抗坏血酸过氧化物酶(ascorbateperoxidase ,APX)活性测定试剂盒 使用说明

抗氧化物活性测定方法总结抗氧化物活性测定方法是通过对样品中的抗氧化物质含量和抗氧化活性进行定量分析，评估其对自由基的清除能力和抗氧化能力。

随着抗氧化研究的不断深入，测定方法也逐渐完善。

以下是对常见的抗氧化物活性测定方法的总结。

1. ORAC法（氧化应激反应活性测定法）：该方法通过测定样品清除自由基的能力来评估其抗氧化活性。

实验中，将样品与荧光试剂（如2,2'-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile)）共同作用，观察其清除自由基的能力，并通过建立标准曲线计算样品的ORAC值。

2.DPPH法（1,1-二苯基-2-苦味基-苦味酸磷）：该方法是一种常用的快速测定抗氧化活性的方法。

实验中，将样品与DPPH稳定自由基共同作用，通过比色反应观察DPPH自由基被样品清除的程度，从而评估抗氧化活性。

3.ABTS法（2,2'-联氮双5-苯砜酸）：该方法通过ABTS离子自由基的生成和清除反应来测定样品的抗氧化活性。

实验中，ABTS与过氧化氢反应生成ABTS离子自由基，通过观察样品对其的清除能力来评估抗氧化活性。

4.FRAP法（亚铁离子还原能力）：该方法基于样品对人造抗坏血酸（Fe3+）的还原能力，通过测量还原后的Fe2+离子的生成量来评估抗氧化活性。

实验中，将样品与Fe3+离子反应生成Fe2+离子，通过比色反应来测定Fe2+的含量。

5. 碘标法（Iodine value）：该方法用于测定油脂、脂肪等样品的抗氧化活性。

实验中，将已知量的碘与样品中的不饱和化合物反应，在光反应下观察反应终点的颜色变化，并根据标准曲线计算样品的抗氧化活性。

6. 硝酸盐法（Nitrite method）：该方法用于测定样品中亚硝酸盐的含量，从而评估其抗氧化活性。

实验中，样品经过还原反应生成亚硝酸盐，然后与DANO（N-乙基-N-（2-苯基乙基）-对硝基苯胺）反应生成稳定的偶氮染料，通过比色测定反应终点的吸光度来计算样品中亚硝酸盐的含量。

过氧化物酶活性测定
过氧化物酶（peroxidase）是一类广泛存在于各种生物中的酶。

它们能够催化过氧化物与底物之间的氧化还原反应。

此类酶有多种生物功能，其中最重要的是用于废弃物的代谢和细胞保护。

在工业和农业领域中，过氧化物酶也常被用作催化剂。

因此，对于过氧化物酶的活性测定十分重要。

传统的过氧化物酶活性测定方法主要包括光谱分析法、吸光度法、滴定法、电化学法等。

今天我们主要介绍光谱分析法的原理和步骤。

过氧化物酶在酸性pH下的催化活性主要是由其含有的含铁金属离子（Fe3+）决定的。

Fe3+构成的氧桥结构能够与底物发生氧化还原反应，同时产生吸收峰。

因此，利用曲线拟合的方法可以测定样品中过氧化物酶的活性。

具体操作步骤如下：
1. 处理样品。

将待测样品加入一定比例的磷酸盐缓冲液（pH 5.0）。

若含有颜色物质需添加过滤效果的吸附剂。

2. 加入反应液。

向样品中加入过氧化氢，使其浓度为0.1%。

3. 反应后读取吸收度。

反应结束后，利用紫外-可见光谱仪读取其吸收值。

4. 分析数据。

根据吸收峰的强度和波长，利用标准曲线计算出过氧化物酶的活性。

总之，过氧化物酶活性的测定对于研究生物学和工业化学等领域都具有重要的意义。

随着科学技术的不断发展，相信在未来，这一领域的研究也将不断深入，为我们带来更多的新发现和应用。

香蕉抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆及表达分析作者：王卓徐碧玉贾彩红李健平来源：《热带农业科学》2015年第12期摘要抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase， APX）是植物重要的过氧化氢（Hydrogen peroxide， H2O2）清除酶之一。

通过RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）方法从香蕉根系cDNA均一化全长文库中获得一个抗坏血酸过氧化物酶基因，命名为MaAPX2基因。

