

其过程主要包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养以及杂种植株的再生和鉴定等环节。

1植物体细胞杂交的原理植物体细胞杂交首先要使原生质体融合形成杂种细胞;其次要把杂种细胞经过植物组织培养技术培育成杂种植株。

细胞融合的原理是细胞膜具有一定的流动性，植物组织培养的原理是植物细胞的全能性。

因此，植物体细胞杂交的原理是：利用细胞膜具有一定的流动性和植物细胞的全能性进行育种。

2如何制备原生质体植物细胞外面坚硬的细胞壁是细胞融合的障碍，因此在体细胞杂交前必须除去细胞壁，获得具有活力的原生质体。

除去细胞壁早期的方法是机械法，即通过将材料置于高渗糖溶液中，使其发生质壁分离，当原生质体收缩成球状时，切开细胞壁释放出原生质体。

但由于这种方法费时、繁琐且不易获得完整的原生质体，目前已基本上被酶解法取代。

酶解法是用不同种类和浓度的酶处理植物细胞，将细胞壁解离，以获得原生质体的方法。

由于植物细胞壁的主要成分为纤维素、半纤维素、果胶等，所以酶解法去壁常用的酶主要有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等。

正常状态下，细胞壁对原生质体具有保护和支持作用。

但在制备原生质体时将细胞壁去除后，裸露的原生质体很可能由于其内外渗透压的不同而发生吸水胀破或失水皱缩。

因此，在酶液中必须加渗透稳定剂以保护原生质体的活力和质膜的稳定性。

此外，酶液的浓度为使细胞发生轻度的质壁分离为宜1。

3如何诱导原生质体融合诱导原生质体融合的方法有化学诱导和物理诱导两种。

化学法又可分为离子诱导融合法、高钙-高pH法、PEG（聚乙二醇）法等。

离子诱导融合法常用的盐类离子有硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、氯化钙等。

由于PEG法对原生质体毒性小、易操作、成本低、不需特殊设备，融合子产生的异核率较高，且融合过程不受物种限制。

因此，该方法在植物体细胞杂交中被广泛使用。

植物体细胞杂交

植物体细胞杂交

电融合法
电融合法是在20世纪80年代初由Zimerman等创造并发展起 来一种物理融合方法。由于电融合较之化学融合有操作简便、快 速、同步性好、可以大量试验、无毒害作用等特点，己经被大量 使用。20世纪90年代国内外还同时开展了空间电融合技术的研 究，试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术。但是，利用电 融合需要时间确定材料的最适融合条件，更主要的是电融合需要 昂贵的设备。2005年Olivaresruster等将电融合法与PEU融合法 结合起来作为一种新的方法一电气化学法，并使用此法成功得到 柑橘的体细胞杂种，且得到再生植株。同时表明电气化学融合是 一个可靠、可重复的方法，还能促进融合细胞的分裂，提高胚胎 发生率。
植物体细胞杂交的优势
植物有性杂交仅限于种内或是一些亲缘关系相近的 野生种与栽培种之间。像香蕉、甘薯、马铃薯等这些 植物有性生殖能力很低或不具备，便很难通过有性杂 交的方式来改良与培育新品种，严重限制了育种工作 的发展。而植物体细胞杂交技术不需要经过有性过程 ，只需通过体细胞的融合来制造杂种，这便打破了物 种间的生殖隔离，同时也克服了植物花期不遇与有性 杂交不亲和的状态，更为扩大遗传变异、更新种质资 源和改良作物品质开创了一条有效的途径。植物体细 胞杂交技术的出现与发展扩大了物种杂交的范围，提 高了育种效果，还可以缩短育种年限。
植物体细胞杂交技术
植物原生质体的分离方法有机械法和酶解法2种， 机械法是切割或磨碎质壁分离的细胞从而释放出原生 质体的方法，一般适用于像洋葱的鳞片、黄瓜的中皮层、 甜菜的根等具有较大的、高度液泡化的细胞。酶解法是 利用细胞壁降解酶分解植物细胞壁从而获得原生质体 的方法。当酶解法有副作用时，可以考虑使用机械法， 机械法可以避免酶制剂对原生质体的破坏作用曰。但 目前机械法基本被摒弃不用而通用酶解法。酶解法可 以有效分离出大量的植物原生质体，并且适用于几乎所 有的植物。但是酶制剂中往往含有一些核酸酶、蛋白 酶、过氧化物酶以及酚类物质，所以使用酶解法会对所 得原生质体的活力有一定影响。因此，使用酶解法分离 植物原生质体要注意根据不同植物种类、不同器官的不 同细胞壁结构与成分选择合适的酶类和酶浓度 。