MaAPX2基因是香蕉APX基因编码框全长cDNA，包含一个750 bp的最大开放阅读框（Open Reading Frame， ORF），编码249个氨基酸的蛋白质。

蛋白质序列结构域比对发现，在MaAPX2 N端具有典型的APX活性位点（APLMLPLAWHSA）和过氧化物酶近端血红素配体序列（DIVALSGGHTL）的保守结构域，属于典型的APX蛋白。

系统进化树比对分析表明，MaAPX2与马蹄莲ZaAPX（AAC08576.1）的亲缘关系较近。

组织特异性研究表明，MaAPX2基因组成型表达于香蕉各个组织，在叶片中表达量最大。

在耐病和感病品种中，MaAPX2基因均上调表达，但在耐病品种中MaAPX2基因在所有时间点相对于对照增加的倍数均高于感病品种，表明该基因在香蕉的抗病性中起着重要作用。

MaAPX2基因可以作为一个新的响应枯萎病侵染的标记基因。

关键词香蕉；抗坏血酸过氧化物酶；基因克隆；表达分析分类号 S668.1Molecular Cloning and Expression of Ascorbate Peroxidase Genefrom Banana（Musa acuminata L. AAA group，cv. Cavendish）WANG Zhuo1） XU Biyu1） JIA Caihong1） LI Jianping1）LIU Juhua1） ZHANG Jianbing1） MIAO Hongxia1） JIN Zhiqiang1，2）（1 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China；2 Haikou Experimental Station， CATAS， Haikou， Hainan 570102 China）Abstract Ascorbate peroxidase （APX） is one of the key enzymes of hydrogen peroxide scavenging in plants. In this study，we reported the molecular characteristics of APX gene cloned from banana （Musa acuminata L. AAA group，cv. Cavendish） using a RACE-PCR-based strategy. MaAPX2 contained an open reading frame （ORF） of 750 bp which encoded a polypeptide of 249amino acids. Protein alignment showed that MaAPX2 contain the complete typical conserved APX active-site signature and proximal heme-ligand motif， which belongs to a typical APX protein. Phylogenetic analysis showed that the deduced amino acid sequences of MaAPX2 also have high similarity to ZaAPX （AAC08576.1） from Zantedeschia aethiopica. Tissue-specific studies showed that the expression of MaAPX2 was constitutively expressed in various tissues of banana seedling. In resistant and susceptible varieties of banana after inoculation Foc TR4， the expression of MaAPX2 was decreased. While in resistant varieties the time point of MaAPX2， compared to control，increased higher than that in susceptible varieties at time points，indicated that this gene played an important role in banana resistance. MaAPX2 could be a new marker gene in banana seedling under the infection of Foc TR4.Keywords banana ； ascorbate peroxidase ； gene clone ； expression analysis在正常生理活动时，活性氧（Reactive oxygen species， ROS）含量处于一定的动态平衡。

超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化物酶概述说明1. 引言1.1 概述：在细胞内，氧化还原反应是生物体正常代谢过程中不可或缺的部分。

然而，在这些氧化还原反应中产生的活性氧种（ROS）却可能对细胞结构和功能造成损害。

为了保护细胞免受活性氧物质的侵害，细胞内存在着一系列抗氧化酶系统。

其中包括超氧化物歧化酶（SOD），抗坏血酸过氧化物酶（APX）和过氧化物酶（POD）。

这些抗氧化酶通过催化活性氧的转化和清除，起到维持细胞内稳态、减少氧自由基对生物体的伤害的重要作用。

1.2 文章结构：本文将分为五个部分来探讨超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化物酶的定义、功能、结构、机制以及其在生理作用和临床意义方面的研究。

在第二部分，我们将详细介绍超氧化物歧化酶。

首先，我们将解释其定义和功能，包括其在生物体内的重要作用。

然后，我们将探讨其结构和催化机制，揭示超氧化物歧化酶如何通过催化超氧阴离子（O2.-）的转化来清除活性氧物质。

第三部分将聚焦于抗坏血酸过氧化物酶。

我们将解释该酶的定义和功能，并探究它在细胞中是如何通过消除过氧化氢（H2O2）来保护细胞免受氧自由基的损伤。

第四部分将涵盖过氧化物酶。

我们将描述该酶的定义、功能和结构，并讨论其通过催化有机底物或无机底物的转变来减少细胞内活性氧物质积累的机制。

最后，在第五部分结论中，我们将总结本文提到的要点，并展望未来对这些抗氧化酶系统研究的方向。

1.3 目的：本文旨在增进读者对超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化物酶这些重要抗氧化酶系统的认识。

通过了解它们的定义、功能、结构和机制，以及在生理作用和临床意义方面的研究进展，我们可以更好地理解细胞对抗活性氧物质的保护机制，并为未来的研究提供一定的指导和启示。

2. 超氧化物歧化酶:2.1 定义和功能:超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD）是一种重要的抗氧化酶，它参与细胞内超氧阴离子（O2-）的清除，以保护细胞免受过氧化损伤。

未知驱动探索，专注成就专业
抗坏血酸过氧化物酶
抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）是
一种重要的氧化酶，负责在植物体内催化抗坏血酸（维生
素C）与过氧化氢之间的氧化还原反应。

该酶可以将有害的过氧化氢转化为水和氧气，起到清除细胞内部过氧化氢的
作用。

抗坏血酸过氧化物酶广泛存在于植物体内，尤其在叶片和
根部等活跃代谢组织中含量较高。

它是维持植物细胞内氧
化还原平衡的关键酶之一。

在植物遭受各种逆境胁迫时，
如高温、干旱、盐碱等，会导致植物体内产生过量的过氧
化氢，进而引发氧化应激反应。

抗坏血酸过氧化物酶的活
性会得到显著增强，从而帮助植物对抗逆境胁迫。

此外，抗坏血酸过氧化物酶还参与植物生长和发育的调控。

研究发现，抗坏血酸过氧化物酶的缺失或突变会导致植物
叶片发生病斑、失绿、畸形生长等异常现象，甚至影响到
植物的种子萌发和幼苗生长。

因此，抗坏血酸过氧化物酶
在植物生理生化过程中具有重要的功能和调控作用。

1。

抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。

此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。

因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。

2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。

反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。

每个处理设3 个重复。

（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。

用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。

取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 220mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。

抗坏血酸过氧化物酶简介抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate Peroxidase，APX）是一种存在于植物组织中的重要酶类，主要参与抗氧化反应。

它是抗氧化系统中的关键酶之一，通过催化还原型抗坏血酸（维生素C，Ascorbate）与过氧化氢（H2O2）之间的反应，起到抗氧化保护细胞的作用。

结构和特点抗坏血酸过氧化物酶是一种二聚体酶，由两个相同或相似的亚基组成。

每个亚基都包含一个铁离子，这个铁离子嵌入在酶的催化中心中，起到催化反应的关键作用。

抗坏血酸过氧化物酶的活性中心由一个高度保守的四个氨基酸残基组成，分别是组氨酸（His），赖氨酸（Arg），维氨酸（Trp），以及两个半胱氨酸（Cys），这些氨基酸残基通过配位到铁离子上形成催化中心。

催化机制抗坏血酸过氧化物酶的催化过程包括两个连续的步骤：1.还原步骤：还原型抗坏血酸通过供体氧化过程被氧化为脱氢抗坏血酸。

这个过程中，活性中心的铁离子接受还原型抗坏血酸的氢原子，并同时失去一个电子形成五价铁，还原型抗坏血酸则被氧化为脱氢抗坏血酸。

2.氧化步骤：将过氧化氢与脱氢抗坏血酸反应生成水和抗坏血酸。

在这一步骤中，五价铁复原为二价铁，并将过氧化氢还原为水。

这两个步骤交替进行，完成抗坏血酸和过氧化氢之间的催化反应。

生理功能抗坏血酸过氧化物酶在植物的抗氧化防御系统中发挥着重要的作用。

它通过催化还原型抗坏血酸与过氧化氢之间的反应，将有害的过氧化物转化为无害的物质，起到保护细胞免受过氧化物伤害的作用。

此外，抗坏血酸过氧化物酶还参与调节细胞内抗氧化系统的平衡。

当细胞受到外界胁迫或环境压力时，抗坏血酸过氧化物酶的活性会上调，以增加细胞对抗氧化应激的能力。

应用价值抗坏血酸过氧化物酶广泛应用于生物学和农业领域。

在生物学研究中，抗坏血酸过氧化物酶是测定细胞抗氧化能力的重要指标之一。

通过测定抗坏血酸过氧化物酶的活性，可以评估细胞对氧化应激的抵抗能力。

在农业方面，抗坏血酸过氧化物酶的研究对提高作物的抗逆能力具有重要意义。

A P X测定方法(总1页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除APX1. 酶液制备取植物叶片剪碎，按1∶3（W/V）加入预冷的50mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液进行研磨提取，用2层纱布过滤，滤液离心（4000×g）10min，上清液作酶粗提液供测定。