植物原生质体分离和培养技术及制备

植物原生质体分离和培养技术及制备
碎片带 ➢ 优点：可以收集到数量 较大的纯净原生质体，
含原生 同时避免收集过程中原 质体带 生质体因相互挤压而破
碎。
不连续梯度法
植物原生质体的分离与培 养技术及制备
植物原生质体的分离与培 养技术及制备
植物原生质体的分离与培 养技术及制备
植物原生质体的分离与培 养技术及制备
原生质体鉴定
➢ 低渗爆破法 ➢ 荧光增白剂法(calcoflower white 0.1%)
液体浅层培养法
❖ 优点：
原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物 质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。 操作简单，对原生质体的损伤小，且易于 添加新鲜培养基和转移培养物。
❖ 缺点：
原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之
间的粘连现象而影响其进一步的生长和发
育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发
育情况。
植物原生质体的分离与培 养技术及制备
植物原生质体的分离与培 养技术及制备
酶
来源
生产厂家
纤维素酶类
Onozuka R-10 Cellulysin
绿色木霉 绿色木霉
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan
Calbiochem.,San Diego,CA 92037, USA
Driselase
Irpex lutens
Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo,Japan
植物原生质体的分离与培 养技术及制备
酶
来源
生产厂家
果胶酶类
Macerozyme R-10 根霉 Yakult Honsha Co. Ltd.,
Tokyo, Japan
Pectinase

植物体细胞杂交

植物体细胞杂交

电融合的基本过程：
细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶 液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不 是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极 化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列 成串； 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高 频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两 个紧密接触的细胞融合在一起并圆球化。
专一性
融合
生物膜的 流动性
融合可能的类型？ 怎样筛选杂种细胞？ 植物体细胞杂交成功的 标志是什么？ 杂交细胞的筛选 利用杂种细胞获得杂种 植株所依据的原理？ 获得的杂种植株是否能表 杂种植株的鉴定 现出人们所期望的性状？
融合的原生质体 AB 再生细胞壁 杂种细胞AB 脱分化 愈伤组织 再分化 杂种植株 植物 细胞 具全 能性
细胞电融合芯片
在细胞电融合研究向微芯片技术领域发展过程中，微电 极间距缩小到几十微米，而电融合中细胞排队（约100～ 700 V/cm）与电穿孔（约1～8 kV/cm）所需电场条 件基本不变。根据电场强度与加载电压的关系式E=V/d （E为电场强度，V为微电极两侧施加的电压，d为微电极 间距），如果电极间距d=1 mm，则排队电压需要10～ 70 V，击穿电压则高达100～800 V。如果电极间距缩 小到d=50μm，则排队电压需要0.5～2.5 V，击穿电压 只需要5～40 V。因此，当通过微加工工艺使微电极间距 缩小后，所需电压信号就会大大降低，使细胞电融合系统 成为可用电池供电的便携式系统。由此可见，融合芯片的 研究对细胞电融合微系统整体的实现有极其重要的意义， 将是该研究的一个重要内容，也是该系统发展成微全分析 系统（micro total analysis system,μ-TAS）的基 础。
体细胞杂交步骤：

植物细胞原生质体的制备与融合

植物细胞原生质体的制备与融合

植物细胞原生质体的制备与融合。

1、相关概念：（1）原生质体：是指那些已去除全部细胞壁的细胞。

细胞外仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定。

此外，在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体称为原生质球或球状体。

（2）原生质体融合：即体细胞杂交。

用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植株的整个过程。

若取材为体细胞，则成为体细胞杂交。

2、原生质体的制备：在植物组织里，原生质体被坚硬的细胞壁包裹着，而且由于果胶质等使细胞相互紧紧粘连在一起。

在愈伤组织中，这种粘连相对松些；在细胞悬浮培养物中，只有存在细胞团的情况下，有轻度的粘连。

如果破除这种粘连作用，即可使细胞分离开来，进一步去除细胞壁，就能使裸露的原生质体游离出来。

游离效率的高低主要与植物材料和酶混合浓的组成有关。

基本程序如下：取材→除菌→酶解（加酶、渗透压稳定剂）→原生质体的收集与纯化→洗涤→原生质体活力的测定。

（1）取材与除菌：原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。

但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣。

因为，由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。

常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。

对外植体的除菌要因材而异，悬浮培养细胞一般无需除菌。

对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗2-3次，然后浸入70%酒精消毒后，再放进3%次氯酸钠处理。