2. 酶活性测定 3ml反应混合液中含50mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液（），L EDTA-Na2，L AsA，L H2O2和酶液。

加入H2O2后立即在20℃下测定10～30秒内的A290变化，计算单位时间内AsA减少量及酶活性。

抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX，EC ）参考Jiang和Zhang （2001，2002）的方法，取约克材料置液氮中研磨成粉。

6mL提取液（50 mmol L-1 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液pH ，1 mmol L-1 EDTA，1 mmol L-1 抗坏血酸（AsA）（保持酶的稳定），1％（W/V）不溶性聚乙烯吡咯烷酮）中研磨成匀浆。

匀浆经4℃，12000×g条件下离心6分钟，取上清液在4℃，26900×g条件下再离心15分钟。

取上清液进行酶活性测定。

或液氮冷却后存于－80℃。

参照Nakano和Asada（1981），Knorzer等（1996）的方法，利用APX在H2O2存在的条件下使抗坏血酸量减少的原理测定酶活性。

测定酶活性时，取约含50 μg蛋白的酶提取液加入1 mL酶反应液（50mmolL-1 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液，pH ，含1 mmol L-1 抗坏血酸和 mmol L-1 H2O2）中，充分混匀。

紫外－可见分光光度计上读取290 nm处吸光光度值在3分钟内每15秒中的变化。

计算每分钟内每毫克蛋白转化的抗坏血酸量(摩尔消光系数为 L mmol-1cm-1)，用以表示酶活性的大小，单位为μmol AsA min-1 mg-1蛋白。

植物抗坏血酸的合成和代谢以及相关酶基因的调控邹礼平* ,陈锦华孝感学院生命科学技术学院,湖北孝感432000Biosynthesis and Metabolism of Ascorbic Acid and Regulation of Related Genes in PlantsZOU Li-Ping*,CHEN Jin-HuaCollege of Life Science and Technology,Xiaogan University,Xiaogan,Hubei432000,China提要:本文对植物抗坏血酸的生物合成与代谢途径以及相关酶基因调控的研究进展作介绍。

关键词:抗坏血酸;生物合成与代谢;基因调控抗坏血酸(ascorbic acid, AsA)即维生素C (Vc), 在生物体中具有重要的代谢功能和抗氧化作用。

抗坏血酸是人类和动物维持生长、繁殖和保证健康所必需的营养物质, 抗坏血酸缺乏会导致坏血病。

一般来说, 抗坏血酸与植物的抗逆性呈正相关, 植物细胞内的抗坏血酸的含量增加, 植物耐炎热、寒冷和盐碱环境等逆境的能力即增强。

抗坏血酸还与植物细胞的分裂、伸长和植株生长有关。

植物、微生物和大多数动物体内可自行合成抗坏血酸, 但人类自身则已丧失合成能力, 必须从食物中摄取。

因此, 研究植物中抗坏血酸的生物合成与代谢途径, 克隆相关的酶基因, 了解其表达调控机制, 将有利于通过生物技术的方法改良植物, 提高抗坏血酸的含量, 这对于增加植物产品的营养品质和增强植物本身抗逆性, 都有重要意义。

本文介绍植物抗坏血酸生物合成与代谢途径及相关酶基因调控研究的进展。

1 抗坏血酸的生物合成植物和动物抗坏血酸生物合成途径是有差异的。

在动物中, 从D - 葡萄糖经D - 葡萄醛酸、L- 古洛糖酸和L- 古洛糖酸-1,4- 内酯的己糖醛酸途径合成L-抗坏血酸最早是在大鼠上报道的, 放射性示踪研究表明这条途径涉及碳链倒位。

文章编号：2095－6835（2022）12－0175－04邻近标记技术APEX2的发展与应用罗思，丁明（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京211198）摘要：工程抗坏血酸过氧化物酶（The Engineered Ascorbate Peroxidase，APEX2）是一种能够有效地应用于研究活细胞内蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。

与其他传统的蛋白质互作研究方法相比，APEX2技术不仅可以允许靶向和邻近依赖性标记蛋白质，并且实现了亚细胞室的蛋白质组学定位以及动态蛋白质复合物的识别，现已成为蛋白质组学分析的一种新方法。

主要总结了APEX2的技术发展及其在不同类型的蛋白质组的应用。

关键词：APEX；APEX2；生物素化；蛋白质相互作用中图分类号：Q816文献标志码：A DOI：10.15913/ki.kjycx.2022.12.053研究活细胞细胞器和亚细胞区域的蛋白质组有助于理解细胞中组织和蛋白质相互作用网络，因此兴起了许多方法。

基于邻近标记的方法结合质谱（MS）的蛋白质组的系统分析为研究蛋白质的相互作用提供了一种高通量的方法。

近年来，研究蛋白质相互作用的邻近依赖标记技术也取得了很大发展。

目前用于邻近标记技术的酶主要有3种：辣根过氧化物酶（HRP）、邻近依赖的生物素鉴定（BioID）和工程抗坏血酸过氧化物酶（APEX）。

虽然第一个基于生物素邻近标记的研究是利用HRP和芳基叠氮生物素做底物进行的[1]，但是HRP在哺乳动物细胞质中并不活跃。

在细胞质的还原环境中，HRP的4个二硫键和2个Ca2+离子结合位点会被破坏，不能稳定维持自身结构[2]。

这一缺陷限制了其在细胞内相互作用方面的使用，因此HRP逐渐退出蛋白质相互作用研究的舞台。

基于BioID的邻近标记采用了来自大肠杆菌的生物素连接酶BirA的突变形式，利用质谱检测BirA修饰生物素化蛋白，可以鉴定出与感兴趣蛋白相互作用的微弱或者短暂的蛋白质，目前这种技术已成功用于天然环境中相互作用伙伴的生化筛选[3-5]。

植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制、酶学及分子特性一、本文概述植物抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate Peroxidase，AP）是一种在植物细胞内广泛存在的关键酶，其在植物抗氧化防御系统中发挥着至关重要的作用。

本文旨在全面探讨植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制、酶学特性以及分子特性，以期为深入理解植物抗氧化防御系统的运行规律，以及提高植物抗逆性和农业生产力提供理论基础。

我们将详细介绍抗坏血酸过氧化物酶的生化功能，包括其催化抗坏血酸清除活性氧的能力及其在细胞氧化还原稳态中的作用。

接着，我们将深入探讨抗坏血酸过氧化物酶的酶学性质，如酶的动力学特性、抑制剂和激活剂的影响等。

我们将对抗坏血酸过氧化物酶的分子特性进行阐述，包括其基因结构、表达调控以及蛋白质结构等方面的研究。

通过本文的综述，我们期望能够为植物生物学、农业生物技术以及植物抗逆性研究等领域提供有益的参考和启示。

二、植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制植物抗坏血酸过氧化物酶（AP）是一种关键的抗氧化酶，主要作用是清除植物细胞中的过氧化氢（H2O2），以防止氧化应激对细胞造成的损伤。

AP的作用机制主要涉及到酶的催化活性以及其与底物的相互作用。

在AP的催化过程中，抗坏血酸（AsA）作为还原剂，将H2O2还原为水（H2O），而自身则被氧化为单脱氢抗坏血酸（DHA）。

这个过程可以表示为：2AsA + H2O2 → 2DHA + 2H2O。

DHA随后通过抗坏血酸再生系统被还原回AsA，从而维持了AP的催化循环。

AP的作用机制还涉及到其在细胞内的定位。

在植物细胞中，AP 主要分布在叶绿体、细胞质和线粒体等细胞器中。

这些细胞器中的AP通过特定的信号肽序列被定位到相应的位置，从而实现了对特定区域H2O2的高效清除。

AP的活性还受到多种因素的调节，包括光照、温度、pH值以及底物和抑制剂的浓度等。

光照和温度可以影响AP的稳定性和活性，而pH值则可以影响AP与底物的结合能力。

抗坏血酸过氧化物酶测定方法一、目的要求学习果蔬组织中抗坏血酸过氧化物酶活性的测定原理和方法。

二、基本原理抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX；AsA-POD）是以抗坏血酸为电子供体的专一性强的过氧化物酶。