最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。

（2）酶解：现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。

①配制酶解反应液:反应液应是一种pH值在5.5-5.8的缓冲液，内含纤维素酶0.3%-3.0%以及渗透压稳定剂，细胞膜保护剂和表面活性剂等。

③酶解：除菌绿。

反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。

经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。

植物原生质体培养及细胞融合

植物原生质体培养及细胞融合

2．染色观察
• 取一滴0.02％的FDA液与一滴原生质体悬 浮液在载玻片上混匀，25E室温染色5～ 10min。用荧光显微镜观察，激发光波长 330～500nm，活的原生质体产生黄绿色 荧光。用计数器计算存活百分率。
(二)酚藏花红染色法
• 酚藏花红(phenosafranine)是一种碱性 染料，溶于水显红色并带黄色荧光，其 最大激发和射波长分别为527nm和588nm 。酚藏花红能被活的原生质体吸收而呈 红色，无活性的原生质体因无吸收能力 而五色。
(三)不连续梯度离心法
• 在离心管中首先放人不同浓度的Ficoll 溶液，构成不同的浓度梯度，在上部滴 人1～2ml酶一原生质体混合液，在150g 下离心5min，不同比重的原生质体漂浮 在不同的浓度梯度的界面上，用吸管收 集原生质体，悬浮洗涤备用。该方法的 优点是获得的原生质体大小均匀致，纯 度高；缺点是操作繁杂，原生质体的收 率低。
(五)分离方法 • 1．机械分离法 • 但由于该方法获得的原生质体产量低， 不能满足实验需要，而且液泡化程度低 的细胞不能采用该方法，因此，机械分 离法没有得到广泛应用。 • 2．酶分离法
• 1960年，德国诺丁汉大学的Cocking首先利用 纤维素酶从番茄幼苗根尖中分离获得原生质体 ，而且收率高、完整性好、活力强。经过数十 年的不断完善，目前酶分离法已成为植物原生 质体分离最有效的方法。 • 酶分离法又分为两步法和一步法。两步法是先 用果胶酶处理材料，游离出单细胞，然后再用 纤维素酶处理单细胞，分离出原生质体。其优 点是所获得的原生质体均匀一致、质量好。但 由于操作繁杂，目前已逐渐被淘汰。 • 一步法是将纤维素酶和果胶酶等配制成混合酶 溅处理材料，一步获得原生质体。因操作简便 ，目前几乎均采用该方法。
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第一节 植物原生质体的定义及特点




2、离体原生质体的特点（7点） 经离体的原生质体有如下几个特点： （1）能够完全分离，便于操作控制。 在悬浮液中完全分离，每个原生质体可看作一个纯粹 单细胞，易于定量操作和控制。 （2）原生质体的性能接近原细胞水平。 在RNA和蛋白质合成能力及光合活性与原组织中的 细胞水平接近。 （3）能再生胞壁、分裂增殖和再生完整植株。 （4）能同源或异源融合，为体细胞杂交材料。 在诱导条件下，发生同源或异源融合，形成聚核体或 杂核体。
第二节 植物原生质体培养的发展与意义

1、植物原生质体培养的发展简史 从高等植物中分离原生质体的研究最早是 Klercker在1892年进行的。当时他所用的主要是 “机械法”，即把细胞置于一种适当的质壁分离介 质中，然后用利刃切割。在这个过程中，有些质壁 分离的细胞只被切去了细胞壁，从而释放出完整的 原生质体。在某些贮藏组织中，如萝卜的根、黄瓜 的中皮层等，应用这个方法可从它们高度液泡化的 细胞中分离出原生质体。然而这个方法有明显的缺 点：一是产量很低；二是在由分生细胞和其他液泡 化程度不高的细胞中分离原生质体时不适用。
第十章 植物原生质体培养与体细 胞杂交
授课老师： 韦鹏霄
第十章 植物原生质体培养与体细胞杂交


第一节 植物原生质体的定义及特点
第二节 植物原生质体培养的发展与意义
第三节 植物原生质体培养方法
第四节 体细胞杂交
第一节 植物原生质体的定义及特点



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1、植物原生质体的定义 植物原生质体（plant protoplast）： 是指已脱除细胞壁的具有生活力的裸露的植物细 胞。 植物原生质体（protoplast）一词始用于 Hanstein（1880），是指“通过质壁分离，能够 和细胞壁分离的那部分细胞物质。”换言之，原生 质体就是除去全部细胞壁的“细胞”，或原生质膜 所包围的“裸露细胞”。 原生质体——是指由细胞壁质膜所包裹起来的一 个具有细胞原有的全部原生质及由它所构成的各种 细胞器的一个“整体或单位”。
第二节 植物原生质体培养的发展与意义