APX能催化抗坏血酸与H2O2反应而被氧化形成单脱氢抗坏血酸。

随着抗坏血酸被氧化，溶液在波长290 nm处的吸光度值下降，根据单位时间内吸光度值的减少，可以计算出APX活性。

三、材料、仪器及试剂（一）材料梨、桃、番茄等。

（二）仪器及用具高速冷冻离心机、紫外分光光度计、研钵、试管、计时器、容量瓶（100 mL、200 mL、1 000 mL）、电子天平。

（三）试剂：1．100 mmol/L、pH 7.5磷酸钾（K2HPO4-KH2PO4）缓冲液母液A（1 mol/L K2HPO4）：称取174.18 g磷酸氢二钾，用蒸馏水溶解、定容至1 000 mL。

母液B（1 mol/L KH2PO4）：称取136.09 g磷酸二氢钾，用蒸馏水溶解、定容至1 000 mL。

取83.4 mL母液A和16.6 mL母液B，混合，调节pH值至7.5，稀释、定容至1 000 mL。

2．提取缓冲液（含0.1 mmol/L EDTA、1 mmol/L抗坏血酸和2% PVPP）称取2.9 mg EDTA，17.6 mg抗坏血酸和2 g PVPP，用100 mmol/L、pH7.5磷酸钾缓冲液溶解、定容至100 mL。

4℃预冷保存。

3．反应缓冲液（含0.1 mmol/L EDTA和0.5 mmol/L抗坏血酸）称取2.9 mg EDTA和8.8 mg抗坏血酸，用50 mmol/L、pH7.5磷酸钾缓冲液溶解、定容至100 mL。

4℃预冷保存。

4．2 mmol/L H2O2取1.14 mL 30% H2O2，用蒸馏水稀释至100 mL，混匀，即得200 mmol/L H2O2溶液。

再取1.0 mL该溶液，稀释至100 mL，即为2 mmol/L H2O2溶液。

抗氧化酶活⼒测定⽅法sun20200516植物组织抗氧化酶活的测定⽅法（修订版2020年5⽉7⽇）⼀、待测样品预处理称取鲜样0.5g于预冷的研钵（提前放冰箱）中，加1mL预冷的磷酸缓冲液（0.05mol/L，pH=7.8），冰浴研磨后再加1mL缓冲液，倒⼊离⼼管中，再⽤2mL缓冲液清洗研钵，倒⼊离⼼管中，平衡，低温（0-4℃）离⼼20min（10500rpm），收集上清液，冷藏保存。

磷酸缓冲液配制：A液（0.2mol/L磷酸氢⼆钠溶液）的配制：称取Na2HPO4·2H2O 35.61g 或Na2HPO4·7H2O 53.65g 或Na2HPO4·12H2O 71.64g ⽤蒸馏⽔定容⾄1000mL。

B液（0.2mol/L磷酸⼆氢钠溶液）的配制：称取NaH2PO4·H2O 27.6g 或NaH2PO4·2H2O 31.21g ⽤蒸馏⽔定容⾄1000mL。

磷酸缓冲液（0.05mol/L，pH=7.8）配制：45.75mL A+ 4.25mL B定容⾄200mL。

磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH=7.0）配制：61mL A+39mL B定容⾄200mL。

磷酸缓冲液（100 mmol/L、pH 7.5）配制：84mL A+16mL B定容⾄200mL。

磷酸缓冲液（50 mmol/L、pH7.5 ）配制：42mL A+8mL B定容⾄200mL。

⼆、SOD（超氧化物歧化酶）活⼒测定——氮蓝四唑（NBT）法1.1原理超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)普遍存在于动?植物体内，是⼀种清除超氧阴离⼦⾃由基的酶，它催化下列反应：。

本反应产物H2O2可由过氧化氢酶进⼀步分解或被过氧化物酶利⽤。

本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作⽤来确定酶活性⼤⼩。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化⽽产⽣超氧阴离⼦⾃由基，超氧阴离⼦⾃由基可将氮蓝四唑还原为蓝⾊的甲腙，后者在560nm处有最⼤吸收。

茶树鲜叶抗坏血酸过氧化物酶活性的变化规律及测定方法孙云1,2江春柳1,2赖钟雄1,2*邵巍1王秀英1,21福建农林大学园艺植物生物工程研究所福州3500022福建农林大学园艺学院福州350002摘要探讨茶树鲜叶抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定条件，分析不同茶树品种以及茶树鲜叶不同叶位APX 活性的变化。

结果表明：聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)加入量约为鲜叶重的1.5倍，酶提取液pH 为7.8，反应液pH 为7.0，抗坏血酸(AsA)浓度为0.50mmol/L 时茶树鲜叶APX 活性最高；茶树鲜叶APX 活性随冷藏时间的延长呈下降趋势；福建7个主要茶树品种以福鼎大白茶的APX 活性最高，铁观音的APX 活性最低；茶树鲜叶不同叶位APX 活性变化趋势为：芽>第一叶>第二叶>第三叶>老叶>嫩茎。

关键词茶树鲜叶抗坏血酸过氧化物酶（APX ）酶活性测定方法中图分类号S571.1抗坏血酸过氧化物酶（APX ）也称维生素C 过氧化物酶，是植物细胞中防御外界氧化胁迫和植物本身活性氧代谢的重要抗氧化酶类，在降低H 2O 2对植物细胞产生氧化损伤方面起关键作用。

要使APX 发挥正常的催化功能，及时清除H 2O 2维持叶绿体正常的功能，必须有抗坏血酸（AsA ）存在。

AsA 既是催化反应的还原剂，又是APX 活性的稳定剂[1]。

但AsA 在人体组织内不能自行合成，只能从体外获得[2]。

茶叶中的维生素含量高，种类多，饮用绿茶对人体补充AsA 的作用很大，但AsA 在茶叶加工和储存过程中容易大量损失。

自1976年APX 的发现至今30多年来，前人对APX 的酶学特性、分布、定位、作用机制、生理功能及分子生物学特征等方面作了不少研究，Chen 等[3,4]根据茶叶cDNA 推断出cAPX 的整个氨基酸序列，从茶叶中亦得到了sAPX 。

但对APX 活性测定方法的研究还比较少。

本文探讨了不同因素对茶树鲜叶APX 活性的影响，建立了茶叶APX 活性的测定方法，并利用此方法分析了冷藏条件下以及不同茶树品种、鲜叶不同叶位APX 活性的变化规律。

植物抗坏血酸过氧化物酶的概况摘要：抗坏血酸过氧化物酶（aseorbateperoxidase，APX)是植物活性氧代谢中重要的抗氧化酶之一，本文以植物抗坏血酸过氧化物酶的机理，应用等方面对其进行阐述。

关键字：植物抗坏血酸过氧化物酶；机理；应用1 APX的简介抗坏血酸过氧化物酶（aseorbateperoxidase，APX)是植物活性氧代谢中重要的抗氧化酶之一，尤其是叶绿体中清除H2O2的关键酶，又是维生素C代谢的主要酶类。

H2O2是植物叶绿体中光合电子传递链和某些酶反应的天然产物，是具有毒害作用的活性氧[4]。

2 植物中的APXAPX是一种亚铁血红素蛋白，植物的APX存在着多种同工酶，且位于细胞中不同区域。

一种为位于叶绿体中并分解叶绿体中的H2O2的叶绿体型同工酶;另一种为位于叶绿体之外的其它细胞组分的细胞质型同工酶[1]。

这两种同工酶具有共同的特点，但也有不同的方面:①胞质型同工酶APX 占总APX的40%以上；②叶绿体型APX对AsA的专一性比胞质型APX更强；③在不含AsA的介质中，叶绿体型同工酶比细胞质型同工酶更快丧失活性；④叶绿体型同工酶对琉基试剂和经基脉、对氨基苯酚等抑制剂较胞质型同工酶更为敏感；⑤二者的分子量不同[2]。