首先，用商品酶进行原生质体分离的是 （Takebe）等（1968）。他们在分离烟草叶肉原 生质体的程序中，依次使用上述两种酶。即先用离 析酶处理叶片小块，使之释放出单个细胞，然后再 以纤维素酶消化掉细胞壁，释放出原生质体。 Power和Cocking（1968）证实，这两种酶也 可以一起使用，这种“同时处理法”或“一步法” 比“顺序处理法”快，并且由于减少了步骤，也就 减少了微生物污染的机会。现在，多数研究都使用 这种简化的“一步法”。
第二节 植物原生质体培养的发展与意义

木本植物原生质体培养的进展也很迅速。科 学家们相继在柑桔（Vardi等，1982）、檀香 （Rao等，1984）、杨树（Russel和 Mocown，1988）、云杉（Attree等，1989） 等木本植物上获得成功。据统计，目前已从分 属49个科、160多个属的360多种植物的原生 质体培养中获得了再生植株，未获再生植株的 再生质体培养还有许多植物。
第一节 植物原生质体的定义及特点




（5）能摄取外来物质，可作遗传转化工具。 外来物质如核酸、蛋白质等高分子物质乃至病毒、 叶绿体、细胞核和细菌等，是进行遗传转化研究的 理想工具。 （6）变异为单细胞，变异性状易纯。 原生质体在培养中会发生变异，由于其是纯粹单 细胞，因此变异原生质体再生植株的变异性状会更 纯。 （7）易被破坏，便于内含物分离。 内含物如核酸、蛋白质，酶等高分子物质及胞核、 叶粒体、线粒体、液泡和膜等。
第二节 植物原生质体培养的发展与意义



原生质体的培养技术，近年来也有很大改进，特别 值得指出的是单个原生质体培养再生植株的成功 （Spangenberg等，1986）。 利用这一技术，可以在单细胞水平上研究不同类型原 生质体的生理特性，相互之间的作用以及单个原生质体 的遗传操作。对不同亲本单个原生质体进行融合的研究 也是有利的（Schweigo等，1987）。 饲养层培养法可大大提高水稻（Kyozu等，1987）、 玉米（Rhodes等，1988）等作物原生质体的植板率。 已有不少报道说明，琼脂糖能促进原生质体的分裂 （Shillto等，1983），并有利于对原生质体生长过程 的观察。
第二节 植物原生质体培养的发展与意义

2、植物原生质体培养的意义
（1）植物原生质体培养用于作物改良 在作物改良上，常规育种至今还起着重要的作用。 但常规育种有一定的局限性。通过原生质体融合后 再生的杂种植株，可以克服远缘杂交中的不亲和性 和子代不育等常规远缘杂交所难以克服的障碍。也 有实验说明，通过体细胞杂交能转移在作物杂交育 种上十分有价值的细胞质雄性核不育基因。这些都 给农作物的改良带来了新的方法和希望。
第二节 植物原生质体培养的发展与意义

1960年，Cocking证实了用“酶解法”由高 等植物细胞中大量分离原生质体的可能性。他 使用了一种由疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria）培养物制备的高浓度的纤维素酶 溶液以降解细胞壁，然而进一步的研究只是到 了有商品酶供应之后才成为可能。自从1968年 纤维素酶和离析酶投入市场后，植物原生质体 培养才变成了一个热门的研究领域。
第二节 植物原生质体培养的发展与意义


1971年，Takebe首次利用烟草叶片分离原生质体， 并获得了再生植株。以后，随着各种商品酶的出现，植 物原生质体培养取得了突飞猛进的发展。在作物上，如 大豆（Wei和Xu,1988）、棉花（陈志贤等，1989） 油菜（Spangenberg等，1986）等重要经济作用已 成功地从原生质体再生成植株。 特别是一直认为难以培养的禾谷类作物，例如，水 稻（Fujimura等，1985）、玉米（蔡起贵等，1987； Rhodes等，1988）、小麦（Harris等，1988；王海 波等，1989）、谷子（夏镇澳等，1989），以及高粱 的原生质体培养都已相继成功。