3 植物APX的机理植物因在光合作用时会释放大量的氧气，故植物会受到被严重氧化的危险。

提高植物体内氧自由基代谢途径中的酶活力,可以增强植物抵御氧化的能力,从而增强植物耐逆能力。

AsA可直接与活性氧反应而将其还原，又可作为酶的底物在活性氧的清除过程中起作用，即在叶绿体类囊体表面作为还原剂参与APX介导的H2O2的清除。

在这一过程中，AsA氧化成MDA。

叶绿体中APX发挥正常的催化作用[6]。

APX是以抗坏血酸(AsA)为电子供体的一种过氧化物酶，是植物体内尤其是叶绿体中清除H2O2的关键酶[1]。

APX催化H2O2还原的化学反应如下:2抗坏血酸(AsA）+H2O2→2单脱氢抗坏血酸(MAD)+H2O产生的单脱氢抗坏血酸可通过不同的途径被还原。

抗坏血酸过氧化物酶（ascorbateperoxidase ，APX）活性测定试剂盒使用说明微量法100T/96S产品简介：APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。

APX 具有多种同功酶，分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体，以及过氧化体和类囊体膜上。

APX 催化H 2O 2氧化AsA，是植物AsA 的主要消耗者。

APX 的活性直接影响到AsA的含量，在胁迫和解胁迫条件下，APX 与AsA 具有一定的负相关性。

APX 催化H 2O 2氧化AsA，通过测定AsA 的氧化速率，可计算得APX 活性。

试验中所需的仪器和试剂：低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。

产品内容：试剂一：液体×2瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。

临用前加3mL 蒸馏水充分溶解。

试剂三：液体×1支，4℃保存。

操作步骤：一、粗酶液提取：称取约0.1g 样品，加1mL 试剂一，冰上充分研磨，13000g 4℃离心20min，取上清液。

二、测定操作表：1.分光光度计预热30min 以上，调节波长到265nm，用蒸馏水调零。

2.试剂一在25℃中预热30min 以上。

3.空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20µL 蒸馏水、140µL 预热的试剂一、20µL试剂二和20µL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收。

4.测定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20µL上清液、140µL预热的试剂一、20µL试剂二和20µL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收。

APX活力计算：a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下（1）按蛋白浓度计算活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化1µmol AsA为1U。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四瞠光化还原法）1、试剂得配制（1）0、05mol/L 磷酸缓冲液（PBS,pH7、8）:A 母液:0、2mol/L 磷酸氢二钠溶液：取 Na2HPO4- 12H2O（分子量 358、14）71.7g;B母液:0、2mol/L磷酸二氢钠溶液:取NaH^POQHO分子量156、01）31.2g。

分别用蒸馅水左容到1000ml。

0、05mol/L PBS（pH7、8）得配制:分别取 A 母液（Na2HPO4） 228,75ml,B 母液（NaH2PO4）21、 25ml,用蒸餾水左容至lOOOmL 1\ 1佟PVP（宗W毗.；「.丨参考文献:李合生主编:植物生理生化实验原理与技术、髙等教育出版社,2000:267〜268。

（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液:取1、39典Met用磷酸缓冲液（pH7、8）定容至lOOmL网h 说定容到100ML我也不懂。

拜托（3）100 11 mol/L EDTA-Na：冷m（）3721g EDTA—Nw . 000ml；（4）100H M核黄素溶液:取0、0075g核黄素用:定容至100ml,避光保存，门汀汁.丨稀释10倍（5）750 i* mol/L気伽喙NBT）溶液霹取O.O6133g NBT川缓冲液定容至UJOml避光保存；酶液制备:収定沈叶Mi物叶川视禹耍从丿；门脉）（）巡J厲冷彳抑：.2ml磷內冲液在冰浴卜研磨成浆，加缓冲液使终体枳为10ml.取5ml于10000r/min I、•离心lOmin. hin 液即为SOD粗提液。

提取酶液时如何保存;如果没有测完得需要放在4匸得冰卷叽2、酶活性测定2.显色反应取试管（要求透明度好）5支,3支为样品测左管,1支为对照管，另外1支作为空白，按表39-1加入各溶液。

混匀后将空白管置暗处，其它各管于40001X H光灯下反应20min（要求各管受光情况一致, 反应室得温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。

叶绿体的提取一、试剂配置1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl （0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）;2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；实际配制：PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液2000g 3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min左右完成；4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物；5、用1ml悬浮液（50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。